火木层孔菌中环二肽c8在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌Phellinusbaumii、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的一种环二肽C8。本发明首次公开了一种环二肽的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了这种环二肽的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【专利说明】火木层孔菌中环二肽C8在抗禽流感H5N1病毒上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.8108，分类名称为火木层孔菌Phellinusigniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【背景技术】
[0002]通常生物学中所指的环肽是指以氨基酸肽键形成的化合物，在植物化学中这一概念被扩大成以酰胺键形成的一类化合物，因此范围被扩大至包括有机胺类和大环生物碱类，根据成环与否分为环肽和直链肽。已报道的环肽类化合物具有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗疟、安眠、抑制血小板聚集、降压、抑制酪氨酸酶、抑制环氧化酶、抑制脂质过氧化酶、雌性激素样、免疫抑制等生物活性。
[0003]由于环肽的前体-直链肽所包含的氨基酸的数目和种类的千差万别，造成了环肽合成方法的多样化。对某种直链肽表现出高效，快速缩合作用的试剂和方法对另外一种肽链就可能变得低效或无效。
[0004]一种环二肽具有抗菌等多种重要的生理活性，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的一种环二肽CS。本发明首次公开了这种一种环二肽的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。
[0006]本方法较一般化合物应用的优点在于:发现了该种一种环二肽CS的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0007]本发明的技术方案如下:
首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0008](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ；(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0009]然后从火木层孔菌粗提物中环二肽CS，步骤如下:火木层孔菌粗提物一正相硅胶层析一甲醇梯度洗脱一正相硅胶层析一甲醇凝胶一常压反相制备一HPLC检测—1D-HNMR^ 环二肽 C8。
[0010]具体方法为:
(1)制备火木层孔菌粗提物；
(2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；
(3)收集上述步骤(2)得到的最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；
(4)将步骤(3)得到的产物进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱； (5)收集洗脱液，适当合并，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析；
(6)将步骤(5)得到的产物进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇与水；
(7)HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C8。
[0011]优选的，提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
[0012]提取步骤(3)中所述的洗脱剂为甲醇。
[0013]提取步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目，洗脱剂为氯仿与甲醇。
[0014]提取步骤(5)中所述的凝胶类型为LH-20。
[0015]提取步骤(6)所述的反相材料为C-18或者C-8使用常压反相制备；洗脱剂为甲醇:水=40%-85% ;反相层析次数为1-3次。
[0016]提取步骤(7)所述的HPLC条件为Omin:95%水，IOmin:100%甲醇，出锋时间为
5.85-6.54min。
[0017](四)【具体实施方式】 实例1:
火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.0 1%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当PH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0018](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0019]称取300g粗提物与等体积的100目正相硅胶混匀，硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高1.5m,直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=200:1, 100:1,40:1分别洗脱4，5，5，5个柱体积。将最后一次的洗脱液适当合并，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析。收集洗脱液，适当合并，与等体积硅胶拌样，层析固定相使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行常压反相制备，A相为水，B相为甲醇。收集洗脱液，减压蒸干，HPLC检测，条件为Omin:95% 7jC, IOmin:100%甲醇，出锋时间为5.95min适当合并，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为 400MHZ，分析结果为 δ 7.30 (s, 1H)，4.06 (dd, J = 15.8, 10.2 Hz, 2H)，3.87(dd, J = 16.5，4.4 Hz, 1H)，3.65 - 3.48 (m, 2H)，2.42 - 2.26 (m, 1H)，2.03(dddd, J = 16.1, 13.3, 8.0, 5.2 Hz`, 3H)，1.95 - 1.81 (m, 1H).证明是((8aS)-六氢吡咯并[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。
[0020](7)采用步骤(6)得到的化合物进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。
[0021]在96孔板上，100 μ I/孔加入4X IO5Iiir1浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置370C，5%C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振荡5_10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。当加样组的OD492值不显著低于细胞对照组OD492时，此浓度即为样品的最大安全浓度。
[0022]环二肽C8各质量浓度组(n=12)
序号I密度(Ug.mL-1) I病变率
1_200_0.9598678178
21000.92710166904
3500.71856672229
4250.33731099139
512.50.14985814036
