一种疫苗组合物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物,该疫苗组合物包括:免疫量的禽多杀性巴氏杆菌抗原、免疫量的新城疫抗原、免疫量的H9亚型禽流感抗原;以及兽医学上可接受的一种或多种佐剂。该疫苗组合物既能简化免疫程序,达到一针多防的目的,即对禽多杀性巴氏杆菌、新城疫、H9亚型禽流感三种疾病产生保护性免疫,又能降低多次免疫使注射部位产生肿块、产蛋率降低等副作用,还能降低三种疾病混合感染时所引起的鸡群大规模死亡率。
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 禽巴氏杆菌病又名禽霍乱,是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引 起的主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类的一种接触性败血性传染病。该病对各年龄段的家禽 均有易感性,主要发生于产蛋鸡群,常表现为急性败血症和急性下痢等症状,同时伴随呼吸 道感染,死亡率通常是20% -30%或更高;感染后存活的家禽生产性能下降,而且存在带毒 隐性传播的风险。该病一年四季均可发生,以高温、高湿、多雨的夏秋两季发病率为最高,是 严重影响养禽业发展的主要细菌病之一。市场上现有的禽巴氏杆菌病疫苗主要有灭活疫苗 及活疫苗两种,但禽巴氏杆菌病灭活疫苗所使用的佐剂常为铝胶佐剂、油佐剂,免疫动物后 会使注射部位产生肿块等副作用;而弱毒活疫苗所引起的安全性问题不容忽视。
[0003] 新城疫俗称鸡瘟,是由新城疫病毒引起的一种禽类急性、败血性、高度接触性传染 病,是所有鸡病中危害最严重的一种,主要经呼吸道和消化道感染,主要特征是呼吸困难, 严重下痢,病程稍长的伴有神经症状。各种日龄的鸡均可感染,以雏鸡最为严重,还可导致 病禽的产蛋下降。目前针对新城疫的防控,主要以鸡新城疫灭活疫苗为主,但其使用佐剂常 为油佐剂,免疫动物后会使注射部位产生肿块等副作用。
[0004] 禽流感(AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起禽类及其他鸟类的一种感染和/或 疾病综合征。H9亚型禽流感感染后的舍饲禽(包括家禽)可表现为亚临床症状、轻的呼吸系 统感染到无症状带毒等多种流行形式。目前,疫苗的接种仍是预防禽流感发生与流行的最 有效手段。市场上现有的禽流感疫苗主要是灭活疫苗,所使用的佐剂常为油佐剂,免疫动物 后会使注射部位产生肿块等副作用。
[0005] 禽多杀性巴氏杆菌本身存在于健康机体内,属于条件性致病菌。新城疫疫苗接种 在很大程度上控制了该病的大规模流行,但由于养殖户采用的免疫程序不合理或免疫方法 不当,新城疫感染仍时有发生。亚型禽流感在禽类中暴发通常引起较温和的临床症状、 较低的发病率和死亡率,但当机体感染亚型禽流感后,抵抗力往往较差,此时与其它疫 病共同感染就能够引起禽类的高发病率和高死亡率。近年来,临床诊断上,病死鸡检出同时 混合感染禽多杀性巴氏杆菌、新城疫、亚型禽流感三种疫病的现象逐年增多,根据临床统 计,三者共同感染较单一疫病感染导致机体死亡率大幅度上升,且往往为无任何症状突然 性大批鸡群的死亡,给禽养殖业带来巨大的经济损失。而目前尚未有一种可以同时预防三 种疫病的疫苗。
[0006] 专利申请CN1724068A公开了一种禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法,分离鉴定禽 多杀性巴氏杆菌CVCC458作菌种;分离细菌接种于改良BPY培养基作为种子液,经尿囊腔 接种11日龄鸡胚,孵化收获鸡胚,捣碎,灭活,加入白油佐剂,即成禽霍乱强化灭活疫苗,每 0. 5ml含菌体100亿。然而,该发明所制备的禽霍乱强化疫苗所用佐剂为普通的白油佐剂, 白油佐剂注射后吸收不完全,副反应大。
