一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系及其制备方法和应用，所述纳米管缓释体系包括钛合金植入体，采用阳极氧化的方法在钛合金植入体表面制备二氧化钛纳米管涂层，并在钛合金植入体上负载生长因子。本发明的优点在于：（1）本发明通过真空抽吸这一简单有效的方法提高纳米管装载药物量；（2）本发明还提供了一种rhPDGF-BB纳米管缓释体系，可以显著促进骨质疏松状态下骨整合，rhPDGF-BB已被FDA批准可以用于临床骨再生治疗，对于该缓释体系的临床应用提供了可能；（3）包括纳米管制备在内，本发明不需专门、复杂和昂贵的设备，操作流程简单，有利于推广使用。
【专利说明】一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨组织再生和骨整合领域，具体地讲，涉及一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]骨质疏松是由于骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，导致骨密度降低和骨质破坏，严重影响骨修复及骨整合的速度和质量；由于尚缺乏有效的手段解决这一问题，骨质疏松症仍被列为牙种植手术的禁忌症。随着纳米技术的不断发展和成熟，多种纳米修饰涂层已被用于提高钛种植体表面的成骨诱导性能，其中通过阳极氧化技术制备的纳米管涂层不仅具有明显的调控干细胞成骨分化的能力，而且在骨质疏松动物体内还具有一定的促进骨整合的作用。为了进一步提高钛表面纳米管涂层的修复效果，尚可借助纳米管的中空管状结构及高比表面积进行药物投递来协同促进骨整合，然而该方面研究尚未见文献报道。
[0003]可用于促进骨整合的生长因子包括重组人血小板源生长因子(rhTOGF-BB)、骨形态发生蛋白(BMPs)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管表皮生长因子(VEGF)、Nel样I型分子等，目前常采用直接物理吸附或壳聚糖等材料包被等方式将生长因子固载于种植体表面，然而这些方法存在以下缺点:缓释效果差，常存在暴发性释放；生长因子的生物活性无法长期维持；额外添加缓释材料还可能覆盖种植体表面的微纳米结构并消除其生物学性倉泛。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的在于提供一种生长因子纳米管缓释体系。
[0005]本发明的第二个目的在于提供一种提高纳米管装载药物量的生长因子纳米管缓释体系的制备方法。
[0006]本发明的第三个目的在于提供生长因子纳米管缓释体系在制备促进骨整合材料中的应用。
[0007]本发明的第四个目的在于提供真空抽吸技术在制备应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系中的应用。
[0008]为实现本发明第一个发明目的，公开以下技术方案:一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系，包括钛合金植入体，其特征在于，采用阳极氧化的方法在钛合金植入体表面制备二氧化钛纳米管涂层，并在钛合金植入体上负载生长因子。
[0009]作为一个优选方案，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhTOGF-BB、骨形态发生蛋白BMPs、碱性成纤维生长因子bFGF、血管表皮生长因子VEGF和Nel样I型分子中的一种或几种。
[0010]作为一个优选方案，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhroGF-BB。
[0011]为实现本发明第二个发明目的，公开以下技术方案:一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:
将钛合金植入体表面进行直径为3(Tl00的纳米管修饰，然后浸泡于装有浓度为50^300 μ g/ml的生长因子溶液的器皿中，将器皿放入真空抽气泵中，抽吸10-20分钟后取出钛合金植入体，置于4°C自然干燥。
[0012]作为一个优选方案，抽吸时间为10分钟。
[0013]作为一个优选方案，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhTOGF-BB、骨形态发生蛋白BMPs、碱性成纤维生长因子bFGF、血管表皮生长因子VEGF和Nel样I型分子中的一种或几种。
[0014]作为一个优选方案，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhH)GF-BB。
[0015]为实现本发明第三个发明目的，公开以下技术方案:一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系在制备促进骨整合材料中的应用。
[0016]为实现本发明第四个发明目的，公开以下技术方案:真空抽吸技术在制备应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系中的应用。
[0017]本发明对真空抽吸条件下纳米管的生长因子(rhPDGF-BB为例)装载量、缓释特性以及蛋白生物活性进行了检测；在体外，观察该缓释体系对骨质疏松大鼠来源骨髓干细胞的作用效果；在体内，将钛植入体植入骨质疏松大鼠股骨内，评估骨整合效果。研究结果表明:(I)真空抽吸提高了纳米管对rhPDGF-BB的装载量；(2) rhPDGF-BB在体外可以缓慢释放长达14天之久并且仍保持生物活性；(3)装载rhTOGF-BB的纳米管涂层促进了干细胞的粘附、增殖和成骨分化活性；(4)装载rhTOGF-BB的纳米管涂层促进了骨质疏松状态下骨整八口 ο
