突变的噬菌体裂解基因e、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用。本发明的一种突变噬菌体裂解基因E（Eprom）是通过将噬菌体phiX174的裂解基因E的启动子区进行突变后获得的，突变后的E基因使得培养菌的温度从现有的28℃变成37℃，而且具有更高的裂解效率、更高的起始诱导浓度和规模化生产能力，发酵罐培养裂解效率高达99.99997%。将Eprom与pBV220连接后即得高效裂解质粒载体pBV-Eprom。将pBV-Eprom转化到胸膜肺炎放线杆菌中，诱导Eprom基因表达，得到胸膜肺炎放线杆菌菌影。本发明的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保护效力，可以刺激机体产生高滴度的抗体，且能够对不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌强毒株的攻击提供良好的交叉免疫保护。
【专利说明】突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及噬菌体裂解基因E在制备疫苗中的应用，尤其涉及一种突变的噬菌体裂解基因E，本发明还涉及含有该基因的裂解载体以及该裂解载体在制备菌影疫苗，特别是猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗中的用途，属于基因工程疫苗领域。
【背景技术】
[0002]细菌菌影(Bacterial ghost)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为“细菌菌影”。细菌菌影是由内膜(cytoplasmic membrane),胞衆间隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为细菌菌影的成分之一。细菌菌影本身可作为一种很好的疫苗，因为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP (pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖,妝聚糖，CPG, OmpA,菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前，菌影通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。霍乱菌菌影(VCG)经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外，细菌菌影还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组菌影拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结(Peyer’ s Patches)的M细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体(C.trachomatis)抗原在霍乱菌的内膜表达,然后裂解制备的重组菌影(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Thl型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组细菌菌影有几大优势:(I)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但蛋白的分子量最好在2000到200，OOODa之间；(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)菌影的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。[0003]裂解基因E的表达可在λ pL/pR-cI857或在IacPO-1acIq启动阻遏系统的转录控制下完成。一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性裂解质粒已经被构建出来。λ PR启动子和温敏阻遏物cI857在30°C以下能抑制基因E的表达，高于30°C会导致阻遏物CI857热灭活而诱导E基因表达。为了制备菌影，细菌须在28°C条件下生长到对数生长期，然后升温到42°C诱导其裂解。
[0004]E蛋白介导的裂解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博德特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要E基因裂解盒被引入到适当的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。[0005]目前，国内外现有的制备细菌菌影的裂解质粒载体系统都是在上述28°C条件下培养增殖细菌，然后再升温到42°C诱导E基因的表达制备细菌的菌影。但是，大多数细菌的最佳生长温度都是37°C，28°C条件下培养使得很多细菌的生长速度大大下降，而且不利于天然表面抗原的形成，影响疫苗的免疫原性和保护效果。本发明将E基因的启动区突变后不但使得初始培养温度从28°C提高到37°C，克服了菌影制备速度慢和免疫原性差的缺陷，而且裂解效率也提高了 I-2个数量级。更为关键的是，基于突变后的E基因Eprom构建的裂解载体PBV-Eprom能够利用发酵罐大量地制备胸膜肺炎放线杆菌的菌影，使规模化生产成为可能，而该方面并未见相关的研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的经过突变的噬菌体裂解基因E。
[0007]本发明的目的之二是提供一种含有上述突变噬菌体裂解基因的裂解载体。
[0008]本发明的目的之三是将上述裂解载体应用于制备菌影疫苗。
[0009]本发明的目的之四是提供一种制备猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法以及由该方法获得的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0010]本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0011]本发明利用基因突变技术，对PhiX174噬菌体裂解基因E以及上游的调控基因进行随机突变，使启动子区发生基因突变，突变后的Eprom基因能使E基因的CI857抑制子在更高的温度抑制E基因的转录，从而使得培养温度从现有的裂解质粒载体的28°C变成突变后的37°C，而且具有更高的裂解效率和规模化生产能力。
[0012]本发明的一种突变的噬菌体裂解基因E，命名为Ερι.οπι，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示。
[0013]将本发明突变噬菌体裂解基因与原核表达载体相连接后，即得到裂解载体；作为一种优选的实施方案，例如，可以将序列SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列与pBV220载体相连接，可得到一种高效裂解载体pBV-Eprom ;经检测，pBV-Eprom的裂解效率可高达99.99997%。