[0007] 专利申请CN1724068A公开了一种鸡新城疫、H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备 方法,将NDV La Sota株生产毒种、AIV HL株生产毒种稀释后分别接种9-10日龄易感鸡胚, 孵育,收获、灭活;取灭活的NDV La Sota株病毒液和AIV HL株病毒液等量混合,加入白油 佐剂乳化。然而,该疫苗保护性抗原成分少,仅为两种病毒病抗原,不能提供完全的保护。此 外采用白油佐剂,疫苗副反应较大。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术的不足,本发明提供了一种疫苗组合物,该疫苗组合物既能简 化免疫程序,达到一针多防的目的,即对禽多杀性巴氏杆菌、新城疫、H9亚型禽流感三种疾 病产生保护性免疫,又能降低多次免疫使注射部位产生肿块、产蛋率降低等副作用,还能降 低三种疾病混合感染时所引起的鸡群大规模死亡。
[0009] 本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包括:免疫量的禽 多杀性巴氏杆菌抗原、免疫量的新城疫抗原、免疫量的H9亚型禽流感抗原;以及兽医学上 可接受的一种或多种佐剂。
[0010] 本发明所述的"禽多杀性巴氏杆菌抗原"是指当所述抗原免疫动物时,特别地,所 述动物为鸡,给药时,可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗禽多杀性巴氏杆菌感染的免疫应 答。
[0011] 本发明所述的"新城疫抗原"是指当所述抗原免疫动物时,特别地,所述动物为鸡, 给药时,可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗新城疫感染的免疫应答。
[0012] 本发明所述的"H9亚型禽流感抗原"是指当所述抗原免疫动物时,特别地,所述动 物为鸡,给药时,可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗亚型禽流感感染的免疫应答。
[0013] 优选地,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的 禽多杀性巴氏杆菌抗原;所述新城疫抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的新城 疫抗原;所述的H9亚型禽流感抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的H9亚型禽流 感抗原。
[0014] 更优选地,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原为灭活的禽多杀性巴氏杆菌C48-2株全菌 抗原,所述新城疫抗原为灭活的新城疫病毒LaSota株全病毒抗原,所述H9亚型禽流感抗原 为灭活的H9亚型禽流感抗原HL株全病毒抗原。
[0015] 可用于本发明的禽多杀性巴氏杆菌抗原还可以包括以下组合物中的任一种抗原, 如:山东滨州沃华生物工程有限公司的禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗(1502株)、山东绿都生 物科技有限公司的禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗(C48-2株)。
[0016] 可用于本发明的H9亚型禽流感抗原还可以包括以下组合物中的任一种抗原,如: 国药集团扬州威克生物工程有限公司的禽流感灭活疫苗(H9亚型,F株)、哈尔滨维科生物 技术开发公司的禽流感灭活疫苗(即亚型,SD696株)、天津瑞普生物技术股份有限公司高 科分公司的禽流感灭活疫苗(H9亚型,Sy株)、北京信得威特科技有限公司的禽流感灭活疫 苗(H9亚型,SS株)、齐鲁动保保健品有限公司的禽流感灭活疫苗(H9亚型,LGl株)。更优 选地,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原为灭活的禽多杀性巴氏杆菌C48-2株全菌抗原,所述新 城疫抗原为灭活的新城疫病毒LaSota株全病毒抗原,所述H9亚型禽流感抗原为灭活的H9 亚型禽流感抗原HL株全病毒抗原。
[0017] 禽多杀性巴氏杆菌C48-2株已在国家兽医微生物菌种保藏管理中心(简称为 CVCC)保藏,保藏日期为1964年6月25日,保藏号为CVCC44802,购买于中国兽医药品监察 所。