[0018]本发明的优点在于:(I)本发明通过真空抽吸这一简单有效的方法提高纳米管装载药物量；(2)本发明还提供了一种生长因子(rhPDGF-BB为例)纳米管缓释体系，可以显著促进骨质疏松状态下骨整合，rhPDGF-BB已被FDA批准可以用于临床骨再生治疗，对于该缓释体系的临床应用提供了可能；(3)包括纳米管制备在内，本发明不需专门、复杂和昂贵的设备，操作流程简单，有利于推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为真空抽吸促进rhH)GF-BB负载于纳米管的SEM图(A组)，未经过真空抽吸的自然吸附组作为对照(B组)。
[0020]图2为载药二氧化钛纳米管体外缓释曲线(a)，红色方框所示区间内缓释得到的rhPDGF-BB仍保持其生物活性，可以激活骨髓干细胞Erk和Akt通路(b)。
[0021]图3通过IntegrinP I免疫突光检测骨质疏松大鼠骨髓干细胞在不同涂层表面的粘附情况(对照组为未装载药物的纳米管涂层)。
[0022]图4通过Edu检测骨质疏松大鼠骨髓干细胞在不同涂层表面的增殖情况。
[0023]图5通过OCN免疫荧光检测骨质疏松大鼠骨髓干细胞在不同涂层表面的成骨分化情况。
[0024]图6为骨质疏松大鼠股骨内种植实验X线结果。
[0025]图7为骨质疏松大鼠股骨内种植实验结果，Ca)苦味酸-品红染色，(b)骨-种植体结合率，(C)拔出试验结果(★★, P < 0.01)。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0027]实施例1.钛片表面纳米管修饰及药物装载步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压20V)方法作用30分钟，制备出直径70nm左右的纳米管涂层。
[0028]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，使用医用灭菌水将其稀释为50 μ g/ml的工作浓度，吸取50 μ I该工作溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0029]实施例2.钛片表面纳米管修饰及药物装载步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压20V)方法作用30分钟，制备出直径70nm左右的纳米管涂层。
[0030]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，使用医用灭菌水将其稀释为100 μ g/ml的工作浓度，吸取50 μ I该工作溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0031]实施例3.钛片表面纳米管修饰及药物装载步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压20V)方法作用30分钟，制备出直径70nm左右的纳米管涂层。
[0032]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，吸取50 μ I该溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0033]实施例4.钛片表面纳米管修饰及药物装载步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压10V)方法作用30分钟，制备出直径30nm左右的纳米管涂层。
[0034]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，使用医用灭菌水将其稀释为100 μ g/ml的工作浓度，吸取50 μ I该工作溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0035]实施例5.钛片表面纳米管修饰及药物装载步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于(乙二醇+0.25 wt%氟化铵+lvol%水)配比电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压50V)方法作用3小时，制备出直径10nm左右的纳米管涂层。
[0036]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，使用医用灭菌水将其稀释为100 μ g/ml的工作浓度，吸取50 μ I该工作溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0037]实施例6.rhPDGF-BB纳米管缓释体系在体外的缓释特性及生物学性能步骤一、钛片表面纳米管修饰
规格为10 X 10 X I mm大小的钛合金材料，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压20V)方法作用30分钟，制备出直径70nm左右的纳米管涂层。
