火木层孔菌中麦角甾酮在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的麦角甾酮。本发明首次公开了麦角甾酮的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了这种特殊的麦角甾酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【专利说明】火木层孔菌中麦角留酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.8108，分类名称为火木层孔菌Phellinusigniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【背景技术】
[0002]麦角留醇是一种重要的植物留醇(见留族化合物)，为留类化合物。存在于酵母和麦角中。CAS号:57-87-4,分子量:396.66，分子式C28H44O,相对密度1.04，，熔点168°C(含1.5摩尔水的结晶)(166~183°C)，沸点250°C。
[0003]麦角留酮是麦角留醇的轻度氧化物，具有抗菌等多种重要的生理活性，如今，未见到有抗禽流感病毒活性的报到。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的麦角甾酮。本发明首次公开了这种麦角留酮的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。
[0005]本发明的技术方案如下:
首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%`
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0006](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ；
(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0007]2.分离麦角甾酮的方法:
(1)将步骤I中所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌，然后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液；
(2)将步骤(1)中最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(3)收集步骤(2)得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(4)用步骤(3)得到的产物进行TLC制备，制备展开剂为氯仿:甲醇=20:1-30:1，刮板后装柱，用洗脱剂洗脱；
(5)收集步骤(4)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为一种麦角甾酮。
[0008]优选的，提取步骤⑴中所述的硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和/或
甲醇；
提取步骤(2)中所述的硅胶用量为1-3倍体积，洗脱剂为氯仿；
提取步骤(3)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为甲醇或丙酮；
提取步骤(4)所述的反相硅胶为反相C-8、C-18，洗脱剂为乙酸乙酯；
提取步骤(5)中TLC检测要点是出现红色斑点，展开剂为氯仿:甲醇=30:1-35:1。
[0009]然后使用得到的麦角留酮进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC50)及最大安全浓度；
最后在最大安全浓度范围内进行样品在MDCK细胞水平上对H5N1毒株的作用，计算样品的半数毒性浓度(CC5tl)和半数有效浓度(EC5tl),得到样品的选择指数(SI)=CC5tl / EC50,计算抑制率。
[0010]本方法较一般化合物应用的优点在于:发现了该种麦角留酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0011](四)【具体实施方式】 实例1:
火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当PH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。 [0012](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0013]将上述得物称取350g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，然后进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高lm，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿:甲醇=100:1，氯仿:甲醇=500:1，氯仿:甲醇=100:1.每种洗脱剂洗脱体积分别为3，3，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1，Fr-2, Fr_3。将Fr_3等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200— 300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿。收集上述洗脱液，使用TLC检测，适度合并，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。减压蒸干，收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，合并收集出现斑点的洗脱液。进行TLC制备，制备，展开剂为氯仿:甲醇=20: 1，刮板，装柱，乙酸乙酯洗脱，合并洗脱液，减压干燥，即为一种麦角甾酮。进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 6.61 (d, J= 9.4 Hz, 6H), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 6H)，5.74 (s, 6H)，5.23 (dd, J = 10.1, 7.6Hz, 20H), 3.06 - 2.37 (m, 31H), 2.37 - 1.98 (m, 55H)，1.90 - 1.46 (m, 83H)，
1.53 - 1.45 (m, 17H), 1.57 - 1.46 (m, 21H), 1.06 (d, J = 6.6 Hz, 21H), 1.04-0.59 (m, 170H).表明其为 4，6，8 (14)，22-四烯-3 -麦角甾酮。
[0014](7)采用 步骤(6)得到的麦角甾酮进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。
[0015]在96孔板上，10(^1/孔加入4父1051111-1浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，
在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置37°C，5%C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振荡5_10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。当加样组的OD492值不显著低于细胞对照组OD492时，此浓度即为样品的最大安全浓度。
[0016]表1麦角甾酮各浓度对细胞生长的影响
【权利要求】
1.麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。
2.如权利要求1所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于麦角留酮是从火木层孔菌提取的，提取步骤顺序如下:: (1)制备火木层孔菌粗提物； (2)将步骤(1)中所得的沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌，然后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)用步骤(4)得到的产物进行TLC制备，制备展开剂为氯仿:甲醇=20:1-30:1，刮板后装柱，用洗脱剂洗脱； (6)收集步骤(5)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为一种麦角甾酮。
3.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液； (2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ； (3)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90% ； (4)对步骤(3)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ； (5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
4.如权利要求3所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%。
5.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶。
6.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和甲醇混合液。
7.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为氯仿。
8.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为甲醇或丙酮。
9.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(5)所述的TLC制备，制备展开剂为氯仿:甲醇=20:1，洗脱剂为乙酸乙酯。
10.如权利要求2所述的麦角留酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(6)所述的检测要点是出现斑`点，展开剂为氯仿:甲醇=30:1-35:1。
【文档编号】A61P31/16GK103816163SQ201310401666
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】赵晨, 宋爱荣, 孔超, 杨松, 秦丹 申请人:青岛农业大学