表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组及其制备与应用。所述重组腺病毒组，是由表达猪唾液酸粘附素前四个IgV结构域和与猪IgG?Fc片段融合蛋白的重组腺病毒，及表达脱衣壳受体CD163第5-9个SRCR结构域与猪IgG?Fc片段融合蛋白的重组腺病毒组成。该重组腺病毒组应用于制备防治猪繁殖与呼吸综合征制剂。与现有的疫苗相比，本发明制备的重组腺病毒为复制缺陷性病毒，不能在猪体内扩散传播，不存在散毒和毒力返强风险，表达的两种游离受体的协同作用能显著抑制不同毒株PRRSV感染，可以作为防控PRRS的新型制剂进行开发。
【专利说明】表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术与动物疫病防控领域，具体涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒的制备方法与应用 。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是猪的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和各种年龄猪呼吸道症状为主要特征。该病首次于1987年在北美发生，1996年传入我国，给世界养猪业造成巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要感染猪的单核-巨噬细胞系统，导致严重的细胞凋亡和免疫抑制，并能引起持续性感染。另外，该病毒不仅毒株多、变异快，还利用多种机制逃逸宿主的先天性和获得性免疫应答，包括抑制干扰素应答、干扰抗原提呈、抗体依赖的感染促进作用、减少感染细胞表面病毒抗原表达和中和表位遮蔽。因此，现有疫苗的免疫保护效果欠佳(灭活苗)或有散毒、毒力返强风险(弱毒苗)，新型疫苗研制又面临巨大挑战，迫切需要研究防控该病的新策略。
[0003]PRRSV利用受体依赖的胞吞机制进入靶细胞，参与巨噬细胞感染的受体至少有三个，包括非特异吸附因子硫酸乙酰肝素、吸附与进入受体唾液酸粘附素(Sn)和脱衣壳受体⑶163。其中，Sn前4个免疫球蛋白样结构域(Sn4D)参与病毒的吸附，⑶163的第5个清道夫受体半胱氨酸富含(SRCR)结构域参与病毒的结合，但需要第6-9个SRCR结构域存在才具有受体功能，这些病毒结合结构域可以作为游离受体阻断病毒感染。
[0004]与容易变异的病毒蛋白不同，病毒受体是宿主细胞编码的保守分子，因此可作为阻断病毒感染的理想靶点，尤其是对容易变异的RNA病毒。其中，游离受体能与细胞受体竞争结合病毒，所以能中和或抑制病毒感染，并在抗麻疹病毒、禽白血病病毒和柯萨奇病毒等病毒中得以证实。据报道，由Sn4D和人IgG Fe片段组成的游离受体可部分抑制PRRSV感染，但人IgG Fe片段对猪有免疫原性，所用的游离受体从重组质粒转染细胞提取，因此猪体内使用受到限制。更为重要的是，PRRSV至少使用两个特异受体感染巨噬细胞，单个游离受体不足以阻断该病毒感染。至于CD163游离受体及其对PRRSV感染的阻断作用，目前尚无报道。
【发明内容】
[0005]本发明用重组腺病毒表达PRRSV游离受体Sn4D-Fc和SRCR59_Fc，经融合蛋白处理病毒和重组病毒转染细胞证明，两个游离受体的共同作用能显著抑制不同毒株PRRSV感染。该重组腺病毒可用较成熟的技术进行批量制备，能在注射猪体内持续表达，但不能在猪体内扩散传播，因此可作为防治PRRSV的新型制剂进行开发。
[0006]表达PRRSV游离受体的重组腺病毒组，是由表达Sn4D_Fc和SRCR59_Fc融合蛋白的重组腺病毒组成。即由表达猪唾液酸粘附素前4个IgV结构域和与猪IgG Fe片段融合蛋白的重组腺病毒，及表达脱衣壳受体⑶163第5-9个SRCR结构域与猪IgG Fe片段融合蛋白的重组腺病毒组成。
[0007]本发明还公开了上述表达PRRSV游离受体的重组腺病毒组在制备防治猪繁殖与呼吸综合征制剂中的应用。
[0008]其中，所述PRRSV游离受体的重组腺病毒组通过下述方法制备:
[0009]1.用化学合成法合成猪IgG重链信号肽序列，用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增猪IgG Fe片段、唾液酸粘附素前4个IgV结构域(Sn4D)和CD163第5_9个结构域(SRCR59)编码序列。
[0010]2.将Sn4D与Fe融合序列插入腺病毒载体pShuttle_CMV，获得重组载体pShuttle-Sn4D-Fc ;将猪IgG信号肽、SRCR59与Fe融合序列插入腺病毒载体pShuttle-CMV,获得重组载体 pShuttle-SRCR59_Fc。
[0011]3.用重组载体 pShuttle-Sn4D-Fc 和 pShuttle-SRCR59_Fc 转染 AAV-293 细胞，获得重组腺病毒 rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-SRCR59_Fc。
[0012]4.用AAV-293细胞扩增重组腺病毒。
[0013]与现有的PRRS疫苗相比，本发明制备的重组腺病毒为复制缺陷性病毒，不存在散毒或毒力返强等风险，而且能在注射猪体内持续表达，表达的游离受体对不同毒株PRRSV感染具有稳定的抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为重组腺病毒载体的结构示意图。ITR为腺病毒基因组左、右反向末端重复序列；PCMV为巨细胞病毒早期`启动子；L为猪IgG重链信号肽序列；Fc为猪IgG Fe片段编码序列；Sn4D为猪Sn前4个IgV结构域编码序列；SRCR5和SRCR59分别为猪CD163第5个和第5~9个SRCR结构域编码序列。