[0018] 新城疫LaSota株已在国家兽医微生物菌种保藏管理中心(简称为CVCC)保藏,保 藏日期为1973年3月12日,保藏号为CVCC AV1615,购买于中国兽医药品监察所。
[0019] H9亚型禽流感抗原HL株见文献:孙进忠等,禽流感病毒(H9N2亚型,HL株)与国 内部分省禽流感病毒(J19亚型)流行株抗原相关性及交互免疫的研究,2007年畜牧兽医学 会年会论文集,2007, 35-38。
[0020] 优选地,所述佐剂包括水性佐剂、蜂胶佐剂中的一种或几种;更优选地,所述水性 佐剂为Gel佐剂。
[0021] 本发明所用术语"水性佐剂"又称"水基佐剂"或"水溶性佐剂",是一种聚合物水 溶性分散体,用于提高水溶性疫苗的功效和安全性,滴入水中能迅速与水混溶。
[0022] 优选地,所述佐剂为疫苗组合物的5%_25%V/V,更优选为10%_15%V/V。
[0023] 优选地,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为> 5X 109CFU/ml ;所述新城疫抗原含 量为彡6X108_5EID5tZml ;所述H9亚型禽流感抗原含量为彡6X 108 5EID5Q/ml。
[0024] 更优选地,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为I X 10nCFU/ml ;所述新城疫抗原含 量为7. 5 X 108_ 5EID5tZml ;所述H9亚型禽流感抗原含量为7. 5 X 108_ 5EID5tZml。
[0025] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法,所述制备方法包 括:(1)分别培养增殖所述禽多杀性巴氏杆菌、所述新城疫病毒、所述亚型禽流感病毒, 分别灭活;(2)按比例混合所述禽多杀性巴氏杆菌全菌抗原、所述新城疫全病毒抗原、所述 H9亚型禽流感全病毒抗原,并加入佐剂。
[0026] 优选地,所述抗原比例为所述禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为> 5X 109CFU/ml ;所 述新城疫抗原含量为彡6X 108 5EID5Q/ml ;所述H9亚型禽流感抗原含量为彡6X 108 5EID5Q/ ml 〇
[0027] 本发明的再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽多杀性巴 氏杆菌、新城疫、J19亚型禽流感感染的药物中的应用。
[0028] 基于此,本发明具有以下突出的优点;
[0029] (1)本发明所述的疫苗组合物能简化免疫程序,可达到一针即可预防和/或治疗 禽多杀性巴氏杆菌、H9亚型禽流感、新城疫三种疾病的目的,与多打几针现有的单疫苗才能 预防和/或治疗这三种疾病的情况相比,本发明所述的技术方案更加经济实用,并具有一 定的社会效益;
[0030] (2)本发明所述的疫苗组合物能就降低现有的单疫苗多次免疫使注射部位产生肿 块等副作用;
[0031] (3)本发明所述的疫苗组合物还能降低三种疾病混合感染时所引起的鸡群大规模 死亡。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 本发明实施例中所用的"免疫量"是指提供针对流感疫苗的免疫剂量,主要取决于 以下因素:被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对 抗同样病毒的疫苗。
[0034] 本发明实施例中所述的"单苗"是指仅含有免疫量的禽多杀性巴氏杆菌抗原、新城 疫抗原或亚型禽流感抗原中的一种疫苗,"二联苗"是指仅含有免疫量的禽多杀性巴氏杆 菌抗原与新城疫抗原二联苗、免疫量的禽多杀性巴氏杆菌抗原与H9亚型禽流感抗原二联 苗、新城疫抗原与亚型禽流感抗原二联苗中的一种疫苗,可用于评价本发明中疫苗组合 物的免疫效力、三种疾病混合感染攻毒模型的建立、不同佐剂对疫苗组合物免疫效力。