[0038]步骤二、真空抽吸促进钛片表面纳米管装载rhTOGF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhPDGF-BB原溶液的浓度为300 μ g/ml，使用医用灭菌水将其稀释为100 μ g/ml的工作浓度，吸取50 μ I该工作溶液滴附于步骤一中制备的纳米管涂层修饰钛表面，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛片置于4°C过夜自然干燥。
[0039]蛋白在纳米管表面的粘附情况见附图1，真空抽吸实验组(A组)钛片表面的蛋白吸附量明显高于自然吸附组(B组)，并且在A组钛表面，由于真空抽吸作用，可见rhTOGF-BB蛋白颗粒突入纳米管腔内(红色箭头所示)。
[0040]步骤三、rhPDGF-BB的缓释曲线测定
将实验例二中制备的载有rhH)GF-BB的钛片置于24孔板中，每孔加入Iml PBS浸没钛片并放置于37°C细胞培养箱中，分别在1、2、4、8、12和24小时以及2、4、7和14天时，收集PBS浸提液并更换新的PBS。将收集的PBS浸提液暂时冻存于-30°C保存，待各时间点样品收齐后，使用rhH)GF-BB特异性Elisa试剂盒(购买自BD公司)，按照说明书操作检测浸提液中rhH)GF-BB的浓度，并绘制rhH)GF-BB的缓释曲线。
[0041]rhPDGF-BB的缓释曲线见附图2a，真空抽吸实验组(A组)的蛋白装载量明显高于自然吸附组(B组)，约为其2倍。
[0042]步骤四、负载rhH)GF-BB的活性检测
骨髓干细胞取自卵巢摘取大鼠，细胞接种于6孔板中，待细胞生长至90%汇合，使用步骤一中第14天收取的浸提液作用于该细胞15分钟,提取细胞总蛋白，进行Western Blot实验，分别检测Erk、p-Erk、Akt和ρ-Akt的表达情况，Erk和Akt两条通路是rhFOGF-BB发挥生物学效应的两条经典信号通路。
[0043]结果上述两条通路均被第14天收取的浸提液激活(见附图2b)，提示纳米管所负载的rhH)GF-BB可长期保存生物活性。
[0044]步骤五:rhH)GF-BB纳米管缓释体系在体外对骨质疏松大鼠骨髓干细胞的作用效果
一、细胞粘附能力检测:将载有rhH)GF-BB的钛片置于24孔板中，将I ml骨质疏松大鼠骨髓干细胞悬液接种于孔中；4小时后，吸弃培养液并用PBS洗两遍,使用4 wt%多聚甲醛溶液于4°C固定30分钟；使用0.1% Triton X-100溶液于37°C处理30分钟；山羊血清封闭30分钟；加入integrin β I 一抗，4°C孵育过夜,随后加入DyLight 549标记红色二抗；细胞骨架使用FITC-Phalloidin于37°C染色2小时；细胞核使用DAPI溶液于室温复染5分钟。突光显微镜镜下观察。
[0045]实验结果见附图3,钛表面负载rhFOGF-BB促进了 integrin β I的高表达,促进了细胞早期粘附，并且真空抽吸实验组(Α组)的效果优于自然吸附组(B组)。
[0046]二、细胞增殖能力检测:将载有rhH)GF-BB的钛片置于24孔板中，将I ml骨质疏松大鼠骨髓干细胞悬液接种于孔中；DMEM培养10天后，使用Cell-Light TM Edu试剂盒(购买自广州市锐博生物科技有限公司)，按照其说明书进行如下操作:Edu标记，细胞固定化，Edu染色以及细胞核复染，随后荧光显微镜镜下观察。
[0047]实验结果见附图4，钛表面负载rhH)GF-BB提高了 Edu细胞的阳性率，促进了细胞增殖，并且真空抽吸实验组(A组)的效果优于自然吸附组(B组)。
[0048]三、细胞成骨分化能力检测:将载有rhH)GF-BB的钛片置于24孔板中，将I ml骨质疏松大鼠骨髓干细胞悬液接种于孔中；吸弃培养液并用PBS洗两遍，使用4 wt%多聚甲醛溶液于4°C固定30分钟；使用0.1% Triton X-100溶液于37°C处理30分钟；山羊血清封闭30分钟；加入OCN—抗，4°C孵育过夜，随后加入DyLight 549标记红色二抗；细胞核使用DAPI溶液于室温复染5分钟。荧光显微镜镜下观察。
[0049]实验结果见附图5，钛表面负载rhH)GF-BB促进了 OCN的高表达，促进了细胞成骨分化，并且真空抽吸实验组(A组)的效果优于自然吸附组(B组)。
[0050]实施例7.rhPDGF-BB纳米管缓释体系在体内骨质疏松大鼠股骨内种植骨整合中的作用效果
步骤一、钛棒表面纳米管修饰
规格为直径2mm、长度8mm大小的钛合金钛棒，放置于乙醇溶液中超声清洗30分钟；然后换成去离子水继续超声清洗30分钟，重复该操作2遍；将清洗后的钛片置于5 wt%草酸溶液中100° C条件下酸蚀2小时；最后置于1.0 wt%氢氟酸电解液中采用恒电流直流阳极氧化(电压20V)方法作用30分钟，制备出直径70nm左右的纳米管涂层。
[0051]步骤二、真空抽吸促进钛棒表面纳米管装载rhH)GF-BB
商品化的GEM 21S试剂盒中，rhH)GF-BB原溶液的浓度为SOOyg/ml，使用医用灭菌水将其稀释为工作浓度，将步骤一中制备的纳米管涂层修饰的钛棒浸泡于100 μ g/ml的rhPDGF-BB工作液中，放入真空抽气泵中抽吸10分钟，将钛棒取出置于4°C过夜自然干燥。
[0052]步骤三、rhPDGF-BB纳米管缓释钛棒植入骨质疏松大鼠股骨
骨质疏松大鼠模型建立以及股骨内钛种植体植入手术过程参见之前已发表文献(Kurth AHA, Eberhardt C，Miiller S，Steinacker M, Schwarz M, Bauss F.The bisphosphonate ibandronate improves implant integrat1n in osteopenicovariectomized rats.Bone.2005; 37:204-10.)?大鼠双侧股骨按照随机原则分别植入以下三组不同材料:A组(真空抽吸负载rhH)GF-BB实验组，n=12), B组(自然吸附rhPDGF-BB实验组，n=12)，对照组(未负载药物的纳米管涂层组，n=12)。
