一种增强trail抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程药物【技术领域】，公开了一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，全长融合基因序列1的编码cDNA序列见SEQ?ID?NO1；全长融合基因序列1的编码氨基酸序列见SEQ?ID?NO2；全长融合基因序列2的编码cDNA序列见SEQ?ID?NO4；全长融合基因序列2的编码氨基酸序列见SEQ?ID?NO5。本发明与单独TRAIL蛋白可溶性片段编码cDNA序列的原核表达载体相比，原核表达载体的融合蛋白具有更高的可溶性表达，融合蛋白的回收及纯化效率更高；体外生物活性分析表明，所获融合蛋白能同时激动细胞膜上死亡受体和抑制细胞质内XIAP基因的表达，通过凋亡途径双靶点的作用增强诱导肿瘤细胞凋亡的活性，具有更强的抗肿瘤作用。
【专利说明】一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程药物【技术领域】，特别涉及将野生型TRAIL蛋白编码cDNA序列与一内源性凋亡抑制剂分子XIAP的拮抗蛋白SMAC的N端7肽编码cDNA通过一特定的细胞内源性蛋白酶剪切位点AP编码cDNA序列连接，在融合基因前面再加上高效穿膜肽序列，构建成 R8+SMAC N7+AP+TRAIL (114_281aa)或 TAT+SMAC N7+AP+TRAIL (114_281aa)融合基因序列，采用经PTWINl改造的大肠杆菌表达载体表达上述融合蛋白，分离纯化上述融合蛋白得到能增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白。
【背景技术】
[0002]1.TRAIL蛋白结构及分子生物学
[0003]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-1nducing ligand ；TRAIL)为肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)超家族的成员，其基因序列分别于1995 年由 Wiley 等人(Wiley et al.1995)和 1996 年由 Pitti 等人(Pitti et al.1996)独立克隆获得。后者将其命名为凋亡素2配体(Apo21igand, Apo2L),后来的研究证实Apo2L与TRAIL实为同一种蛋白，因此习惯上可将其称为Apo2L/TRAIL。
[0004]人Apo2L/TRAIL 的编码基因定位于染色体 3q26 (Miriani and Krammer.1998),完整的Apo2L/TRAIL的cDNA序列编码全长为281个氨基酸的前体蛋白，其相对分子质量为32.5kDa。天然的Apo2L/TRAIL蛋白表现为II型跨膜蛋白，分细胞外C端区域、跨膜区、细胞内N端区域等三部分。Apo2L/TRAIL的N端l_14aa为短小的胞内段，无信号肽序列；第15-40位aa为疏水区，形成跨膜结构；C端第41-281位aa为胞外区，保守性强。C端能形成几个β折叠，再形成典型的β夹心结构，进而形成同源三聚体的亚单位，胞外区为蛋白发挥功能的主要结构区。Apo2L/TRAIL前体蛋白在特定的蛋白酶作用下水解形成可溶性TRAIL,其第 114_281aa 为蛋白质的可溶性片段(Miriani and Krammer.1998)。
[0005]人Apo2L/TRAIL的C端(胞外区)序列与TNF和Fas配体一样高度保守，人TRAIL分子的胞外区与Fas配体、肿瘤坏死因子α、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的同源性分别为28%、23%和22% (Wiley et al.1995)。TRAIL与TNF家族其他成员最独特的区别在于其第137-152位形成一个12-16个aa的插入环(AA’ loop)，此结构可插入受体的TRAIL结合位点，保证受体与TRAIL的特异性结合。结构突变研究证实，此插入环在TRAIL细胞毒性中起着关键的作用。晶体结构研究表明，Apo2L/TRAIL分子为一个同源三聚体分子，内部含有一个Zn原子，Zn原子同时与三个配体亚单位的第230位半胱氨酸连接，通过相互作用以维持分子的稳定(Hymowitz，et al.2000)。TRAIL是TNF家族中唯一的具有一个Cys残基的成员，Zn原子的结合对于同源三聚体的稳定性和生物活性至关重要(Bodmer et al.2000 ；Hymowitz, et al.2000)。Jean等研究证实,如将第230位半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸或丙氨酸后，TRAIL将形成无活性的二聚体结构，与受体的亲和力将下降200倍，严重影响TRAIL诱导细胞凋亡的活性(Jean et al.2000)。
