阻止肿瘤细胞诱导t细胞老化并逆转其免疫抑制能力的方法及其在抗肿瘤免疫治疗中的用途
【专利摘要】本发明提供阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其免疫抑制能力的方法，向细胞提供TOLL样受体8的配体，激活肿瘤细胞中TLR8信号通路，阻断肿瘤细胞诱导T细胞老化，从而提高抗肿瘤免疫。TOLL样受体8的配体，其特征在于是一种寡核苷酸，包含腺嘌呤、鸟嘌呤和连接鸟嘌呤与相邻核酸碱基的核酸酶抗性残基间主链连接键组成（优选化学键为硫代磷酸酯），其核酸合成序列为：5’-AGG…GA-3’，G代表鸟嘌呤，A代表腺嘌呤，G与G之间为硫代磷酯键修饰，G的数目可以3-10不等；常用配体Poly-G3的酸合成序列为5’-AGGGA-3’，肿瘤内注射TLR8配体Poly-G3能显著增强CD8+T细胞的抑瘤作用。
【专利说明】阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其免疫抑制能力的方法及其在抗肿瘤免疫治疗中的用途
【技术领域】
[0001]激活TOLL样受体8 (TLR8)信号作为新型的和有效的肿瘤免疫治疗药物和/或肿瘤疫苗佐剂。
【背景技术】
[0002]越来越多的证据显示有效的、功能性的⑶4+和⑶8+T细胞在肿瘤的免疫监视和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。因而如何调控免疫细胞使其高效地识别和清除肿瘤细胞已成为治疗侵袭性和转移性肿瘤的新策略。目前许多免疫治疗方法，如细胞因子、肿瘤活疫苗和过继性免疫治疗等，在临床前期试验中显示一定的效果，但是这些免疫治疗的总体临床效果欠佳[Rosen berg, S.A., Yang, J.C.&Rsetifo, N.P.Cancerimmunotherapy:moving beyond current vaccine.Nat.MedlO, 909-15(2004)]。 目前研究证明肿瘤通过各种策略形成的抑制性微环境是调动体内免疫功能及取得有效抗肿瘤免疫疗效的主要障碍。招募和扩增抑制性肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤诱导的免疫抑制的主要机制之一。肿瘤细胞能扩增和招募不同类型的肿瘤浸润性免疫抑制细胞，包括调节性T细胞(Treg)，致耐受树突状细胞(DC)，肿瘤来源的巨噬细胞和骨髓移植细胞(MSCs) [Roncarolo, M.G.，et al.1nterleukin-10-secreting typelregulatory Tcells in rodents and hum ans.1mmunological reviews212, 28-50(2006);Peng G., etal.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cells suppress T and dendritic cell functionvia mechanisms controlled by unique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334-8 (2007)]。另外，肿瘤细胞能分泌抑制因子(IL-10，TGF-β和ID0)，表达抑制性分子(FasL和I3D-Ll )，直接抑制肿瘤特异性T细胞的扩增并诱导T细胞凋亡。因此，如何更好地理解肿瘤诱导的免疫抑制微环境怎样建立及维持的分子机制能为开发新的肿瘤疫苗和免疫治疗策略提供理论依据。同时加强开发逆转免疫抑制的治疗新策略是进行成功的临床免疫治疗所面临的主要挑战。
[0003]细胞老化最初是用来描述人成纤维细胞培养过程中出现的有限的传代增殖能力。近期的研究提示老化也发生在人免疫细胞，从而导致与正常老化相关的免疫系统的功能异常。研究发现，老化的CD8+T细胞的增多存在于慢性病毒感染的病人以及某些肿瘤病人如肺癌、乳腺癌和头颈部肿瘤等。老化T细胞常有显著的表型变化，如共刺激分子CD28表达的永久丢失、细胞周期停滞以及细胞周期相关基因p53、p21和pl6的上调。更重要的是老化T细胞发生功能改变，包括杀伤能力缺失、具有潜在的负调控功能[Vallejo，V.N.CD28extinction in human T cells:altered functions and the program of T—cellsenescence.1mmunol Rev205, 158-69(2005)]。因此，更好地了解肿瘤微环境中老化T细胞产生的分子机制以及研究如何恢复老化的肿瘤特异性免疫细胞的效应功能对抗肿瘤免疫及治疗具有关键的意义。