[0014]因此，本发明提出了所述的突变的噬菌体裂解基因E在制备菌影疫苗中的应用。
[0015]进一步的，本发明还提出了一种制备猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括:
[0016](I)构建含有本发明所述的突变的噬菌体裂解基因E的裂解载体；
[0017](2)将该裂解载体转化到胸膜肺炎放线杆菌中，得到含有裂解载体的胸膜肺炎放线杆菌转化子；
[0018](3)将该胸膜肺炎放线杆菌转化子进行增殖培养；
[0019](4)诱导突变噬菌体裂解基因E的表达，收集形成的菌影，得到猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0020]在本发明中，优选的，所述的裂解载体是通过将SEQ ID NO:1所示的序列克隆入PBV220载体中得到的。
[0021]在本发明中，优选的，步骤(3)中该胸膜肺炎放线杆菌转化子在37°C进行增殖培养。
[0022]在本发明中，优选的，步骤(4)中在42°C温度条件下诱导突变噬菌体裂解基因E的表达。
[0023]在本发明中，优选的，步骤(4)中当胸膜肺炎放线杆菌转化子浓度为0D_等于0.8时开始升温诱导突变噬菌体裂解基因E的表达。
[0024]再进一步的，本发明还提出了由以上所述的方法制备得到的猪传染性胸膜肺炎菌
影疫苗。及
[0025]所述的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗在制备防治猪传染性胸膜肺炎药物中的应用。
[0026]相较于现有技术，本发明的有益效果在于:
[0027]1、本发明通过试验发现，突变后的Eprom基因可以使E基因的CI857抑制子在更高的温度抑制E基因的转录，从而使得培养温度从现有的裂解质粒载体的28°C变成突变后的37°C，而且具有更高的裂解效率(高达99.99997%，比突变前高I-2个数量级)、更高的起始诱导浓度(从突变前的OD6tltl0.4变为突变后的OD6tltl0.8)和规模化生产能力(可以利用发酵罐批量制备胸膜肺炎放线杆菌菌影)。
[0028]2、安全性试验结果表明，本发明所制备的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的安全性，接种后的猪只无任何不良反应。
[0029]3、免疫保护试验结果表明，接种本发明猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗后，可显著刺激免疫猪产生高滴度的抗体，并能有效保护各免疫猪抵抗不同血清型胸膜肺炎放线杆菌强毒株的攻击，说明本发明猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗具有良好的交叉免疫保护效果。而且相较于常规灭活苗和经28°C诱导表达的菌影疫苗，本发明的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗具有更高的免疫原性和免疫保护效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为突变的噬菌体裂解基因E (Eprom)的构建示意图；
[0031]图2为发酵罐规模化制备胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株菌影的裂解曲线；
[0032]图3为胸膜肺炎放线杆菌菌影(ghost)的透射电镜观察结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0034]试验材料
[0035]菌株及质粒
[0036]大肠杆菌TGl感受态细胞购于弘博生物技术有限公司，噬菌体PhiX174购于Promega (北京)生物技术有限公司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文献构建:张智清，姚立红，侯云德，含PrPl启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990，6（2），111-116。
[0037]胸膜肺炎放线杆菌血清7型CVCC265株购买自中国兽药监察所。
[0038]实施例1突变的噬菌体裂解基因的克隆
[0039]根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因E的编码序列设计引物:
[0040]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0041]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0042]上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点EcoR I和BamH I，由哈尔滨博仕合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因E =PCR扩增反应体系为50 μ L，其中 MgSO4 2mM，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U(TaKaRa)，模板 DNA 10ng。PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C308，30个循环，721: 5min。PCR扩增后的E基因经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用DNA酶对E基因进行酶切，回收10-50bp的DNA片段。取I μ I回收后的DNA进行PCR扩增，PCR 扩增反应体系为 50 μ L:10x Taq buffer，Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 DNA10ng。PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 30s, 42。。30s, 72。。30s, 30 个循环，72°C5min。电泳结果为小于276bp的smear。
[0043]以特异性的引物Lysis E_U和Lysis E_L对上述PCR产物进行特异性扩增。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中MgSO4 2mM，上、下游引物各I μ M，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer,Taq?DNA 聚合酶 2U( TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反应程序为:95°C 预变性 5min，94°C 30s, 59°C30s, 72°C 308，30个循环，721: 5min。获得含有突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物，用胶回收试剂盒回收。突变的噬菌体裂解基因E的扩增过程见附图1。
[0044]实施例2裂解质粒载体pBV-Eprom的构建及培养条件的筛选
