一种分离自肠道内的益生菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及属于微生物病害控制领域，具体的说是一种分离自大菱鲆肠道内的益生菌及其应用。益生菌为非脱羧莱克勒菌（Leclercia?adecarboxylata）P115，已于2013年6月24日在中国微生物保存中心保藏，保藏编号为CGMCC?No:7813。本发明益生菌均从健康大菱鲆的肠道内分离获得。益生菌及其纯培养物对白色念球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌有明显抑菌效果。其纯培养物或组合物可用于水产养殖类病害的防控及新型抗菌物质的开发，具有良好的应用前景。
【专利说明】一种分离自肠道内的益生菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于微生物病害控制领域，具体的说是一种分离自肠道内的益生菌及其应用。
【背景技术】
[0002]益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体或动物肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。其主要通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用。它具有改善肠道菌群结构，抑制病原菌，生成营养物质，提高机体免疫力，消除致癌因子，降低胆固醇和血压，改善乳糖消化性等功能。Fuller于1989年首次给益生菌下定义:“益生菌是通过改善肠道菌群平衡而对宿主健康产生有益作用的活菌添加剂”。
[0003]人类生活中早已广泛应用的益生菌包括醋酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。随着微生物防害的方法的发展，特别是益生菌在取代传统抗生素的使用的前景，使得益生菌及其制剂越来越多的被应用于水产养殖业。目前水产养殖类的益生菌及其制剂主要分为共两类:①单一制剂，如酵母菌、光合细菌、乳酸菌、乳酸杆菌、乳酸乳球菌、荧光假单胞菌、芽孢杆菌等。②复合制剂，如美菌方、复合型活性生物净水剂等，主要有硝化细菌和反硝化细菌、枯草杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、粪链球菌、酵母菌等菌株组成。该类益生菌群由定向筛选的有益菌株配合而成，能够改善水产动物体内的微生态平衡，刺激机体的免疫系统，拮抗致病微生物，降解有机废物，从而减少疾病发生，促进水产动物生长发育，改善养殖生态环境。大量研究与实践证明，益生菌在水产养殖的应用中起到了良好的效果，如从虾、牙鲆等动物体内分离得到的多株益生菌，从而制成的微生物复合菌液可以改良底质，稳定水质，是保证养殖成功的重要技术。由于没有再施用化学药剂，因而生产出来的水产品是比较完全和无污染的绿色食品，并可避免水产品产生所谓的抗药性。多年连续使用菌液的水体必定能形成有效微生物菌群的生态优势，达到水环境的良性循环，保证对水产品养殖的持续发展。 [0004]益生菌的分离一般是通过采集大量不同的菌株，在体外进行选择性培养或抗菌实验获得。Gatesoupe的综述中详细地列出了乳酸菌选择性培养基的原则和方法。Sugita等人在7种近海鱼类肠道中分离出10055株菌株进行抗菌实验，并选择出优良的益生菌株芽孢杆菌。后来也出现了分离鉴定的新技术，例如，Vandenberghe等人对在凡纳滨对奸养殖中常见的菌株Vibro harveyi进行了全序列的AFLP指纹图谱分析,从而对其遗传特征进行分析。Spanggard等人同时采用了传统的平板培养分离与16s rDNA序列测定法对虹鳟肠道菌群进行鉴别。
[0005]随着我国水产养殖业的不断发展。工厂化、高密度养殖造成的病害问题日益突出。每年因水产病害造成的损失多大数百亿元。而治疗水产动物的疾病，常规仍广泛采用化学治疗法，抗生素的滥用使水体细菌产生抗药性及药物残留，间接危害了人类的健康。因此，越来越多的专家开始关注于利用自然环境中有益微生物对水产养殖环境的生物修复，以此来取代抗生素的使用，这样不仅节约了费用，还不会产生二次污染，而且还能将剩余饵料、排泄物及其他有害物质分解转化，使水质保持良好的状态，使养殖生物处于健康水平。因此，有益微生物对水产养殖环境的生物修复技术的研究和开发具有极其广阔的前景，在水产养殖领域的应用也会越来越广泛，同时带来更大的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种分离自肠道内的益生菌及其应用。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]一种分离自肠道内的益生菌，益生菌为非脱羧莱克勒菌(Leclerciaadecarboxylata) P115,已于2013年6月24日在中国微生物保存中心保藏,保藏编号为CGMCC No:7813,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0009]所述益生菌可用于制备水产或人类病原菌的抗菌饲料或抗菌药物。
[0010]所述水产病原菌包括灿烂弧菌、 哈氏弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌或鳗弧菌；人类病原菌包括白色念球菌、金黄色葡萄球菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0011]一种抑制有害治病细菌生长组合物，抑制有害治病细菌生长组合物为权利要求1所述的益生菌或是益生菌的培养物或含有益生菌的混合培养物。