[0015]图2为重组腺病毒转导PK-15细胞中游离受体基因转录RT-PCR检测。
[0016]图3为重组腺病毒转导猪细胞中游离受体表达的免疫荧光检测
[0017]图4为亲和纯化游离受体的电泳分析
[0018]图5为纯化游离受体的免疫印迹检测
[0019]图6为纯化游离受体与PRRSV结合的RT-PCR检测。PRRSV为未结合病毒对照；SPA-Sn4D-Fc代表与Sn4D_Fc包被的葡萄球菌A蛋白(SPA)偶联琼脂糖的结合；SPA-SRCR5-Fc代表与SRCR5_Fc包被的SPA偶联琼脂糖的结合；SPA-SRCR59_Fc代表与SRCR59-Fc包被的SPA偶联琼脂糖的结合；SPA_Fc代表与猪Fe片段包被的SPA偶联琼脂糖的结合；SPA代表与无游离受体包被的SPA偶联琼脂糖的结合。
[0020]图7为游离受体中和PRRSV感染的剂量依赖关系流式细胞术检测，纵坐标表示病毒阳性细胞百分率；横坐标代表游离受体浓度；Sn4D-Fc+SRCR59-Fc为两种游离受体的共同作用。
[0021]图8为重组腺病毒表达的游离受体中和PRRSV感染的作用检测，rAd-Fc为仅表达猪IgGFc片段的重组腺病毒对照；3D4/21-PAM和PK-15/PAM分别代表重组腺病毒转导3D4/21和PK-15细胞表达的游离受体向PAM细胞的传递。
[0022]图9为重组腺病毒表达的游离受体中和PRRSV感染的剂量依赖关系，纵坐标代表病毒滴度，横坐标代表病毒接种剂量。[0023]图10为重组腺病毒表达的游离受体中和PRRSV感染的动态检测，纵坐标代表病毒滴度，横坐标表示感染后不同时间。
[0024]图11为重组腺病毒表达的游离受体对不同毒株PRRSV感染的抑制作用，纵坐标代表病毒滴度，横坐标表示不同毒株。
[0025]图12本发明克隆的猪IgG Fe片段序列与发表序列(L0C396781)的比对分析。
[0026]图13本发明克隆的猪Sn4D序列与发表序列(NM-214346)的比对分析。
[0027]图14本发明克隆的猪SRCR5序列与发表序列的(NM-213976.5)比对分析。
[0028]图15本发明克隆的猪SRCR59序列与发表序列(NM-213976.59)的比对分析。
【具体实施方式】
[0029]生物材料来源:
[0030]1.pShuttle-CMV载体:购自美国 Stratagene 公司。文献:He TC, Zhou S，da CostaLT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0031]2.BJ-5183-AD-1 株大肠杆菌:购自美国 Stratagene 公司。文献:He TC, Zhou S，daCosta LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0032]3.AAV-293细胞:从中国科学院细胞库引进。文献:Xie Qff, Leung M, FuortesM，Sassa S，Nathan C.Co mplementation analysis of mutants of nitric oxide synthasereveals that the active site requires two hemes.Proc Natl Acad Sci USA.1996,93(10):4891-4896.[0033]4.pMD18-T载体:购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara Code:6011)。
[0034]5.PRRSV参考株VR2332:购自美国ATCC (ATCC VR2332)，本实验室保存。文献:Col Iins.TE，Benfield DA, Christianson WT, Harris L, Hennings JC, ShawDP，Goya，SM，McCullough S，Morrison RB，.Too HS.1solation of swine infertilityand respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332)in North America andexperimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs.J Vet DiagnInvest,1992，4:117-126 ；
[0035]6.PRRSV疫苗株CH-1R和强毒株JXAl:由国药集团扬州威克生物工程有限公司提供。文献:Hu SPj Zhang Zj Cai XHj Tian ZJj An TQj Wu DL.Valuation of protectiveefficacy of PRRS attenuated vaccine and inactivated mutant PRRSV strains.Chinese J Prev Vet Med,2009, 31:392-396 ；Tian K，Yu X，Zhao T，Feng Y，Cao Zj WangC，Hu Y，Chen X，Hu D，Tain X.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleledoutbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the uniquehallmark.PLoS One, 2007.2 (6):e526.[0036]7.MARC-145细胞:从美国ATCC引进(ATCC CRL-12231 )，江苏扬州优邦生物制药有