[0045]将实施例1所克隆的裂解基因E纯化后用EcoR I/BamH I双酶切，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的pBV220载体相连接，16°C过夜连接并热激转化入大肠杆菌TGl感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，得到裂解载体。
[0046]选取20个含裂解载体的大肠杆菌TGl的菌落，分别接种在5mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB中，37°C过夜震荡培养(220r/min)，然后转接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB中，37°C震荡培养至0D_达0.4左右。此时将温度迅速升高到42°C培养以诱导E基因表达，继续培养4-5小时，肉眼观察裂解效率。可以观察到不同的试验结果，有的试管在37°C过夜培养时即呈现裂解现象，菌液较稀薄，并可见少量细菌碎片，转接后37°C培养也呈现裂解现象，0D_值无法达到0.4 ;有的试管37°C过夜培养裂解效果不明显，但转接后继续37°C培养却呈现明显的裂解现象，也无法使0D_值达到0.4 ;只有I个试管得到了想要的结果，即37°C过夜培养和转接后继续37°C培养均未呈现出裂解现象，OD600达0.4时温度升高到42°C并诱导4-5小时后却呈现出明显的裂解现象，菌液澄清透明并可见大量的菌体碎片。将37°C培养裂解的菌液和不裂解的菌液分别进行质粒提取和突变E基因的序列测定，分析比较不同培养条件下裂解质粒中突变E基因的变异情况，并获得了在37°C条件下培养不裂解的质粒载体。对该质粒载体进行测序发现，裂解基因E的启动子区发生了突变，突变后的E基因命名为Ερι.οπι，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，含有EpiOm的裂解载体命名为pBV-Eprom。
[0047]实施例3含裂解载体pBV-Eprom的重组胸膜肺炎放线杆菌的构建
[0048]1、构建含有SEQ ID NO:1所示的突变的噬菌体裂解基因E的裂解载体；
[0049](I)合成SEQ ID NO:1所示的突变的噬菌体裂解基因E的序列；
[0050](2)设计引物:
[0051]Lysis E-U:5/ -AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' (SEQ ID N0.2)
[0052]Lysis E-L:5/ -AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.3)
[0053]以特异性的引物Lysis E-U和Lysis E-L对上述合成的突变的噬菌体裂解基因E的序列进行特异性扩增。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中MgSO4 2mM,上、下游引物各I μ Μ，dNTP 200 μ M, IOx Taq buffer, Taq?DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)，模板 I μ L。PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s，30 个循环，72°C 5min。获得突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物，用胶回收试剂盒回收。
[0054](3)将纯化后的突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物用EcoR I/BamH I双酶切，用T4DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的pBV220载体相连接，16°C过夜连接并热激转化入大肠杆菌TGl感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经测序鉴定无误后，得到裂解载体pBV-Eprom。
[0055]对于pBV-Eprom的构建属于本领域的常规操作，以上方法只是其中一种可以实现本发明的方法，本领域技术人员还可有多种选择。例如，本领域的技术人员完全可以按照实施例I和实施例2的方法构建得到裂解载体pBV-Eprom。即使得到的载体序列与本发明的不同，也可以通过定点突变的方法得到与本案记载的Eprom序列完全相同的载体，而在此过程中不需要付出任何的创造性劳动。
[0056]2、将裂解质粒载体pBV-Eprom及突变前的pBV_E (裂解基因选择未突变的E基因，其余构建过程与pBV-Eprom相同)分别电击转化到胸膜肺炎放线杆菌血清7型CVCC265株(氨节青霉素敏感株)中，电穿孔仪(Micro-pulser, Bio-Rad, USA)的电击参数为:12.5kV/cm、200 Ω、25 μ f、5.2ms。
[0057]3、阳性转化子通过菌落PCR进行鉴定。
[0058]4、选取含裂解质粒载体pBV-Eprom以及pBV_E的胸膜肺炎放线杆菌阳性转化子菌落，分别接种在5mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，均放置于28°C和37°C过夜震荡培养(220r/min)，然后转接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，继续在28°C或37°C下震荡培养至OD6tltl值达到0.4左右。将培养物迅速调高到42°C培养以诱导Eprom和E基因的表达，继续培养4-5小时，肉眼观察裂解效果。试验结果与大肠杆菌裂解结果类似，转化pBV-E的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株可以在28°C培养和42°C诱导条件下裂解获得胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株的菌影；但在37°C培养时即出现裂解现象，无法使0D_值达到0.4，而转化pBV-Eprom的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株在28°C和37°C培养时都不出现裂解现象，只有升温到42°C才出现裂解现象。[0059]实施例4裂解质粒载体pBV-Eprom裂解效果与胸膜肺炎放线杆菌OD值的关系
[0060]选取实施例3中构建的含裂解质粒载体pBV-Eprom的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株阳性转化子菌落，接种在5mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C过夜震荡培养(220r/min)，然后转接l_2mL于50mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB(含10 μ g/mL NAD)中，37°C震荡培养至0D6(I(I值达到0.4、0.6、0.8和1.0左右。取出100 μ L培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42 °C培养以诱导Eprom的表达，继续培养4_5小时。取诱导前后的培养物各100 μ I适当稀释后涂TSA琼脂平板(含10 μ g/mL NAD)进行活菌CFU检测。观察发现，在不同OD6tltl值的情况下，Eprom基因具有很高的裂解效果，即使在0D_值为0.8的情况下开始诱导，也表现出很高的裂解效果(99.99997%，比突变前高I-2个数量级)，菌液清澈透明并可见明显的细胞碎片。结果表明，突变后的裂解质粒载体PBV-Eprom的裂解效率并不受细菌OD值的影响，即使在OD值高达0.8时开始诱导也仍然能够进行有效的裂解，远远高于国外报道的细菌OD值须维持在0.4的水平，为大规模制备细菌菌影和工业化生产奠定了现实的基础。