[0004]TLR激活剂用作疫苗佐剂或防治肿瘤和感染性疾病的药物已成为一个活跃的研究令页域° [Wang, R.F.，et al.Toll-like receptors and immune regulation:1mplicationsfor cancer therapy.0ncogene, 27，181-9 (2008)]。多种 TLR 配体，包括咪喹莫特(TLR7)和CpG(TLR9)配体对肿瘤的治疗有显著作用。这些TLR配体能直接诱导表达相应TLR的肿瘤细胞凋亡，或增强肿瘤浸润固有免疫和肿瘤特异性T细胞功能。相反，许多研究证实一些TLR信号通路，如LPS和罗唑利宾(Loxoribine)能促进肿瘤的发生和发展。这些矛盾的结果进一步说明TLR信号通路在肿瘤和免疫细胞的调控是复杂的，并因不同肿瘤和不同TLR配体而异。因此，更好地理解肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞中TLR信号通路的调控不仅能进一步有助于识别肿瘤免疫病理的分子机制也将为开发有效的肿瘤治疗方法提供新策略。TLRs也对调控Treg的功能起重要作用。我们的研究证实，人TLR8的配体，包括人工合成的Poly-G寡核苷酸和天然配体(SSRNA40)能直接逆转自然发生CD4+CD25+Treg细胞以及肿瘤来源的CD4+、CD8+以及、δ Treg细胞的抑制功能[Peng，G.，etal.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cell function.Science309,1380-4(2005).Peng G.,et al.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cellssuppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled by uniquetoll-like receptor signaling pathway.1mmunity27, 334-8(2007)]。
【发明内容】
[0005]发明目的:恢复老化的肿瘤特异性免疫细胞的效应功能。
[0006]技术方案:我们的最近研究揭示人肿瘤细胞能诱导幼稚和肿瘤效应T细胞老化。肿瘤来源的内源性环化单磷酸腺苷(cAMP)是诱导T细胞老化的主要介质。我们的研究进一步证实，TLR8激活剂Poly-G3和ssRNA40显著逆转肿瘤细胞诱导T细胞老化的能力。Poly-G3能有效调控肿瘤细胞的TLR8信号通路并阻断肿瘤来源cAMP的作用。我们通过小鼠肿瘤模型及免疫治疗模型发现，通过Poly_G3活化肿瘤细胞TLR8信号通路能有效地预防并逆转肿瘤所引起的幼稚T细胞和肿瘤特异性T细胞老化，并且能逆转其抑制功能，从而显著增强抗肿瘤免疫治疗效应。我们的研究清楚地显示人TLR8信号通路能逆转肿瘤微环境介导的抑制效应并能将其切换为效应微环境。我们的研究为利用TLR8配体作为新型的和有效的肿瘤免疫治疗药物和/或肿瘤疫苗佐剂提供强有力的依据。
[0007]本发明提供一种阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，向细胞提供TOLL样受体8的配体，激活肿瘤细胞中TLR8信号通路，阻断肿瘤细胞诱导T细胞老化。TLR8配体通过激活肿瘤细胞中TLR8信号通路下游的ERK1/2和P38，阻断肿瘤来源内源性环化单磷酸腺苷即cAMP的产生。TOLL样受体8的配体，是一种寡核苷酸，包含腺嘌呤、鸟嘌呤和连接鸟嘌呤与相邻核酸碱基的核酸酶抗性残基间主链连接化学键组成，其核酸合成序列为:5’ -AGG…GA-3’ ；G代表鸟嘌呤，A代表腺嘌呤，G与G之间为化学键修饰，化学键为硫代磷酸酯。G的数目可以3-10不等，优选配体Poly_G3的酸合成序列为5’ -AGGGA-3’。
[0008]肿瘤细胞包括小鼠肿瘤细胞及人肿瘤细胞。
[0009]人肿瘤细胞包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌，肺癌，肝癌和头颈部肿瘤及其他实体性肿瘤。
[0010]TOLL样受体8的配体用于肿瘤免疫治疗药物或肿瘤疫苗佐剂；并可用注射的方式为肿瘤内，皮下，或全身静脉注射。[0011]有益效果:
[0012]1、发现了一个肿瘤细胞诱导免疫抑制的新机制，即将幼稚/效应T细胞转化为具有抑制功能的老化T细胞。
[0013]2、证实肿瘤细胞来源的内源性cAMP与T细胞老化的诱导有关。
[0014]3、进一步证实激活肿瘤细胞内的TLR8信号通路能阻断肿瘤细胞诱导幼稚T细胞和肿瘤特异性效应T细胞老化并逆转其抑制功能，从而提高抗肿瘤免疫。
[0015]4、进一步阐明了 TLR8在肿瘤细胞的具体调控信号通路。这些研究为研发阻断肿瘤诱导的免疫抑制策略提供新思路和手段。
[0016]4、TLR8配体通过激活肿瘤细胞中TLR8信号通路(包括MyD88、IRAK4、ERKI/2和P38)阻断肿瘤来源cAMP的产生，进而阻断肿瘤细胞诱导T细胞老化。
[0017]5、我们利用黑色素瘤586mel荷瘤Ragl+小鼠模型证明，肿瘤内注射TLR8配体Poly-G3能显著阻断转入荷瘤小鼠的幼稚⑶4+T细胞老化并且逆转其抑制功能。
[0018]6、我们利用黑色素瘤586mel荷瘤N0D_scid IL_2Rgammanu11小鼠模型证明，肿瘤内注射TLR8配体Poly-G3能显著阻断转入荷瘤小鼠的肿瘤特异性效应T细胞⑶8+TIL586的老化诱导并逆转其抑制能力。
[0019]7、我们通过小鼠肿瘤免疫治疗模型发现，肿瘤内注射TLR8配体Poly_G3能显著增强⑶8+TIL586细胞的抑瘤作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1显示了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中老化细胞比例升高；
[0021]图2显示了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中老化细胞比例升；
[0022]图3显示了肿瘤诱导的老化细胞具有很强的抑制功能；
[0023]图4显示了肿瘤来源的内源性cAMP是诱导T细胞老化的关键介质；
[0024]图5显示了 cAMP抑制剂能显著抑制肿瘤细胞诱导的T细胞老化；
[0025]图6显示了 TLR8配体显著逆转肿瘤细胞诱导幼稚⑶4+T细胞老化；
[0026]图7显示了 TLR8配体逆转肿瘤诱导的T细胞老化所涉及TLR8信号通路，包括MyD88、IRAK4、ERKI/2 和 P38 ；
[0027]图8显示了 TLR8信号通过下调肿瘤细胞内的cAMP逆转肿瘤诱导的T细胞老化；
[0028]图9显示了敲除MCF7细胞中ERK1/2或p38信号分子，或敲除PC3细胞中ERK1/2信号分子能显著阻断Poly_G3导致的肿瘤细胞内cAMP水平降低；
[0029]图10显示了 TLR8信号通路能逆转人黑色素瘤细胞小鼠体内诱导的幼稚⑶4+T细胞老化；
[0030]图11显示了激活肿瘤中TLR8信号能阻断肿瘤诱导的肿瘤特异性效应T细胞老化；
[0031]图12显不了肿瘤内注射TLR8配体Poly_G3能显著增强NOD-scid IL_2Rgammanu11小鼠的T细胞抗肿瘤免疫。
【具体实施方式】
[0032]实验方法如下:[0033]1.人标本和细胞株[0034]黑色素瘤、乳腺癌、乳腺癌、结肠癌标本和配对正常组织来自于圣路易斯大学外科住院手术病人。正常人血白细胞层来(Buffy Coat)自于美国休斯顿海湾地区血液中心。这些研究已获得学校研究审查委员会批准。Ficoll-Paque分离获得外周血单核细胞(PBMC)。人幼稚⑶4+和Q38+T细胞用EasySep富集试剂盒(StemCell Technologies)分离获得。不同种类的肿瘤细胞株(黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌和鳞癌)和正常乳腺组织来源细胞(BN)，购自于美国组织库(ATCC)或本实验室建立。乳腺癌(BC)、结肠癌(CC)细胞株培养于角化细胞培养液(含25mg/ml牛脑垂体提取物、5ng/ml表皮生长因子、2mML-glutamineUOmM HEPES缓冲液、2%热灭活胎牛血清(FCS)和亲链霉素)。其他肿瘤细胞株培养于含10%FCS的RPMI1640。
[0035]2.肿瘤浸润淋巴细胞的获得