I细胞对照
由表1知:环二肽C8最大安全浓度为12.5ug/mL。
[0023]实例2:火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当PH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH3，通气量0.5-1.1vvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0024](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0025]称取100g粗提物与等体积的100目正相硅胶混匀，硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高0.Sm，直径14cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=200:1, 100:1, 40:1分别洗脱3，4，4，4个柱体积。将最后一次的洗脱液适当合并，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析。收集洗脱液，适当合并，与等体积硅胶拌样，层析固定相使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行常压反相制备，A相为水，B相为甲醇。收集洗脱液，减压蒸干，HPLC检测，条件为Omin:95% 7jC, IOmin:100%甲醇，出锋时间为5.93min适当合并，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为 400MHZ，分析结果为 δ 7.30 (s, 1H)，4.06 (dd, J = 15.8, 10.2 Hz, 2H)，3.87(dd, J = 16.5，4.4 Hz, 1H)，3.65 - 3.48 (m, 2H)，2.42 - 2.26 (m, 1H)，2.03(dddd, J = 16.1, 13.3, 8.0, 5.2 Hz, 3H)，1.95 - 1.81 (m, 1H).证明是((8aS)-六氢吡咯并[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。
[0026](7)采用步骤(6)得到的最大安全浓度范围内进行样品在MDCK细胞水平上对H5N1毒株的作用，计算样品的半数毒性浓度(CC5tl)和半数有效浓度(EC5tl),得到样品的选择指数
(SI)=CC50 / EC5tl，计算抑制率。
[0027]试验中，设置正常细胞对照组(只加细胞维持液)，病毒对照组(只加病毒液)，质量浓度在无毒范围内2倍稀释4个质量浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，loo μ I/孔加入1000tcid5q病毒液(ιο_4 43)，设置3个重复。37°c吸附2 h，弃病毒液上清，100 μ I/孔加入不同浓度的样液。置37°C，5% CO2培养箱中继续培养48h。采用MTT法测定OD492值，计算半数有效浓度(EC5tlX当加样组的OD492值显著大于病毒对照组OD492时，表明此样液能够显著抑制病毒感染MDCK，具有抗病毒的活性。[0028]根据计算出的细胞病变率和病毒抑制率。用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法，计算样品的半数毒性浓度(CC5tl)和半数有效浓度(EC5tl),得到样品的选择指数(SI)=CC50 / EC500
[0029]根据下公式计算病毒抑制率:
病毒抑制率=(A-B) / (C-B) X 100%
A:样液处理组OD值，B:病毒对照组OD值，C:细胞对照组OD值 表2化合物对H5N1病毒的抑制作用实验结果
【权利要求】
1.环二肽CS在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述环二肽CS为((8aS)-六氢吡咯并[l，2_a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
2.如权利要求1所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于环二肽CS是从火木层孔菌中提取的，提取步骤顺序如下: (1)制备火木层孔菌粗提物； (2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次； (3)收集上述步骤(2)得到的最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (4)将步骤(3)得到的产物进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱； (5)收集洗脱液，适当合并，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析； (6)将步骤(5)得到的产物进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇与水； (7)HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C8。
3.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液； (2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ； (3)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90% ； (4)对步骤(3)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ； (5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
4.如权利要求3所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%。
5.如权利要求3所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于火木层孔菌粗提物制备步骤(3)的乙醇为浓度65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。
6.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤⑵中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和/或甲醇；步骤(3)中所述的洗脱剂为甲醇。
7.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目，洗脱剂为氯仿与甲醇。
8.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(5)中所述的凝胶类型为LH-20。
9.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(6)所述的反相材料为C-18或者C-8使用常压反相制备；洗脱剂为甲醇:水=40%-85% ;反相层析次数为1-3次。
10.如权利要求2所述的环二肽C8在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤⑵所述的HPLC条件为Omin:95%水，IOmin: 100%甲醇，出锋时间为.5.85-6.54min。
【文档编号】A61K31/4985GK103800333SQ201310401670
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】赵晨, 宋爱荣, 孔超, 黄芳, 秦丹 申请人:青岛农业大学