[0061]实施例5发酵罐大量制备胸膜肺炎放线杆菌菌影
[0062]将含有裂解质粒载体pBV-Eprom的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株接种到5mL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37 °C震荡培养12小时左右(220r/min)，然后转接l-2mL于IOOmL含50 μ g/mL氨苄青霉素的TSB (含10 μ g/mL NAD)中，37°C过夜震荡培养。次日，将所有IOOmL培养物转接到含IOOOOmLTSB培养基(含50 μ g/mL氨苄青霉素和10yg/mL NAD)的发酵罐中，37°C震荡培养(220r/min)。发酵罐设置参数为ρΗ7.14-7.18 ；ρ02 40%, Airflow 1.35L/min。当 OD600 达 0.8 时迅速升温到 42°C条件下继续震荡培养4-5小时。从开始诱导时每隔30分钟取ImL样品测0D_值，用于绘制裂解曲线。结果表明，升温诱导后0D_值有短暂的升高，至I小时时达到顶峰1.015，之后迅速下降，并在诱导3小时时达到最低值0.315，之后一直维持这一水平。发酵罐规模化制备胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株菌影的裂解曲线见附图2。收获的胸膜肺炎放线杆菌菌影。另外，取诱导前后的培养物各100 μ I适当稀释后涂TSA琼脂平板(含10 μ g/mL NAD)进行活菌CFU检测。裂解效率检测结果显示，培养物从诱导前的5xl08CFU/ml下降到诱导后的2.6xl03CFU/ml，裂解效率高达99.99997%。结果表明，突变后的裂解质粒载体pBV-Eprom可以利用发酵罐大规模的制备胸膜肺炎放线杆菌的菌影，完全满足实现工业化生产的要求。
[0063]实施例6猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的制备
[0064]将实施例5中收获的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株菌影用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻干后的菌影进行活菌CFU检测。没有活菌残留的胸膜肺炎放线杆菌菌影可以直接用作猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗。
[0065]将本实施例中制备的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株菌影用PBS适量稀释后，以
2.5%的戊二醛固定菌影，置4°C条件下固定2小时，PBS洗涤3次，离心后经四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后进行透射电镜观察。电镜观察结果见附图3。
[0066]试验例I猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的安全性试验
[0067]1.猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗对仔猪的安全性试验
[0068]选取15头4-6周龄的胸膜肺炎放线杆菌血清阴性的健康仔猪，随即分为3组，每组5头。3个实验组分别肌肉注射ImL不同浓度的实施例6制备的胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株菌影疫苗，分别为5xl0lclCFU/mL、5xl09CFU/mL和5xl08CFU/mL。接种后每天观察试验猪的食欲、精神状态、体温等；接种后14天剖杀所有试验猪，取心、肝、脾、肺、肾等各脏器进行病理组织学观察。试验结果见表I。
[0069]表I猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗对仔猪的安全性试验
[0070]
【权利要求】
1.一种突变的噬菌体裂解基因E，命名为EpiOm,其特征在于:所述的突变的噬菌体裂解基因E的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.一种裂解载体，其特征在于:含有权利要求1所述的突变的噬菌体裂解基因Ε，优选的，所述的裂解载体是通过将SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列与pBV220载体相连接得到的。
3.权利要求1所述的突变的噬菌体裂解基因E在制备菌影疫苗中的应用。
4.一种制备猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的方法，包括: (1)构建含有权利要求1所述的突变的噬菌体裂解基因E的裂解载体； (2)将该裂解载体转化到胸膜肺炎放线杆菌中，得到含有裂解载体的胸膜肺炎放线杆菌转化子； (3)将该胸膜肺炎放线杆菌转化子进行增殖培养； (4)诱导突变噬菌体裂解基因E的表达，收集形成的菌影，得到猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于:所述的裂解载体是通过将SEQID Ν0:1所示的序列克隆入PBV220载体中得到的。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(3)中该胸膜肺炎放线杆菌转化子在37 °C进行增殖培养。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(4)中在42°C温度条件下诱导突变噬菌体裂解基因E的表达。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(4)中当胸膜肺炎放线杆菌转化子浓度为OD6tltl等于0.8时开始升温诱导突变噬菌体裂解基因E的表达。
9.由权利要求4-8任何一项所述的方法制备得到的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗。
10.权利要求9所述的猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗在制备防治猪传染性胸膜肺炎药物中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK103451195SQ201310409238
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】王春来, 李刚, 谢芳, 张艳禾 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所