[0036]肿瘤和正常组织浸润淋巴细胞来自于不同的肿瘤和正常组织，方法见参考文献[Peng, G., et al.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cellfunction.Science309, 1380-4(2005).Peng G., et al.Tumor-1nfiltrating gammadeltaT cells suppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled byunique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27, 334-8 (2007)]。主要步骤如下:组织切碎后以胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核酸酶消化；消化后的细胞经RPMI1640洗涤后，培养于含10%人血清、左旋谷酰胺、2-巯基乙醇和50U/ml的IL-2的RPMI1640中。
[0037]3.TLR8配体的合成
[0038](A)人工合成的TLR8配体Poly_G3，AG*G*GA.A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤。*代表硫代磷脂键修饰。由Invitrogen公司合成。
[0039](B)天然 TLR8 配体 ssRNA40/LyoVec,由 Invivogen 公司合成。
[0040](C)阴性对照配体，Poly-TIO，T*TTTT*T*T*T*T*T。T代表腺腺嘧啶。*代表硫代磷脂键修饰。由Invitrogen公司合成。
[0041]4.老化相关β -半乳糖苷酶(SA- β -Gal)染色
[0042]老化T细胞内SA- β -Gal活性的检测参考以前文献(Ye J.，et al.Humanregulatory T cells induce T lymphocyte senescence.Blood, 2012，120:2021-2031)。主要步骤如下:抗-⑶3激活的幼稚⑶4+或⑶8+T细胞以1:1的比例与肿瘤细胞或正常组织来源细胞共培养I天后，分离并继续培养3或5天。处理的细胞PBS洗涤后，固定于3%甲醛，以新鲜配制的 SA- β -Gal 显色液(lmg/ml X-gal, 5mM K3Fe [CN]6, 5mM K4Fe [CN]6, 2mM MgCl2于PBS中，Ph6.0.)37°C，孵育过夜。染色后的细胞经水轻轻洗涤后，置于显微镜下观察。
[0043]对有些实验，共培养体系含有下列TLR配体或抑制剂。TLR配体包括:Pam3CSK4 (TLR2 配体，200ng/ml)，Poly(1:C) (TLR3 配体，25 μ g/ml)，LPS (TLR4 配体，100ng/ml), Flagellin (TLR5 配体 10 μ g/ml)，Loxoribine (TLR7 配体,500 μ Μ)，ssRNA40/LyoVec (TLR8 配体 3 μ g/ml) (Invivogen, San Diego, CA)和寡聚核昔酸 CpG-B (3 μ g/ml)，Poly-T3 (3 μ g/ml)和 PoIy-G3 (3 μ g/ml) (Invitrogen 合成);cAMP 抑制剂包括:2，，5’ -双脱氧腺苷(7ddA, 320 μ Μ)和双氢氯化物(Η89, 20 μ M) (Calbiochemistry, San Diego, CA)。MAPK和NF-κ B阻断实验:肿瘤细胞经MAPK抑制剂U0126(10yM), SB203580 (10 μ Μ)，和SP600125(10yM)或NF-κ B抑制剂APDC (10 μ Μ)处理3天，第三天加入Poly_G3。处理后的T细胞分离后继续培养3天，然后检测SA-β -Gal活性。
[0044]5.流式细胞仪分析
[0045]⑶4+Τ细胞经PE或FITC标记的抗人特殊抗体细胞表面或胞内染色后，FACS检测⑶4+Τ细胞标志表达。所用到的人抗体包括:抗-⑶4、抗-⑶8、抗-⑶28和抗磷酸化ATM，均购自BD Biosceinces0所有染色细胞用FACSCalibur流式细胞仪分析，所得数据用FLOWJ0软件分析(Tree Star)。
[0046]6.免疫印迹实验
[0047]抗-⑶3激活的⑶4+T细胞与MCF7或PC3共培养O、1、3或5天。共培养的⑶4+T细胞分离后以裂解液[50mM Tris-HCl (Ph8.0), 1%NP40, 250mM NaCl, 50mM NaF, ImM Na3VO4, ImM蛋白抑制剂(PMSF，抑酶肽，亮肽素)和ImM DDT]处理。细胞裂解液经蛋白定量后，SDS-PAGE分离，随后转至HWF膜。PVDF膜经一抗及辣根过氧化酶标记的二抗孵育后化学发光底物处理显影。实验中所用抗体包括:抗-磷酸化LCK，抗-LCK，抗磷酸化-PKA，抗-PKA，抗磷酸化CREB,抗-CREB,抗 _actin(Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ? 有些实验中，培养液中加入Poly-G3，处理后的幼稚⑶4+T细胞用来进行免疫印迹实验。
