一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物及制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，所述复合物是由聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）和具有肿瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物（缩写为PLA-PEG-iNGR），三者的摩尔比例为1:1:1。本发明还提供该聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物的制备方法，可用于制备具有肿瘤穿透性能的靶向胶束或纳米粒，提高其在肿瘤靶向性和肿瘤穿透性。
【专利说明】一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物及制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属药物制剂领域，涉及一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物PLA-PEG-1NGR,具体说是一种具有肿瘤穿透性能的靶向聚合物材料及制备和应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病，近年来其发病率呈明显上升趋势。目前临床上对肿瘤的常规治疗方法是切除肿瘤原发灶和实施淋巴清扫之后，进行全身化疗或放疗。但是，外科手术不能彻底清除肿瘤细胞和肿瘤转移淋巴结，易导致肿瘤复发，或者不适用于某些特殊病人或特殊部位的肿瘤；放疗往往会引起患者严重的局部皮肤反应、血象变化、局部粘膜反应等；传统化疗药物静注给药后，对肿瘤组织无选择性，具有严重的全身性毒副作用。肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞上表达有一系列特异性受体，利用其配体修饰生物相容性材料而制备得到的肿瘤靶向材料，由于其在体内可主动寻靶定位至肿瘤组织而受到研究者的广泛关注。但是由于肿瘤靶向性能差、药效提高不明显等问题，目前绝大部分肿瘤靶向材料仍未进入临床应用。因此，研究开发高性能肿瘤靶向材料、提高对肿瘤的靶向性能和治疗效果迫在眉睫。
[0003]iNGR多肽是近期设计出来的一种肿瘤穿透肽，它由肿瘤血管靶向多肽NGR连接肿瘤穿透序列而成。NGR与iNGR均可以靶向至肿瘤血管，但后者与向前相比的优势在于其能渗透进入肿瘤组织。iNGR与NGR均为血管内皮细胞上⑶13的特异性配体，此外，iNGR通过降解后，还可与神经毡蛋白-1受体特异性结合，从而介导其肿瘤穿透行为。目前尚未见利用iNGR多肽修饰的靶向材料的报道。
[0004]本发明采用iNGR修饰PLA-PEG，合成具有穿透肿瘤血管和肿瘤组织能力的肿瘤靶向材料，为制备具有 肿瘤穿透性能的药物载体提供物质基础。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的不足，本发明提供一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物及制备和应用。
[0006]一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述复合物是由聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和具有肿瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物(缩写为PLA-PEG-1NGR)，三者的摩尔比例为1:1:1。
[0007]所述的肿瘤穿透肽iNGR的氨基酸序列为CRNGRGPDC，其使复合物具有了肿瘤穿透性能。
[0008]所述的聚乙二醇的重均分子量为1800~3800。
[0009]所述的聚乳酸的重均分子量为1000~5000。
[0010]所述的肿瘤穿透肽通过共价键形式与聚乙二醇-聚乳酸连接而成的复合物。
[0011]所述聚乳酸-聚乙二醇提供一个马来酰亚胺基，肿瘤穿透肽提供一个游离巯基，两者发生加成反应而连接成共价复合物。[0012]一种制备所述聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤是:
(1)采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的祀向多肽C-1NGR(2Acm)(氨基酸序列为C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))，将其溶于ρΗ7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中备用；
(2)取马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸复合物(PLA-PEG-Mal)溶于乙腈中，旋转蒸发成膜，加入PBS (pH 8.0，0.2M)在37°C水化形成胶束；加入过量的C-1NGR (2Acm)并反应过夜，透析(分子量3kDa)去除过量的多肽与盐，冷冻干燥，得到PLA-PEG-1NGR (2Acm)；
(3)将PLA-PEG-1NGR(2Acm)其溶于甲醇中，加入柠檬酸溶液和IM的盐酸溶液，后逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应2hr，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类(截留分子量3.5kDa，透析介质为水)，冷冻干燥得到PLA-PEG-1NGR。
[0013]一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物在制备胶束、纳米粒等药物载体中的应用。
[0014]上述的PLA-PEG-1NGR复合物可用于制备具有肿瘤穿透性能的药物载体，如胶束、纳米粒等，这些药物载体静脉注射进入肿瘤动物模型体内之后，与普通药物载体相比，表现出良好的肿瘤靶向性和肿瘤穿透性能，其在肿瘤部位分布明显增加，免疫荧光分析结果显示能穿透肿瘤血管渗透进入整个肿瘤组织。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]附图1、PLA-PEG-1NGR的核磁图谱。
[0016]图中I为P LA-PEG-Mal的核磁图谱，2为PLA-PEG-1NGR的核磁图谱，由图可看出，I图显示出马来酰亚胺峰，而2图中该峰消失，而其余峰基本保持不变，显示PLA-PEG-Mal中的马来酰亚胺基团已与iNGR发生反应。
[0017]附图2、利用PLA-PEG-1NGR制备得到的荧光素胶束被U87肿瘤细胞摄取照片。