[0035] 本发明实施例中,以禽多杀性巴氏杆菌C48-2株、新城疫抗原LaSota株、H9亚型 禽流感抗原HL株为例,对疫苗组合物的免疫效力、三种疾病混合感染攻毒模型的建立、不 同佐剂对疫苗组合物免疫效力进行解释说明。
[0036] 本发明的实施方式中使用的禽多杀性巴氏杆菌C48-2株,该实施方式无论在任何 情况下均不构成对本发明的限定。
[0037] 本发明的实施方式中使用的新城疫抗原LaSota株,该实施方式无论在任何情况 下均不构成对本发明的限定。
[0038] 本发明的实施方式中使用的H9亚型禽流感抗原HL株,该实施方式无论在任何情 况下均不构成对本发明的限定。
[0039] 本发明的实施方式中针对禽多杀性巴氏杆菌、新城疫、H9亚型禽流感三种病毒所 使用的的攻毒株分别为禽多杀性巴氏杆菌C48-1株(保藏号为CVCC44801,保藏于国家兽医 微生物菌种保藏管理中心)、新城疫北京株(保藏号为CVCC AV1611,保藏单位为国家兽医微 生物菌种保藏管理中心)、即亚型禽流感HL株。
[0040] 下述实施例中所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料, 若无特殊说明,均可从商业途径获得。
[0041] 实施例1禽多杀性巴氏杆菌、新城疫、H9亚型禽流感抗原的制备
[0042] I. 1生产用种子(毒种)的制备
[0043] I. I. 1禽多杀性巴氏杆菌生产用种子的制备
[0044] 一级种子的繁殖:将禽多杀性巴氏杆菌C48-2株接种于含0. 1%裂解血球全血马丁 肉汤中,置36-37°C培养24h,然后划线接种于含0. 1%裂解血球全血及4%健康动物血清的 改良马丁琼脂平板上,36-37°C培养16-22h,挑选5个以上典型菌落,接种血琼脂斜面若干 支,置36-37°C培养18-24h,作为一级种子。在2-8°C保存,保存期不超过14天。在培养基 上传代,不超过5代。
[0045] 二级种子繁殖:取一级种子接种于含0. 1%裂解血球全血马丁肉汤中,置36_37°C 培养24h,按《中国兽药典》附录进行纯粹检验,合格后作为二级种子,在2-8°C保存,不超过 4天。
[0046] I. 1. 2新城疫生产用毒种制备
[0047] 将新城疫La Sota株毒种用无菌生理盐水作KT3-KT4稀释,经尿囊腔接种10日龄 SPF鸡胚,每胚0. lml。选择接种后72-120h之间死亡且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液 (尿囊液及羊水),装于无菌容器内。将检验无菌合格且对1%鸡红细胞悬液凝集价> 1:512 (微量法)的鸡胚液混合,定量分装,冷冻保存。注明收获日期、毒种代数等。
[0048] I. I. 3H9亚型禽流感生产用毒种制备
[0049] 将H9亚型禽流感毒种HL株用无菌生理盐水作KT3-KT4稀释,经尿囊腔接种10日 龄SPF鸡胚,每胚0. lml。置37°C继续孵育,选接种后48-96h之间死亡且病痕明显的鸡胚, 分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水),装于无菌容器内。将检验无菌且对1%鸡红细胞悬液凝集 价>1:512 (微量法)的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存。注明收获日期、毒种代 数等。
[0050] 1. 2制苗用菌液(病毒液)制备
[0051] 1. 2. 1禽多杀性巴氏杆菌制苗用菌液制备
[0052] 采用生物发酵罐进行禽多杀性巴氏杆菌A型菌株菌液的制备。将鉴定合格的二级 种子液以1%_2%的接种量接种于发酵罐发酵培养基,37°C,200rpm,通过不断增大通气量和 流加补料的方式发酵培养14_20h,收获菌液。取样进行活菌计数,并按现行《中国兽药典》 附录进行纯粹检验,应纯粹。
[0053] 1. 2. 2新城疫制苗用病毒液的制备
[0054] 取生产用毒种,用无菌生理盐水作KT3-KT4稀释,经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚, 每胚0. lml,置37°C继续孵育,鸡胚接种后,每日照蛋1次,将48h前死亡的鸡胚弃去。此 后,每4h照蛋1次,死亡的胚随时取出,直至120h,不论死亡与否,全部取出,置于2-8°C冷 却12-24h后,无菌操作收获鸡胚液。