[0048]7.功能性增殖实验
[0049]增殖实验如前所述[Peng,G.，et al.Toll-like receptor8_mediated reversalof CD4+regulatory T cell function.Science309, 1380-4(2005).Peng G., etal.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cells suppress T and dendritic cell functionvia mechanisms controlled by unique toll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334-8 (2007)]。主要步骤:在抗_CD3 (2 μ g/ml)包被的96孔培养板中，IXlO5从健康人新鲜分离的幼稚⑶4+T细胞与肿瘤或正常组织细胞处理的T细胞以不同比M(l:10, 1:0.5, 1:0.2, 1:0.1,0:1)共培养于含2%人AB血清培养液。培养56小时后，以IyCi/孔的终浓度加入[3H]-胸腺嘧啶，继续培养16小时。以液闪计数器测定[3H]-胸腺嘧啶的掺入。
[0050]8.Calcein AM转移及细胞间连接通讯阻断
[0051]MCF7、M628 及 PC3 肿瘤细胞孵育于含 Calcein AM (5 μ Μ, Invitrogen, Inc.)的 PBS中40分钟(37°C，5%C02)。细胞用含5%FBS的PBS洗涤2次，以1:1的比例与抗-CD3激活的CD4+T细胞共培养1-3天，同时在培养液内加或不加300 μ M GAP27 (Tocris Bioscience)。FACS检测转移入T细胞的Calcein AM。细胞间连接通讯阻断实验，MCF7、M628或PC3肿瘤细胞与抗-CD3激活的CD4+T细胞共培养I天，培养液内加或不加GAP27。处理后的细胞分离后继续培养3天，然后检测SA- β -Gal表达及cAMP浓度。
[0052]9.cAMP 的检测
[0053]肿瘤细胞或T细胞以预冷PBS洗涤三次，然后冻融三次。以cAMP特异性的ELISA测定胞浆cAMP的浓度(具体方法见R&D Systems)。
[0054]10.Lentivirus-shRNA的产生及肿瘤细胞基因的敲除
[0055]TLR8、IRAK4、MyD88、ERKl、ERK2、P38a、JNKl、IKKa 或随机 lent1-shRNAs 的设计和构建方法，以及携带GFP的重组Ientivirus和shRNA的产生见前[Peng, G., etal.Toll-like receptor8_mediated reversal of CD4+regulatory T cell function.Science309,1380-4(2005).Peng G.,et al.Tumor-1nfiltrating gammadelta T cellssuppress T and dendritic cell function via mechanisms controlled by uniquetoll-like receptor signaling pathway.1mmunity27，334—8 (2007) ] ?肿瘤细胞培养于24孔培养板，加入浓缩的Ientivirus上清(5-10M0I/0.5ml培养液)及8μ g/ml聚凝胺(Sigma),室温1000g离心I小时。转染3_4天后，FACS分离GFP+和GFP_肿瘤细胞。进一步测定分离的肿瘤细胞(GFP+和GFP_)诱导老化及产生cAMP的能力。TLR8siRNA，5’GGTGGTGCTTCAATTAATA;IRAK4siRNA, 5’GCAGCAATGGTTGACATTA;MyD88siRNA, 5’GGCACCTGTGTCTGGTCTA0
[0056]11.逆转录 PCR