[0018]利用PLA-PEG-1NGR制备得到的荧光素胶束与普通的荧光素胶束于37°C分别与U87肿瘤细胞作用2小时后的荧光显微照片，由图可知，肿瘤细胞对PLA-PEG-1NGR修饰胶束的摄取量远大于普通胶束。
【具体实施方式】
[0019]通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0020]实施例1:复合物PLA-PEG-1NGR的合成、纯化和表征。
[0021]将4-甲基二苯基甲胺树脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脱保护I分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶剂为DMF)中，室温反应20min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应连接所有氨基酸。反应结束后洗涤树脂、TFA脱保护基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应I小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得iNGR(2Acm)(序列为 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))纯品。将 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:2000 ;PEG分子量:2000)溶解在IOml乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成胶束。8h内加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反应过夜，HPLC检测反应。过量的iNGR (2Acm)通过透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，冻干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 柠檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml盐酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应2hr，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类(截留分子量3.5kDa，透析介质为水)，冷冻干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征结构，结果显示，PLA-PEG-Mal图谱在6.67ppm处显示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR图谱上此峰消失，说明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0022]实施例2:复合物PLA-PEG-1NGR的合成、纯化和表征。
[0023]将4-甲基二苯基甲胺树脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脱保护I分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶剂为DMF)中，室温反应25min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应连接所有氨基酸。反应结束后洗涤树脂、TFA脱保护基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应I小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得iNGR(2Acm)(序列为 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))纯品。将 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:4000 ;PEG分子量:3500)溶解在IOml乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成胶束。8h内加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反应过夜，HPLC检测反应。过量的iNGR (2Acm)通过透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，冻干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 柠檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml盐酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM 碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应2hr，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类(截留分子量3.5kDa，透析介质为水)，冷冻干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征结构，结果显示，PLA-PEG-Mal图谱在6.67ppm处显示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR图谱上此峰消失，说明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0024]实施例3:复合物PLA-PEG-1NGR的合成、纯化和表征。
[0025]将4-甲基二苯基甲胺树脂(MBHA)用三氟乙酸(TFA)脱保护I分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU (溶剂为DMF)中，室温反应20min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应连接所有氨基酸。反应结束后洗涤树脂、TFA脱保护基，真空干燥后，放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应I小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得iNGR(2Acm)(序列为 C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))纯品。将 80mg PLA-PEG-Mal (PLA 分子量:5000 ;PEG分子量:3500)溶解在IOml乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入6ml PBSCpH 8.0,0.2M)在37°C水化形成胶束。8h内加入49.2mg C-C(Acm)RNGRGPDC(Acm)并反应过夜，HPLC检测反应。过量的iNGR (2Acm)通过透析(MWCO 3kDa, ]\^11丨口0代)除去，冻干得？1^^^6-丨吣1?(2Acm)。取 26mg PLA-PEG-1NGR (2Acm)溶于 5ml 甲醇中，加入 20ml 柠檬酸溶液(0.2M)和