[0006]TRAIL的功能首先是作为生物体先天性或获得性免疫的调节剂，其次在细胞外源性凋亡途径过程中发挥重要作用，作为免疫监视在抗肿瘤过程中发挥重要作用。TRAIL的最大优点是可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有毒性。研究资料表明，Apo2L/TRAIL无论在体内，还是体外对于各种来源的人肿瘤细胞系，包括结(直)肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等都具有诱导凋亡的作用(Ashkenazi et al.1999 ;Ashkenazi2002)。
[0007] 从TRAIL发现至今近20年时间里，TRAIL —直被作为一个重要的潜在抗肿瘤药物开发，TRAIL的临床试验在国外已进入II期，在国内已完成III期。大量体内外试验均证实，TRAIL具有肿瘤特异性细胞毒性，尤其当它与小剂量化疗药物联用时即表现出明显的协同和增效作用。相反，研究发现机体中凋亡机制的缺失导致的TRAIL耐受与肿瘤细胞的快速生长和转移明确相关。
[0008]2.TRAIL受体结构及分子生物学
[0009]TRAIL发挥作用是通过与其相应特异性死亡受体结合而实现的。目前发现的人TRAIL细胞膜上受体共5种(LeBlanc and Ashkenazi2003)，它们分别被称为死亡受体 4 (Death receptor4, DR4)、死亡受体 5 (Death receptor5, DR5)、诱骗受体 I (Decoyreceptorl,DcRl)、诱骗受体2(Decoy receptor2,DcR2)和护骨素(osteoprotegerin,OPG)。前四种已定位于染色体8p22-21上，这表明上述受体在遗传学上均起源于较近的基因复制事件。8p21还包含有许多推定可能为抑癌基因的序列，8p21位置的基因转位在头颈部肿瘤中亦较常发现。
[0010]DR4和DR5均属肿瘤坏死因子受体超家族。DR4和DR5结构类似，均包含一个推定的信号肽序列，两个富含半胱氨酸的假重复序列，一个跨膜结构域，一个细胞内死亡结构域。DR4和DR5分子分别由468个aa和440个aa组成，两者序列相似性为58%。Northernblot分析表明，DR4在大多数人体组织中表达；DR5亦在所有检测组织中表达，尤其最高表达于外周血淋巴细胞、脾和卵巢组织。DR4和DR5均可表达于多种肿瘤细胞表面。
[0011]Pan等(Pan et al.1997)研究证实，与FAS、TNFR和DR3—样，DR4过表达可诱导细胞凋亡。Walczak等(Walczak et al.1997)也发现，与DR4—样，DR5过表达也可引起凋亡酶依赖的细胞凋亡途径活化。Apo2L/TRAIL-DR5复合物的晶体结构分析表明，在配体三聚体的每一个单体分子之间，3个受体分子相互靠近形成一个长的狭缝，这种接触面又可分为两个区段，一个区段位于受体细胞表面复合物的底部，一个区段位于复合物的顶部。两个区段均含有与受体-配体高亲和力相关的特定氨基酸序列(Hymowitz et al.1999)。DR4传递死亡信号不通过FADD的募集，这表明DR4可能使用与DR5不同的旁路短截信号机制。与DR4不同，DR5通过细胞内适配体分子FADD的募集而传递死亡信号。
[0012]与DR4不同，DR5与受体的结合是受温度控制的，在4°C时，TRAIL与其所有受体结合力均相似，而在37°C时，TRAIL与DR5的结合力最高。因此在机体及细胞最适宜的生存温度(37°C)，DR5相对于其他受体来讲，以最强的亲和力与TRAIL结合并在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用(Truneh A et al.2000)。
[0013]与死亡受体不同，诱骗受体不仅能竞争性结合TRAIL，也能与DR4、DR5形成异源三聚体从而干扰DR4和DR5诱导的细胞凋亡作用。
[0014]诱骗受体I (Decoy receptor I, DcRl)由259个aa组成,其胞外区序列类似于DR4(相似度69%)和DR5 (相似度52%)，无死亡结构域。DcRl通过共价连接与糖磷脂肌醇(GPI)的糖链结合，形成“蛋白-糖-脂肪酸复合物”。因缺乏胞内死亡域，DcRl与TRAIL结合不能诱导细胞凋亡，反而竞争性抑制TRAIL与DR4或DR5的结合，起到一定的凋亡抑制作用。DcRl的mRNA在外周血淋巴细胞、脾、心、肺、肾、骨髓及胎盘呈高水平表达，在脑及结肠中未见表达(Sheridan et al.1997 ；Pan et al.1997)。
[0015]诱骗受体2 (Decoy receptor2, DcR2)由386个aa组成,胞内含有不完整的死亡结构域，因此，DcR2与TRAIL结合不能介导凋亡，但可以通过其胞外区抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。DcR2的mRNA在许多组织中均有表达，包括睾丸、外周血淋巴细胞、胸腺、结肠、小肠及前列腺。DcR2和DcRl的重要区别在于，DcR2含有一个胞浆结构域，该结构域可以促进凋亡转录因子NF-K B 的活化(Marsters et al.1997 ;Degli_Esposti et al.1997),从而拮抗凋亡。