[0057]用Trizol (Invitrogen)提取总 RNA,用 SuperScript II RT 试剂盒提取 cDNA,参照厂商的说明操作。逆转录PCR检测TLRl至TLR9mRNA的表达。每一样本mRNA表达水平以GAI3DH矫正。
[0058]12.动物实验
[0059]Ragl+ 小鼠和 NOD-scid IL2Rgammanu11 小鼠(缺失 T 和 B 细胞)购自于 Jackson 实验室。所有的动物实验已获得Saint Louis University动物管理委员会的批准。Ragl+小鼠和NOD-scid IL2Rgammanu11小鼠皮下注射含人黑色素瘤586mel肿瘤细胞(5X IO6)的100 μ I PBS缓冲液.⑶3抗体(2 μ g/ml)预激活的⑶4+T细胞(5X IO6/鼠)或肿瘤特异的⑶8+TIL586细胞(5 X IO6/鼠)(能特异性地识别和杀死586mel细胞)经尾静脉注射入对照组小鼠及荷瘤小鼠(肿瘤大小约为10X 10mm)。在平行实验中，分别于注入⑶4+T细胞后 1、4、7 和 10 天后，瘤内注射 PBS (100 μ I/鼠)、LPS (10、20、50 μ g/100 μ I PBS/鼠)或Poly-G3(50yg/100y I PBS/鼠)。每组5_10只小鼠。T细胞注射12天后，收集血、淋巴结(LN)、脾脏(SP)和肿瘤；Ficoll分离单核细胞。注入的人⑶4+T细胞以抗体包被的磁珠分选法(M icrobeads, Miltenvi Biotec)分离、回收，并作表型和功能分析。SA-β-Gal染色和3Η-胸腺嘧啶掺入试验同前。至于肿瘤生长和抗肿瘤免疫实验，人黑色素瘤586mel肿瘤细胞(5X106)于100μ I PBS皮下注入NOD-scid IL2Rgammanu11小鼠。第三天，尾静脉注射肿瘤特异CD8+TIL586细胞，同时给予或不给Poly_G3 (4次,3天间隔)。肿瘤大小每四天测量一次，并计算肿瘤体积。
[0060]实验结果:
[0061]1.肿瘤细胞能诱导T细胞转变为具有抑制功能的老化T细胞。
[0062]1.1肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中老化细胞比例升高。
[0063]为研究诱导T细胞老化是否为肿瘤免疫逃避的机制之一，我们获取不同肿瘤和正常组织浸润淋性巴细胞，并分析老化细胞的比例。我们首先检测了 SA-P-Gal (人老化细胞标志)阳性细胞比例。与配对的正常组织来源的淋巴细胞相比，乳腺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)包含高比例的SA-β-Gal阳性细胞(图1A)。⑶28表达的丢失或降低是老化T细胞的另一个重要标志。因而我们进一步检测了 TILs(分别为来源于乳腺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤)或正常乳腺组织来源的淋巴细胞CD28表达状况。结果显示，正常组织来源的淋巴细胞高表达⑶28，而TILs中⑶28显著下降(图1B)。BNT:正常乳腺组织来源T细胞；BTIL，MTIL和HNTIL:分别为来源于乳腺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤的TILs。
[0064]1.2肿瘤细胞株和幼稚T细胞共培养显著诱导幼稚T细胞老化。
[0065]我们进一步探讨肿瘤细胞是否直接诱导T细胞老化。幼稚CD4+T细胞分离自健康志愿者，以抗-CD3抗体激活后与不同种类肿瘤细胞株(乳腺癌MCF7、黑色素瘤M586和M628、结直肠癌SW480和CC2、卵巢癌0C155、前列腺癌DU145和PC3、鳞癌SSC25和CAL27)或正常乳腺细胞株BN2和BN5共培养。共培养I天后，分离出⑶4+T细胞，并继续培养3天，然后检测老化相关表型及功能。结果显示，幼稚CD4+T细胞与正常乳腺细胞株共培养后只出现少量SA-β -Gal阳性细胞；而与不同种类的肿瘤细胞株共培养后SA-β -Gal阳性细胞比例显著升高(图2Α)。进一步分析CD28表达发现，幼稚T细胞与不同种类的肿瘤细胞(而不是正常组织细胞)共培养能显著降低其CD28的表达(图2Β)。
[0066]1.3肿瘤诱导老化细胞具有抑制功能。
[0067]我们进一步研究了肿瘤诱导的老化细胞的功能改变。[3H]-胸腺嘧啶掺入实验结果显示，不同种类肿瘤细胞诱导的老化CD4+T细胞对反应性CD4+T细胞有很强的增殖抑制作用(图3)。
[0068]2.肿瘤来源的内源性cAMP是诱导T细胞老化的关键介质。