[0053]步骤四、种植体-骨结合率测定
术后8周，大鼠安乐处死，其中每组随机选择6个标本固定于福尔马林固定液中；固定后行X线影像学检测(结果见附图6);随后进行梯度酒精脱水，依次浸入50%，75%，85%，95%和100%两次各24小时，二甲苯透明处理8小时，渗透液(二甲苯与包埋液I以1:1体积混合配制)中室温浸泡24小时，包埋液I中4°C浸泡24小时，最后放置于包埋液II (甲基苯烯酸甲酯)中，经真空抽气处理后放置于37°C硬化；待包埋液完全硬化后，取出标本，使用SP1600硬组织切片机切片，切片厚度约150 μ m，最终打磨抛光至40 μ m左右，再进行苦味酸品红染色(结果见附图7a);镜下拍照、计算种植体-骨结合率(BIC)。
[0054]实验结果见附图7b，对照组的BIC指数为41.32 土 4.79%，B组的BIC指数为53.65 土 5.18%，A组的结果高达65.08 土 6.08%，各组之间均存在显著性差异ip <0.01)。
[0055]步骤五、拔出实验检测
术后8周，大鼠安乐处死后每组余下的6个标本冻存于_80°C，小心修剪标本使其暴露钛棒两端，使用自凝塑料为每个标本制备个性化支架，固定标本并使钛棒长轴与水平面垂直。使用万能材料试验机进行测试，加载速度设置为lmm/min，其应力峰值记为拔出试验结果用以表示种植体结合强度。
[0056]实验结果见附图7c，对照组的应力峰值为50.12 土 5.28 N，B组的应力峰值为65.10 土 8.26 N，A组的结果高达94.97 土 9.92 N，各组之间均存在显著性差异(/7 <0.01)。
[0057]综上所述，真空抽吸提高了纳米管对rhH)GF-BB的装载量；rhH)GF-BB在体外可以缓慢释放长达14天之久并且仍保持生物活性；装载rhTOGF-BB的纳米管涂层促进了干细胞的粘附、增殖和成骨分化活性；装载rhH)GF-BB的纳米管涂层促进了骨质疏松状态下骨整入口 ο
[0058]本发明不仅适用于rhH)GF-BB的装载与缓释，对BMPs、bFGF、VEGF和Nell-1等生长因子也同样适用。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如扩大真空抽吸促进药物负载的应用范围，包括使用其它具有微纳米级管状、孔隙状和凹坑状类等结构的载体，以及使用其它因子、药物、离子溶液等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系，包括钛合金植入体，其特征在于，采用阳极氧化的方法在钛合金植入体表面制备二氧化钛纳米管涂层，并在钛合金植入体上负载生长因子。
2.根据权利要求1所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系，其特征在于，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhH)GF-BB、骨形态发生蛋白BMPs、碱性成纤维生长因子bFGF、血管表皮生长因子VEGF和Nel样I型分子中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系，其特征在于，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhH)GF-BB。
4.权利要求1所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 将钛合金植入体表面进行直径为3(Tl00的纳米管修饰，然后浸泡于装有浓度为50^300 μ g/ml的生长因子溶液的器皿中，将器皿放入真空抽气泵中，抽吸10-20分钟后取出钛合金植入体，置于4°C自然干燥。
5.根据权利要求4所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系的制备方法，其特征在于，抽吸时间为10分钟。
6.根据权利要求4或5所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系的制备方法，其特征在于，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhH)GF-BB、骨形态发生蛋白BMPs、碱性成纤维生长因子bFGF、血管表皮生长因子VEGF和Nel样I型分子中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系的制备方法，其特征在于，所述生长因子是重组人血小板源生长因子rhH)GF-BB。
8.权利要求1一3任一所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系在制备促进骨整合材料中的应用。
9.真空抽吸技术在制备权利要求1一3任一所述的一种应用于骨整合的生长因子纳米管缓释体系中的应用。
【文档编号】A61L31/16GK104436313SQ201310414679
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】张文杰, 蒋欣泉 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院