[0016]可溶性TNF受体家族成员护骨素(Osteoprotegerin, 0PG)由401个aa组成,最初发现其能够与TNF超家族成员RANKL结合，在体内具有抑制破骨细胞发生、增加骨密度的作用(Simonet et al.1997)。后来发现OPG能够与TRAIL结合，也是一种TRAIL的诱骗受体，可抑制TRAIL诱导的细胞凋亡(Emery et al.1998)。这可能是部分肿瘤细胞对抗TRAIL诱导细胞凋亡的重要原因。激素不敏感的前列腺癌细胞系PC3、Dul45和激素敏感的细胞系LNCaP可通过产生OPG而产生抗凋亡效应(Holen et al.2002)。MG63造骨样细胞来源的OPG可抑制TRAIL诱导的骨髓瘤细胞凋亡，这一作用能被可溶性NF-K B (Nuclear factorkappa B)受体激动剂逆转(Shipman et al.2003)。
[0017]3.TRAIL诱导细 胞凋亡的机制
[0018]凋亡是一系列的复杂的分子事件，众多的促凋亡因子和凋亡抑制因子相互作用形成一个信号传递过程的复杂网络。凋亡信号传递通路主要包括细胞外(或死亡受体)信号传导途径和细胞内(线粒体)信号传导途径。细胞外途径对于免疫系统的调节起着重要的作用，其作用过程包括死亡受体与其配体家族成员(肿瘤坏死因子超家族)的结合，随后导致受体的三聚化和适配体分子在受体细胞膜内侧死亡区域的募集[适配体分子包括FADD(FAS相关死亡结构域)，TRADD (TNF受体相关死亡区域)]。迄今为止，已经阐明的死亡受体包括 FasL/FasR，TNF a /TNFRl, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 和 Apo2L/DR5 等系统。
[0019]当Apo2L/TRAIL与细胞膜上的两种死亡受体DR4或DR5结合后，DR5通过死亡区域包含适配体分子(FADD)的募集和活化起始凋亡诱导酶。凋亡酶(Caspases)是一组半胱氨酸蛋白酶，包括作为起始作用的凋亡酶，如Caspase2、8、9、10和作为效应作用的凋亡酶，如Caspase3、6、7。适配体分子,如FADD通过其死亡效应区域前Caspase8的募集并与死亡受体同源三聚体结合进而形成死亡信号复合物。活化的Caspase8和CaspaselO可直接活化效应Caspases或裂解替代途径中的促凋亡分子Bid。Bid为Bcl_2家族中重要的促凋亡线粒体蛋白，Bid又与另外两种促凋亡线粒体蛋白Bax及Bak相互作用，共同促使线粒体释放细胞色素C和第二个线粒衍生的凋亡酶激活剂(Second mitochondria-derived activatorof caspase, SMAC)。一方面Caspase8、10直接活化凋亡效应作用Caspase3、6、7,后者直接导致细胞凋亡的发生。细胞色素C与Apaf-1 —起,活化另一个起始阶段凋亡酶Caspase9,Caspase9进一步增强Caspase3的活化。Caspase9受一种凋亡抑制因子(Inhibitor ofapoptosis proteins, IAPs)的抑制。SMAC通过与IAPs,如X-连锁凋亡蛋白抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)的结合阻止 IAPs 对 Caspase9 的抑制，从而促进CaSpaSe3、6、7的活化，于是在细胞内、外凋亡信号传递途径中形成交叉联结。
[0020]Caspases以非活化的前酶形成存在于细胞浆中，通过N端裂解而活化，启动Caspases顺序活化效应而导致细胞凋亡。一些Caspase通过与其他Caspase形成聚合而活化。在Caspase家族中，Caspase3被认为是最重要的效应分子,该分子通过活化CAD而促进DNA片段化。Caspase3通常通过与其阴性调节分子CAD抑制剂(ICAD)结合存在于核内而保持非活化状态，ICAD被Caspase3裂解继而释放CAD。
[0021]细胞内途径是通过启动线粒体内促凋亡蛋白的释放而活化。刺激线粒体释放促凋亡蛋白的因素包括细胞缺氧、DNA损伤、细胞应激、Ca2+波动、一氧化氮、脂肪酸和蛋白酶等。上述所有刺激均可导致线粒体PT孔的形成，线粒体膜内层的改变，PT孔开放以及Bcl-2家族蛋白的释放。
[0022]线粒体及其与Bcl-2家族蛋白的相互作用在调节凋亡过程中发挥关键作用。凋亡有赖于线粒体外膜完整性的改变，作为结果，促凋亡蛋白从线粒体膜间隙释放出来。上述事件受Bcl-2家族蛋白的调控，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两个亚家族。总体上讲，抗凋亡Bcl-2家族成员维持线粒体外膜的稳定性，抑制膜间蛋白从线粒体中释放出来，而促凋亡蛋白正好相反。线粒体膜的去稳定性可导致外膜通透性增高，通透性转移孔形成，线粒体跨膜电势丧失从而导致细胞色素c、SMAC/Diablo和HrA2/0mi蛋白从线粒体中释放出来。
[0023]所有凋亡蛋白均包含能够与凋亡抑制Bcl-2家族形成二聚体的BH3结构域，促凋亡蛋白又分为仅含一个BH3结构域的蛋白和包含BH3结构域在内的多结构域蛋白。前者不能直接导致线粒体膜通透性升高而引起细胞凋亡，但可以活化多结构域促凋亡蛋白，通过后者而发挥诱导凋亡的活性。
