海南冬青总三萜提取物及其制备方法与用途
【专利摘要】本发明公开了一种海南冬青总三萜提取物，它是从冬青科冬青属植物海南冬青叶中提取分离得到的海南冬青总三萜的提取物。经药效学及毒理学试验证明，该提取物对肿瘤具有较好的治疗效果，有效成分较明确，有利于保证药物使用的安全性和有效性。有效组分提取得率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产，具有广阔的医药学工业应用前景。
【专利说明】海南冬青总三萜提取物及其制备方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种海南冬青总三萜类的制备方法，以及该方法制得的提取成分在恶性肿瘤治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症(恶性肿瘤)是一种严重威胁人类健康的疾病。主要是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成异常病变，其恶性程度高，治愈率低，死亡率高。目前，癌症的临床治疗主要采用手术治疗与化疗，化疗药物在杀伤癌细胞的同时对正常细胞的杀伤作用亦很强，因此毒性大、不良反应严重。本专利应用冬青科冬青属植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)干燥叶片的主要有效部位总三職(total triterpenoid),通过考察提取用乙醇浓度、加量、提取时间与温度对所得总浸膏的影响，综合提取率及其总三萜含量确定出最佳制备方案。确立药材和有效部位总三萜质量标准并进行抗肿瘤药效研究，将其应用于肿瘤细胞增殖、荷瘤小鼠，发现其具有多靶点作用、疗效好，毒副作用小，具有良好的抗恶性肿瘤应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于优化海南冬青提取工艺，完善了药材和有效部位总三萜的质量标准。本方法可以从提取工艺、富集工艺等方面提高药材利用率以及总三萜的含量；同时，提取方法的重复性及稳定性好；通过试验确立了药材和有效部位总三萜的质量标准，进行药效学实验，从而保证了疗效的稳定性。
[0004]本方法采用的技术方案如下:
[0005]海南冬青饮片用乙醇`回流提取，合并提取液，回收乙醇；浸膏加乙醇后离心,沉淀部分加乙醇溶解，再以石油醚萃取脱色，下层溶液减压浓缩得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得海南冬青总三萜有效部位。
[0006]提取用的乙醇为高浓度醇(50%以上)。
[0007]洗涤所用的溶剂为水或浓度30%以下乙醇。
[0008]本发明还公开了所述海南冬青总三萜提取物在制备治疗恶性肿瘤的药物中应用。
[0009]本发明优选技术方案为:
[0010]取海南冬青药材5kg，用乙醇浸泡24小时，加热回流2次，每次2h。合并提取液，减压回收乙醇，浓缩得稠浸膏，以4000r.rniiT1离心lOmin，分离得出沉淀，将沉淀部分以乙醇溶解，再用适量的石油醚萃取2次脱色，收集下层溶液，用水洗涤后，减压浓缩，自然晾干，粉碎，过60目筛，得海南冬青总三萜(有效部位)粉末580g。平均得率11.6%。
[0011]上述发明中的干燥方法为减压干燥。
[0012]上述海南冬青总三萜具有抑制恶性肿瘤细胞增殖，对整体荷瘤小鼠的抑瘤作用强，能用于制备成抗肿瘤药物，可以制成片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、注射剂及粉针剂等各种剂型。[0013]海南冬青提取物总三萜含量测定:
[0014]海南冬青总三萜的主要成分为冬青素(含量达15.3%)，下面以冬青素作为对照品检测总三萜含量。
[0015]对照品溶液制备精密称取105°C下干燥至恒重的冬青素作为对照品2mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得(每Iml含冬青素0.08mg)。
[0016]标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液0.2,0.3,0.4,0.5,0.6ml，分别置具塞试管中，水浴中挥发去除溶剂。冷却，准确加入0.4ml香草醛-冰醋酸溶液与高氯酸，混匀，加塞密封。于70°C恒温水浴加热，取出放冷，加入冰醋酸，分光光度计540nm处测吸光度。溶剂为空白对照管，以吸光度作纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0017]含量测定供试品溶液:取海南冬青总三萜10mg，置25ml容量瓶，加甲醇溶解并定容，即供试品溶液。精密量取供试品溶液0.4ml按标准曲线制备方法，自“分别置具塞试管，水浴挥发去溶剂”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中冬青素的含量，计算含量，得出总三萜含量为58.6%。
[0018]以HPLC法测得冬青素含量为15.3% (三次试验数据的平均值)。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果是:经药效学试验证明，海南冬青总三萜具有较好的抑制多种恶性肿瘤的作用，有效成分明确。其主要有效成分为总三萜，且总三萜含量较高，杂质较少，可减少服用量，在一定程度上相应减轻了副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。本发明的提纯工艺中，海南冬青药材用乙醇提取，成本低，而且乙醇可回收循环使用，成本低；再则海南冬青为茶饮植物，几无毒性，具有良好的抗肿瘤效果，安全有效。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明目的、技术方 案和优点更加清晰，一下结合实施例对本发明进行详细地说明。
[0021]实施例1
[0022]取海南冬青药材5kg，用乙醇浸泡24小时，加热回流，每次2h，共提取2次，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩成浸膏，4000r ?mirT1离心IOmin,将沉淀部分以乙醇溶解,再以石油醚萃取、脱色，将下层溶液水洗后，减压浓缩自然晾干，粉碎，过筛，得海南冬青总三萜有效部位粉末580g。平均得率11.6%。
[0023]实施例2
[0024]海南冬青总三萜抑制肿瘤细胞生长增殖的生物活性
[0025]表1.海南冬青总三萜对人SGC7901胃癌细胞增殖(48h)的抑制作用Cf =.s.n=4)
总三 SiHepGlii ,
g(ug/ml)_ODg_(%)..150.7^0.0202X4
[0026]300.71=0,020*29.3.600.53=0.020*46.7.1200.51=0.030*48.9-
2400.44=0.030*55.l.+[0027]注:与阴性对照组比较，*P < 0.05
[0028]如表1所示，海南冬青总三萜与SGC7901胃癌细胞作用48h后，随药物浓度增加抑制率上升，在30 ii g/ml、60 u g/ml、120 u g/ml和240 u g/ml浓度下对7901细胞增殖有明显抑制作用，显 示剂量依赖关系。
【权利要求】
1.一种海南冬青总三萜提取物，其特征在于通过下述方法制得:海南冬青药材用乙醇回流提取，合并提取液，回收乙醇；浸膏加乙醇后离心，沉淀部分以乙醇溶解，再以醚类萃取至脱色，收集下层溶液，洗涤后减压浓缩，自然晾干，粉碎，过60目筛，得海南冬青总三萜。
2.一种制备权利要求1所述海南冬青总三萜提取物的方法，其特征在于: 海南冬青药材用乙醇回流提取，合并提取液，回收乙醇；浸膏加乙醇后离心，沉淀部分以乙醇溶解，再以醚类萃取至脱色，收集下层溶液，洗涤后减压浓缩，自然晾干，粉碎，过60目筛，得海南冬青总三萜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:提取所用的乙醇为浓度50%以上乙醇。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:洗涤所用的溶剂为水或浓度30%以下乙醇。
5.权利要求1所述海南冬青总三萜提取物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物制剂形式是片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、注射剂及粉针剂。
【文档编号】A61K36/185GK103494846SQ201310434765
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】孙云, 王强, 杨昊, 刘畅, 杨杰 申请人:扬州大学