2.5ml盐酸溶液(1M)，后逐滴加入5mM碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应2hr，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类(截留分子量3.5kDa，透析介质为水)，冷冻干燥得到PLA-PEG-1NGR。1H-NMR表征结构，结果显示，PLA-PEG-Mal图谱在6.67ppm处显示Mal的特征峰，而PLA-PEG-1NGR图谱上此峰消失，说明PLA-PEG-1NGR合成成功。
[0026]实施例4:荧光素标记胶束的制备及其体外肿瘤细胞摄取实验。
[0027]称取Img PLA-PEG-1NGR (PLA 分子量:5000 ；PEG 分子量:3500)、19mg PLA-mPEG(PLA分子量:5000 ;PEG分子量:2000)和0.5mg香豆素6，溶解在3ml乙腈中，37°C水浴，减压旋蒸成膜，室温真空干燥过夜，加入3ml生理盐水水化30min，0.22 μ m滤膜过滤，得到PLA-PEG-1NGR 胶束，备用；PLA_mPEG 胶束的制备，将 20mg PLA_mPEG(PLA 分子量:5000 ；PEG分子量:2000)和0.5mg香豆素6溶解在3ml乙腈中，成膜，其他同PLA-PEG-1NGR胶束的制备。两种胶束与肿瘤细胞共孵育2h，吸弃上清，PBS清洗，激光共聚焦显微镜观察细胞胶束摄取情况。结果显示普通胶束被摄取量较少，而iNGR修饰的胶束则被大量摄取，说明iNGR修饰的靶向材料PLA-PEG-1NGR赋予了胶束对肿瘤细胞良好的体外靶向性。
[0028]实施例5:荧光素标记胶束的制备及其体外肿瘤细胞摄取实验。
[0029]称取Img PLA-PEG-1NGR (PLA 分子量:4000 ；PEG 分子量:3500)、19mg PLA-mPEG(PLA分子量:4000 ;PEG分子量:2000)和0.2mg香豆素6，溶解在3ml乙腈中，37°C水浴，减压旋蒸成膜，室温真空干燥过夜，加入3ml生理盐水水化30min，0.22 μ m滤膜过滤，得到PLA-PEG-1NGR 胶束，备用；PLA_mPEG 胶束的制备，将 20mg PLA_mPEG(PLA 分子量:4000 ；PEG分子量:2000)和0.2mg香豆素6溶解在3ml乙腈中，成膜，其他同PLA-PEG-1NGR胶束的制备。两种胶束与肿瘤细胞共孵育2h，吸弃上清，PBS清洗，激光共聚焦显微镜观察细胞胶束摄取情况。结果显示普通胶束被摄取量较少，而iNGR修饰的胶束则被大量摄取，说明iNGR修饰的靶向材料PLA-PEG-1NGR赋予了胶束对肿瘤细胞良好的体外靶向性。
【权利要求】
1.一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述复合物是由聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和具有肿瘤穿透性能的靶向多肽iNGR三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物(缩写为PLA-PEG-1NGR)，三者的摩尔比例为1:1:1。
2.根据权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述的肿瘤穿透肽iNGR的氨基酸序列为CRNGRGPDC，其使复合物具有了肿瘤穿透性能。
3.根据权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述的聚乙二醇的重均分子量为1800~3800。
4.根据权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述的聚乳酸的重均分子量为1000~5000。
5.根据权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述的肿瘤穿透肽通过共价键形式与聚乙二醇-聚乳酸连接而成的复合物。
6.根据权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物，其特征在于，所述聚乳酸-聚乙二醇提供一个马来酰亚胺基，肿瘤穿透肽提供一个游离巯基，两者发生加成反应而连接成共价复合物。
7.一种制备根据权利要求1、2、3、4、5、6任一项所述聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤是: (1)采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的祀向多肽C-1NGR(2Acm)(氨基酸序列为C-C (Acm) RNGRGPDC (Acm))，将其溶于pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中备用； (2)取马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸复合物(PLA-PEG-Mal)溶于乙腈中，旋转蒸发成膜，加入PBS (pH 8.0, 0.2M)在37°C水化形成胶束； 加入过量的C-1NGR (2Acm)并反应过夜，透析(分子量3kDa)去除过量的多肽与盐，冷冻干燥，得到 PLA-PEG-1NGR (2Acm)；` (3)将PLA-PEG-1NGR(2Acm)其溶于甲醇中，加入柠檬酸溶液和IM的盐酸溶液，后逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应2hr，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类(截留分子量3.5kDa，透析介质为水)，冷冻干燥得到PLA-PEG-1NGR。
8.权利要求1所述的一种聚乳酸-聚乙二醇-肿瘤穿透肽复合物在制备胶束、纳米粒等药物载体中的应用。
【文档编号】A61K9/107GK103536930SQ201310437613
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】闫志强, 杨一祎, 魏岱旭, 钟建, 刘璐, 金彩虹, 何丹农 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司