[0024]转录因子和肿瘤抑制因子P53及其家族成员因子，如P63、P73等对于凋亡过程也十分重要。P53基因突变发生于`大多数恶性肿瘤中，尤其是头颈部肿瘤，提示其在肿瘤发生过程中扮演着关键的作用。P53在细胞面临应急刺激时通过导致细胞周期停滞或凋亡而起着保护作用。P53主要通过三种机制而活化。一是放射线照射增加双链DNA断裂可导致P53磷酸化，降低其与阴性调节剂，MDM-2的亲和力。其次可通过肿瘤生长信号(如Ras和Myc活化)刺激活化而导致P14ARF介导的MDM-2的隔离。第三，化疗药物、紫外线和蛋白激酶抑制剂促进ATR和Casein Kinase II介导的MDM-2磷酸化。P53活化后，刺激促凋亡基因，如Fas/⑶95、Noxa和凋亡诱导因子I (APAF-1)的转录。
[0025]TRAIL作为抗肿瘤药物的优越性与其固有的局限一直相伴存在，而广泛耐药的存在妨碍了 TRAIL在临床应用过程中发挥更好的疗效。根据Roberta di pietro和GiorgiaZauli 的综述(Roberta di pietro and Giorgia Zauli, 2004), TRAIL 对于业已研究的 92种传代及原代肿瘤细胞中的61种敏感，敏感率为66.30%，而对其余的31种耐药，耐药率为33.70%。我们先前进行的研究中，TRAIL对于参与试验的29株传代肿瘤细胞系中的15株敏感，敏感率为51.72%，而对14株耐药，耐药率为48.28%。无疑，广泛耐药成了 TRAIL临床应用的最大瓶颈。
[0026]尽管有关TRAIL耐药的机理业已进行了广泛和深入的研究，但Cummins等人把研究的重点集中在XIAP基因上。通过靶向性基因缺失，Cummins等人破坏了人结肠癌细胞中的XIAP基因。尽管XIAP基因的缺失并不影响细胞的基础增殖，但却明显增加了细胞对外源性TRAIL的敏感性。TRAIL对野生型肿瘤细胞和XIAP敲除的肿瘤细胞均可诱导细胞凋亡，但对后者的作用明显强于对野生型细胞。在XIAP基因敲除的肿瘤细胞中促凋亡作用与其细胞内较高的Caspase3水平相关。XIAP基因敲除可以减少肿瘤细胞的存活和克隆增殖，XIAP在肿瘤细胞的高表达是诸多肿瘤细胞对TRAIL耐受的关键非冗余调节因素(Cumminset al.2004)。
[0027]第二个线粒体衍化的凋亡酶激活剂(SMAC)是第二个被发现的线粒体蛋白(第一个是细胞色素C)。SMAC基因定位于染色体12q24.31，推定的SMAC编码蛋白为239个aa的多肽，SMAC的N端有55个aa，为线粒体靶向序列(信号肽)，成熟SMAC蛋白编码184aa。SMAC通过与IAPs结合解除IAPs对Caspase的抑制效应从而活化Caspase9的活性,进而增加细胞对凋亡刺激的敏感性，促进细胞的凋亡。Chai等人研究(Chai et al.2000)表明，SMAC的N端7肽在体外能促进前Caspase3的活化。一些学者(Liu et al.2000)通过构效研究证实SMAC的N端4个氨基酸(Ala-Val-Pro-1le)通过与XIAP表面BIR3沟结合从而解除IAPs 对 Caspase9 的抑制。
【发明内容】
[0028]针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，设计的融合蛋白的作用靶点既针对TRAIL受体DR4、DR5,又同时针对凋亡拮抗因子XIAP，以期对于TRAIL具有明显的增效作用。融合蛋白I和融合蛋白2编码cDNA序列采用去除了融合标签序列的原核载体进行克隆，可溶性表达水平较高，蛋白回收及纯化效率较闻。
[0029]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0030]本发明提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，编码该融合蛋白(双靶点融合蛋白I)的全长融合基因序列I的编码CDNA序列见SEQ ID NOl0
[0031]作为一种优选的技术方案，全长融合基因序列I的编码氨基酸序列见SEQ ID N02。
[0032]作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白I (编码氨基酸序列见SEQ ID N02)由R8 (含有连续精氨酸的8肽序列)、SMAC N7 (SMAC蛋白N端7肽)、内源性蛋白酶酶切位点(AP)与TRAIL蛋白(114-281aa)等肽段顺序融合而成。
[0033]本发明提供一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，编码该融合蛋白(双靶点融合蛋白2)的全长融合基因序列2的编码cDNA序列见SEQ ID N04。
[0034]作为一种优选的技术方案，全长融合基因序列2的编码氨基酸序列见SEQ ID N05。
[0035]作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白2 (编码氨基酸序列见SEQ ID N05)由TAT (含有不连续精氨酸的11肽序列)、SMAC N7 (SMAC蛋白N端7肽)、内源性蛋白酶酶切位点(AP)与TRAIL蛋白(114-281aa)等肽段顺序融合而成。
[0036]作为一种优选的技术方案，双靶点融合蛋白I和双靶点融合蛋白2治疗的靶点为TRAIL受体DR4、DR5和凋亡拮抗因子XIAP。