[0012]所述组合物可用于制备水产病原菌或人类细菌的抗菌药物或抗菌饲料。
[0013]非脱羧莱克勒菌(Leclercia adecarboxylata) P115,在2216E固体平板上,单菌落直径为1.5mm左右，圆形,浅黄色,半透明，凸出培养基表面,有光泽。16sDNA序列分析显示其与非脱羧莱克勒菌EG88的16sDNA的相似性为99.9%。
[0014]本发明所具有的优点:本发明益生菌均从健康大菱鲆的肠道内分离获得。益生菌及其的纯培养物对可引起水产养殖病害的副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌有明显抑菌效果，对人类临床病原如白色念球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌同样有明显的抑菌效果。其纯培养物或组合物可用于水产养殖类病害的防控及临床新型抗菌物质的开发，具有良好的应用前景。本发明益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可提高工厂化养殖大菱鲆的生存率和抗病能力。
【具体实施方式】
[0015]围绕本发明所述的菌株及【具体实施方式】做详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0016]实施例1益生菌的筛选及分离
[0017]I)取样:随机取健康大菱鲆(体长10-15cm)5-10条，用100_200ul的1-2%戊巴比妥钠麻醉，无菌条件解剖，取其肠道。迅速用无菌2216E液体培养基(成分:蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0.lg，陈海水1000mL，pH7.5，121°C灭菌20min)或无菌PBS清洗，5-lOmL的玻璃匀浆器匀浆，匀浆液用无菌2216E液体培养基或PBS按照10' 10_2、10' 10_4、10_5、10_6梯度稀释。选择10_3和10_6稀释度的匀浆液，分别均匀涂布在TSB、LB、2216E固体平板上。28-30 0C，倒置培养 24-48h。
[0018]2)初筛:在上述平板上长起的单菌落，根据菌落形态结构特征，分别挑起，用与上述取样培养时所用的液体相应的液体培养基培养至OD6tltl=0.8-1.0，取50-100ul培养液，点种在细菌数量达到或大于IO6鳗弧菌的2216E琼脂平板上，28-30°C，倒置培养24_48h。
[0019]3)复筛:选取在初筛中，将产生了明显抑菌圈的菌株再次点种在上述含有鳗弧菌的2216E琼脂平板上。
[0020]4)分离:将筛选获得菌株分别在相应的筛选培养基上划线，检测单菌落形态特征，将单菌落用2216E液体培养基培养至OD6tltl=0.8-1.0，加入30-50%甘油，混匀后-20— 80°C长期保存。
[0021]通过筛选和分离，获得具有抑菌效果，对鳗弧菌产生拮抗作用的P115菌株，其可以在2216E琼脂糖平板上生长。
[0022]实施例2:P115的鉴定及活性分析
[0023]1.16S rDNA 分析
[0024]a) P115基因组DNA的提取:将P115培养至0D_= 1.0-1.5，利用酚氯仿法抽提P115
的基因组DNA至无蛋白层产生，用一定量的TE溶液溶解。
[0025]b)PCR扩增 16SrDNA:PCR 反应体系为 0.5μ I Ρ115 基因组 DNA，I μ I 27F，I μ I1492R,4y I ?ΝΤΡ,δμ I Taqbuf，0.4 μ I Taq 酶，36.1μ I ddH20。反应条件为 95°C预变性5min, 95°C变性 lmin，54°C 复性 30s, 72°C延伸 lmin，运行 30 个循环。72°C延伸 IOmin.PCR产物将电泳检测为单条带，大小约为1.6kb，符合预期。其中，具体引物27F和1492R为常用
引物，属于公知领域。
[0026]
【权利要求】
1.一种分离自肠道内的益生菌，其特征在于:益生菌为非脱羧莱克勒菌(Leclerciaadecarboxylata) P115,已于2013年6月24日在中国微生物保存中心保藏,保藏编号为CGMCC No:7813。
2.按权利要求1所述的分离自肠道内的益生菌，其特征在于:所述益生菌可用于制备水产或人类病原菌的抗菌饲料或抗菌药物。
3.按权利要求2所述的分离自肠道内的益生菌，其特征在于:所述水产病原菌包括灿烂弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌或鳗弧菌；人类病原菌包括白色念球菌、金黄色葡萄球菌或肺炎克雷伯氏菌。
4.一种抑制有害治病细菌生长组合物，其特征在于:抑制有害治病细菌生长组合物为权利要求1所述的益生菌或是益生菌的培养物或含有益生菌的混合培养物。
5.按权利要求4所述的抑制有害治病细菌生长组合物的应用，其特征在于:所述组合物可用于制备水产病原菌或人`类细菌的抗菌药物或抗菌饲料。
【文档编号】A61P31/10GK103525719SQ201310403662
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】焦绪栋, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所