[0069]2.1肿瘤细胞内大量cAMP能传递给共培养的T细胞。
[0070]已有研究证实，肿瘤细胞能建立一个缺氧环境，从而导致肿瘤部位腺苷和cAMP的升高。这些缺氧所致的代谢产物能保护肿瘤细胞免受肿瘤特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。cAMP作为调节性T细胞(Tr eg )发挥抑制功能的机制之一，能抑制IL-2的产生和⑶4+T细胞增殖[Bopp, T.et al.Cyclic adenosinemonophosphate is a key component of regulatory T cell-mediated suppression.J Exp Med204，1303-10(2007)]。这些研究促使我们去证实肿瘤来源的cAMP是否也与诱导T细胞老化有关。结果显示 ，cAMP在肿瘤细胞M628，PC3和MCF7中的水平显著高于正常乳腺细胞(图4A)。与肿瘤细 胞M628，PC3和MCF7共培养一天后，cAMP在⑶4+T细胞的水平显著升高(图4B)。已有研究显示，调节性T细胞通过细胞间连接通讯向效应T细胞传递 cAMP[Bopp, T.et al.Cyclic adenosine monophosphate is a key component ofregulatory T cell-mediated suppression.J Exp Med204, 1303-10 (2007)]。我们推测肿瘤细胞可能利用相似的机制，向靶T细胞传递cAMP，从而诱导T细胞老化。在共培养系统中加入细胞间隙连接抑制性多肽GAP27后，能显著降低cAMP水平(图4B)。而且，GAP27能显著降低肿瘤细胞诱导的T细胞老化(图4C)。*p〈0.05, **p<0.01，与对照组比较。
[0071](B)
[0072]
【权利要求】
1.一种阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其免疫抑制能力的方法，其特征在于，向细胞提供TOLL样受体8的配体，激活肿瘤细胞中TLR8信号通路，阻断肿瘤细胞诱导T细胞老化。
2.根据权利要求1所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL样受体8的配体，是一种寡核苷酸，包含腺嘌呤、鸟嘌呤和连接鸟嘌呤与相邻核酸碱基的核酸酶抗性残基间主链连接化学键组成，其核酸合成序列为:5’ -AGG…GA-3’ ；G代表鸟嘌呤，A代表腺嘌呤，G与G之间为化学键修饰，G的数目可以3_10不等。
3.根据权利要求2所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL样受体8的配体，配体Poly-G3的酸合成序列为5’ -AGGGA-3’。
4.根据权利要求2或3所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，TOLL样受体8的配体，化学键为硫代磷酸酯。
5.根据权利要求1或2所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，TLR8配体通过激活肿瘤细胞中TLR8信号通路，是下游的ERK1/2和P38，阻断肿瘤来源内源性环化单磷酸腺苷即cAMP的产生。
6.根据权利要求1或2所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，肿瘤细胞包括小鼠肿瘤细胞及人肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的阻止肿瘤细胞诱导T细胞老化并逆转其抑制能力的方法，其特征在于，人肿瘤细胞包 括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌，肺癌，肝癌和头颈部肿瘤及其他实体性肿瘤。
8.一种用于人逆转肿瘤免疫抑制的疫苗，其特征在于，将权利要求2或3或4所述的TOLL样受体8的配体用于肿瘤免疫治疗药物或肿瘤疫苗佐剂。
9.TOLL样受体8的配体注射方式，其特征在于，将权利要求2或3或4中的TOLL样受体8的配体注射肿瘤内，皮下，或全身静脉注射。
【文档编号】A61K39/39GK103520198SQ201310439868
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】彭光勇, 叶健 申请人:彭光勇