[0037]作为一种优选的技术方案，将全长融合基因序列I和全长融合基因序列2的编码cDNA克隆于原核表达载体pET32a或pTWINl上以获得高效可溶性非融合表达。
[0038]作为一种优选的技术方案，表达载体pET32a中切除Trx标签序列。
[0039]作为一种优选的技术方案，表达载体pTWINl中切除Intein内含肽序列。[0040]作为一种优选的技术方案，表达载体采用BL21 (DE3)宿主菌表达。
[0041]作为一种优选技术方案的结果，表达载体的最佳诱导温度为18°C，可溶性表达水平为 60-100%。
[0042]作为一种优选技术方案的结果，新构建的全长融合基因序列I和全长融合基因序列2表达载体比单独TRAIL表达载体的可溶性表达比例显著升高。
[0043]作为一种优选技术方案的结果，双靶点融合蛋白I和双靶点融合蛋白2经分离纯化后进行体外生物学活性检测，抗肿瘤活性明显强于TRAIL蛋白。
[0044]作为一种优选技术方案的结果，任一所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白用作抗肿瘤药物的用途。
[0045]本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果:
[0046]本发明与单独TRAIL蛋白可溶性片段(114_281aa)编码cDNA序列的原核表达载体相比，原核表达载体的融合蛋白具有更高的可溶性表达，融合蛋白的回收及纯化效率更高。体外生物活性分析表明，所获融合蛋白能同时激动细胞膜上死亡受体和抑制细胞质内XIAP基因的表达，通过凋亡途径双靶点的作用增强诱导肿瘤细胞凋亡的活性，具有更强的抗肿瘤作用。上述双靶点TRAIL融合蛋白极具发展潜力和优势，极有可能发展成为新一代肿瘤细胞凋亡诱导药物。
【专利附图】
【附图说明】[0047]图1是融合前段拼接后PCR产物电泳图[0048]图2是TRAIL (114-281aa)基因PCR产物电泳图。[0049]图3是融合蛋白基因拼接PCR产物电泳图。[0050]图4是融合蛋白基因PMD19-T连接酶切鉴定电泳图。[0051]图5是融合蛋白基因pTWINl连接酶切鉴定电泳图。[0052]图6是pTWINl/TRAIL蛋白表达SDS-PAGE电泳图。[0053]图7是pTWINl/融合基因1、2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。[0054]图8是pTWINl/融合基因2蛋白表达SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0055]下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0056]实施例1
[0057]全长融合基因序列1、2的拼接合成
[0058]设计的融合蛋白中的TRAIL蛋白(114_281aa)的作用靶点针对TRAIL受体DR4、DR5, SMAC N7肽段针对凋亡拮抗因子XIAP，以期对于TRAIL具有明显的增效作用。
[0059]将所要合成的全长融合基因序列(见序列1、4)分为融合前段序列(见序列3、6)和TRAIL序列(见序列7)两部分。融合前段序列包括(R8+SMAC N7+AP)(见序列3)及(TAT+SMAC N7+AP)(见序列6)肽段编码cDNA序列两种，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物(见序列8-18)为原料，将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下，先得到拼接的融合前段序列(R8+SMAC N7+AP)及(TAT+SMACN7+AP)编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒(实验室自备)作为模板，采用TRAIL上下游引物(见序列19、20)扩增TRAIL蛋白(114_281aa)编码cDNA序列，最后将融合前段序列(序列3、6)分别与TRAIL序列(序列7)进行连接PCR反应得到全长融合基因序列(序列1、4)。
[0060](一)全长融合基因序列1、2的设计与拼接合成
[0061]1.全长融合基因序列I的组成及拼接合成
[0062]全长融合基因序列I包括R8+SMAC N7+AP+TRAIL (114_281aa)编码cDNA序列的顺序组合及序列连接。
[0063]拟合成及拼接的全长融合基因序列I全长如下(序列1:564bp):