[0055] I. 2. 3H9亚型禽流感制苗用病毒液的制备
[0056] 取生产用毒种,用无菌生理盐水作KT3-KT4稀释,经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚, 每胚0. lml,置37°C继续孵育,鸡胚接种后,每日照蛋1次,将48h前死亡的鸡胚弃去。此 后,每4h照蛋1次,死亡的胚随时取出,直至96h,不论死亡与否,全部取出,置于2-8°C冷却 12-24h后,无菌操作收获鸡胚液。
[0057] 1. 3菌液(病毒液)的浓缩
[0058] 将纯粹性检验合格的菌液及无菌检验合格的病毒液采用超滤浓缩技术分别进行 浓缩,浓缩后各抗原含量见表1。取浓缩后样品样分别作做纯粹性检验及无菌检验,应合格。 [0059] 表1抗原浓缩后含量
[0060]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包括:免疫量的禽多杀性巴氏杆菌抗原、免疫量 的新城疫抗原、免疫量的!19亚型禽流感抗原;以及兽医学上可接受的一种或多种佐剂。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原为灭活形式、 改良的活的形式或减毒形式的禽多杀性巴氏杆菌抗原;所述新城疫抗原为灭活形式、改良 的活的形式或减毒形式的新城疫抗原;所述的亚型禽流感抗原为灭活形式、改良的活的 形式或减毒形式的亚型禽流感抗原。
3. 根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原为灭活的禽 多杀性巴氏杆菌C48-2株全菌抗原,所述新城疫抗原为灭活的新城疫病毒LaSota株全病毒 抗原,所述即亚型禽流感抗原为灭活的H9亚型禽流感抗原HL株全病毒抗原。
4. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述佐剂包括水性佐剂、蜂胶佐剂中的一 种或几种;优选地,所述水性佐剂为Gel佐剂。
5. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述佐剂为疫苗组合物的5%-25%V/V,优 选为 10%-15%V/V。
6. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为 彡5X109CFU/ml ;所述新城疫抗原含量为彡6X 108 5EID5Q/ml ;所述H9亚型禽流感抗原含量 为彡 6X 108 5EID5Q/ml。
7. 根据权利要求6所述的疫苗组合物,其中,所述禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为 lX10nCFU/ml ;所述新城疫抗原含量为7. 5X 108 5EID5(l/ml ;所述H9亚型禽流感抗原含量为 7. 5X108_5EID5(l/ml。
8. -种制备权利要求1?7任一项所述疫苗组合物的方法,所述方法包括: (1) 分别培养增殖所述禽多杀性巴氏杆菌、所述新城疫病毒、所述即亚型禽流感病毒, 分别灭活; (2) 按比例混合所述禽多杀性巴氏杆菌全菌抗原、所述新城疫全病毒抗原、所述H9亚 型禽流感全病毒抗原,并加入佐剂。
9. 根据权利要求8所述的方法,其中,所述抗原比例为禽多杀性巴氏杆菌抗原含量为 彡5 X 109CFU/ml ;所述新城疫抗原含量为彡6 X 108_ 5EID5Q/ml ;所述H9亚型禽流感抗原含量 为彡 6X 108 5EID5Q/ml。
10. 权利要求1?7所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽多杀性巴氏杆菌、新城 疫、H9亚型禽流感感染的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/102GK104415330SQ201310412615
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司