[0064]ATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAMGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCCGCAGCGTGTTGCTGCTCACATCACTGGTACTCGTGGTCGTTCTAACACTCTTTCTTCTCCGAACTCTAAAAACGAAAAAGCTCTTGGTCGTAAAATCAACTCTTGGGAATCTTCTCGTTCTGGTCACTCTTTCCTTTCTAACCTTCACCTTCGTAACGGTGAACTTGTTATCCACGAAAMGGTTTCTACTACATCTACTCTCAGACTTACTTCCGTTTCCAGGAAGAAATCAMGAAAACACTAMAACGATAAACAGATGGTTCAGTACATCTACAAATACACCTCTTACCCGGACCCGATCCTTCTTATGAAATCTGCTCGTAACTCTTGC`TGGTCTAAAGATGCTGAATACGGTCTTTACTCTATCTACCAGGGTGGTATCTTCGAACTTAAAGAAAACGATCGTATCTTCGTTTCTGTTACTAACGAACACCTTATCGATATGGATCACGAGGCTTCTTTCTTCGGTGCTTTCCTTGTTGGTTAA—TAA[0065]全长融合基因序列I编码氨基酸序列如下(序列2:186aa):[0066]MetArgArgArgArgArgArgArgArgAlaValProHeAlaGlnLysAlaProValArgGluArgGlyProGlnArgValAlaAlaHisIleThrGlyThrArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLysAlaLeuGlyArgLysHeAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHisSerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGluLeuValIleHisGluLysGlyPheTyrTyrIleTyrSerGlnThrTyrPheArgPheGlnGluGluIleLysGluAsnThrLysAsnAspLysGlnMetValGlnTyrHeTyrLysTyrThrSerTyrProAspProIleLeuLeuMetLysSerAlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGluTyrGlyLeuTyrSerIleTyrGlnGlyGlyHePheGluLeuLysGluAsnAspArgIlePheValSerValThrAsnGluHisLeuIleAspMetAspHisGluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly
[0067]将全长融合基因序列I分为融合前段序列(见序列3)和TRAIL序列(见序列7)两部分。融合前段序列包括(R8+SMAC N7+AP)(见序列3)肽段编码cDNA序列，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物(见序列8-12)为原料，将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下,先得到拼接的融合前段序列(R8+SMACN7+AP)编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒(实验室自备)作为模板，采用TRAIL上下游引物(见序列19、20)扩增TRAIL蛋白(114_281aa)编码cDNA序列，最后将融合前段序列(序列3)与TRAIL序列(序列7)进行连接PCR反应得到全长融合基因序列I。
[0068]考虑在融合前段序列的5’端加上Nde I酶切位点序列及保护碱基GGT，在序列3’端加上与TRAIL蛋白(114-281aa)编码cDNA序列相重叠的部分序列GTT CGT GAA CGT GGTCGTG，组合在一起的融合前段序列(序列3:79bp)即变成:[0069] GGTCATATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGTCCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG
[0070] TRAIL 蛋白(114_281aa)编码 cDNA 序列(序列 7:510bp)如下:
[0071]GTTCGTGAACGTGGTCCGCAGCGTGTTGCTGCTCACATCACTGGTACTCGTGGTCGTTCTAACACTCTTTCTTCTCCGAACTCTAAAAACGAAAAAGCTCTTGGTCGTAAAATCAACTCTTGGGAATCTTCTCGTTCTGGTCACTCTTTCCTTTCTAACCTTCACCTTCGTAACGGTGAACTTGTTATCCACGAAAMGGTTTCTACTACATCTACTCTCAGACTTACTTCCGTTTCCAGGAAGAAATCAMGAAAACACTAMAACGATAMCAGATGGTTCAGTACATCTACAAATACACCTCTTACCCGGACCCGATCCTTCTTATGAMTCTGCTCGTAACTCTTGCTGGTCTAMGATGCTGAATACGGTCTTTACTCTATCTACCAGGGTGGTATCTTCGAACTTAAAGAAAACGATCGTATCTTCGTTTCTGTTACTAACGAACACCTTATCGATATGGATCACGAGGCTTCTTTCTTCGGTGCTTTCCTTGTT' GGI' TAA TAA
[0072]设计融合蛋白I融合前段序列基因拼接引物:
[0073]CPP-1-1F (序列 8:40bp):GG TCATATGCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTC
[0074]CPP-1-2F (序列 9:39bp): CGATTGCGCAGAAAGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG
[0075]CPP-1-3R (序列 10:19bp): CACGACCACGTTCACGAAC
[0076]CPP-1-4R (序列 11:40bp): CGGAGCTTTCTGCGCAATCGGAACAGCACGACGACGACGA
[0077]CPP-1-5R (序列 12:20bp): CGACGACGACGCATATGACC
[0078]2.全长融合基因序列2的组成及拼接合成
[0079]全长融合基因序列2包括TAT+SMAC N7+AP+TRAIL (114_281aa)编码cDNA序列的顺序组合及序列连接。
[0080]拟合成及拼接的全长融合基因序列2全长如下(序列4:573bp):
[0081]ATGTACGGCCGTAMMGCGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAMGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCCGCAGCGTGTTGCTGCTCACATCACTGGTACTCGTGGTCGTTCTAACACTCTTTCTTCTCCGAACTCTAAAAACGAAAAAGCTCTTGGTCGTAAAATCAACTCTTGGGAATCTTCTCGTTCTGGTCACTCTTTCCTTTCTAACCTTCACCTTCGTAACGGTGAACTTGTTATCCACGAAAAAGGTTTCTACTACATCTACTCTCAGACTTACTTCCGTTTCCAGGAAGAAATCAAAGAAAACACTAAAAACGATAMCAGATGGTTCAGTACATCTACAAATACACCTCTTACCCGGACCCGATCCTTCTTATGAMTCTGCTCGTAACTCTTGCTGGTCTAAAGATGCTGAATACGGTCTTTACTCTATCTACCAGGGTGGTATCTTCGAACTTAAAGAAAACGATCGTATCTTCGTTTCTGTTACTAACGAACACCTTATCGATATGGATCAC
GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT GTT GGT TAA TAA
[0082] 全长融合基因序列2编码氨基酸序列如下(序列5: 189aa):
[0083]MetTyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgAlaValProHeAlaGlnLysAlaProValArgGluArgGlyProGlnArgValAlaAlaHisHeThrGlyThrArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLysAlaLeuGlyArgLysHeAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHisSerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGluLeuValHeHisGluLysGlyPheTyrTyrHeTyrSerGlnThrTyrPheArgPheGlnGluGluHeLysGluAsnThrLysAsnAspLysGlnMetValGlnTyrHeTyrLysTyrThrSerTyrProAspProIleLeu LeuMetLysSerAlaArgAsnSerTrpSerLysAspAlaGluTyrGlyLeuTyrSer IleTyrGlnGlyGlyIlePheGluLysGluAsnAspArgIlePheValSerValThr AsnGluHisLeuIleAspMetAspGluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly
[0084]将全长融合基因序列2分为融合前段序列(见序列6)和TRAIL序列(见序列7)两部分。融合前段序列包括(TAT+SMAC N7+AP)(见序列6)肽段编码cDNA序列，融合前段序列采用委托华大基因合成的分段双链拼接引物(见序列13-18)，将合成的双链拼接引物一起反应，在无Taq DNA Polymerase的条件下，先得到拼接的融合前段序列(TAT+SMACN7+AP)编码cDNA。同时通过以含有TRAIL基因cDNA的质粒(实验室自备)作为模板，采用TRAIL上下游引物(见序列19、20)扩增TRAIL蛋白(114-281aa)编码cDNA序列，最后将融合前段序列(序列6)与TRAIL序列(序列7)进行连接PCR反应得到全长融合基因序列2。
[0085]考虑在融合前段序列的5’端加上Nde I酶切位点序列及保护碱基GGT，在序列3’端加上与TRAIL蛋白(114-281aa)编码cDNA序列相重叠的部分序列GTT CGT GAA CGT GGTCGTG，组合在一起的融合前段序列(序列6:88bp)即变成:
[0086]GGTCATATGTACGGCCGTAAAAAGCGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGCTCCGGTTCGTGAACGTGGTCGTG
[0087]设计融合蛋白2融合前段序列基因拼接引物:[0088]CPP-2-1F(序列1337bp):GGTCATATGTACGGCCGTAAAAAGCGTCGTCAGCGTC[0089]CPP-2-2F(序列1430bp):GTCGTGCTGTTCCGATTGCGCAGAAAGCTC[0090]CPP-2-3F(序列1521bp):CGGTTCGTGAACGTGGTCGTG[0091]CPP-2-4R(序列1637bp):CACGACCACGTTCACGAACCGGAGCTTTCTGCGCAAT[0092]CPP-2-5R(序列1735bp):CGGAACAGCACGACGACGCTGACGACGCTTTTTAC[0093]CPP-2-6R(序列1816bp):GGCCGTACATATGACC[0094]TRAIL蛋白(114-281aa)编码cDNA序列扩增引物(见序列19、20)，在下游引物之
前加上Pst I酶切位点序列和保护碱基GGT序列。
[0095]上游引物(序列19):GTTCGTGAACGTGGTCCGCAGCGTGTTGCTGCT
[0096]下游引物(序列20):GGTCTGCAGTTATTACAAAACAAGGAAAGCACC
[0097](二)实验材料、试剂与仪器设备
[0098]1.材料:合成的引物20120328-YJ1、实验室自备的TLP (TRAIL cDNA)质粒模板、批号 20120406。
[0099]2.试剂见表1所示:
[0100]表1.融合基因序列拼接合成所用试剂
[0101]
【权利要求】
1.一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，编码融合蛋白的全长融合基因序列I的编码cDNA序列见SEQ ID NOl。
2.根据权利要求1所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，全长融合基因序列I的编码氨基酸序列见SEQ ID N02。
3.根据权利要求1或2所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，该蛋白由R8、SMAC N7、内源性蛋白酶酶切位点与TRAIL蛋白肽段顺序融合而成。
4.根据权利要求1所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，编码融合蛋白的全长融合基因序列2的编码cDNA序列见SEQ ID N04。
5.根据权利要求4所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，全长融合基因序列2的编码氨基酸序列见SEQ ID N05。
6.根据权利要求4或5所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，该蛋白由TAT、SMAC N7、内源性蛋白酶酶切位点与TRAIL蛋白肽段顺序融合而成。
7.根据权利要求1、2、4、5任一所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，治疗的靶点为TRAIL受体DR4、DR5和凋亡拮抗因子XIAP。
8.根据权利要求1、2、4、5任一所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，将其编码cDNA克隆于原核表达载体pET32a或pTWINl上。
9.根据权利要求8所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，所述表达载体pET32a中切除Trx标签序列。
10.根据权利要求8所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，所述表达载体PTWINl中切除Intein内含肽序列。
11.根据权利要求8所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，所述表达载体采用BL21 (DE3)宿主菌表达。
12.根据权利要求8所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白，其特征在于，表达的最佳诱导温度为18°C，可溶性表达水平为60~100%。
13.根据权利要求1、2、4、5任一所述的增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白用作抗肿瘤药物的用途。
【文档编号】A61P35/00GK103524627SQ201310478404
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】陈守春, 潘凤, 闫娟, 徐琦, 胡海洋, 李昭君, 朱文彦 申请人:成都华创生物技术有限公司