限公司保存。
[0037]8.PK-15细胞:从从美国ATCC引进(ATCC CCL-33)，本实验室保存。
[0038]9.6周龄健康猪:由江苏省畜牧兽医职业技术学院种猪场提供。
[0039]具体操作步骤如下:
[0040]1.重组腺病毒构建:具体操作步骤如下:[0041](I)猪IgGl重链信号肽序列(GenBank Accession:L0C396781)合成:由南京金瑞思生物科技有限公司合成。[0042](2)猪IgGlFc片段编码序列克隆:根据猪IgGlFc片段编码序列(GenBankAccession:L0C396781)设计下列 I 对引物:
[0043]正向引物:5-GGAACAAAGACCAAACCACC-3(SEQID N0.1)；
[0044]反向引物:5-TCATTTACCCTGAGTCTTGGA-3(SEQID N0.2)。
[0045]按照RNAiso Kit [自宝生物工程(大连)有限公司]说明书，从猪外周血淋巴细胞提取 RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美国 Fermentas 公司)说明书进行反转录，按照LA Taq DNA聚合酶[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行PCR扩增，将扩增产物克隆入pMD18-T载体进行序列测定。结果显示:克隆的猪IgGlFc片段编码序列与发表序列的同源性为92.6%，无插入或缺失突变(图12)。
[0046](3) Sn4D编码序列克隆:根据猪Sn4个N端IgV结构域序列(GenBankAccess ion:NM_214346)合成下列 I 对引物:
[0047]正向引物:5-ATGGACTTCCTGCTCCTGCT-3(SEQID N0.3)；
[0048]反向引物:5-GCTGACCACCACGCTGACA-3(SEQ ID N0.4)。
[0049]按照RNAiso Kit[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书，从猪肺巨噬细胞提取RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美国 Fermentas 公司)说明书进行反转录，按照LA Taq DNA聚合酶[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行PCR扩增，将扩增产物克隆入PMD18-T载体进行序列测定。结果显示:克隆的Sn4D编码序列与发表序列的同源性为99.3%，无插入或缺失突变(图13)。
[0050](3) SRCR5编码序列克隆:根据猪CD163第5个SRCR结构域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 对引物:
[0051]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.5)；
[0052]反向引物:5-GACTACGCCGACGTCCCT-3(SEQ ID N0.6)。
[0053]按照RNAiso Kit [自宝生物工程(大连)有限公司]说明书，从猪肺巨噬细胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行RT-PCR扩增，将扩增产物克隆入pMDlS-Τ载体进行序列测定。结果显示克隆的序列与发表序列一致(图14)。
[0054](4) SRCR59编码序列克隆:根据猪CD163第5个SRCR结构域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 对引物:
[0055]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.7)；
[0056]反向引物:5-TGAGCACGTCACAGCAGC-3(SEQ ID N0.8)。
[0057]按照RNAiso Kit [自宝生物工程(大连)有限公司]说明书，从猪肺巨噬细胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行RT-PCR扩增，将扩增产物克隆入pMDlS-Τ载体进行序列测定。结果显示克隆的序列与发表序列一致(图15)。
[0058](5)对照载体pShuttle-Fc的构建:将合成的猪IgGl重链信号肽序列克隆入腺病毒载体pShuttIe-CMV (美国Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位点之间,将克隆的猪Fe编码序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位点之间，经限制酶消化法鉴定重组载体(图1)构建正确。
[0059](6)重组载体pShuttle-Sn4D_Fc的构建:将克隆的Sn4D编码序列克隆入腺病毒载体pShuttIe-CMV (美国Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位点之间,将克隆的猪Fe编码序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位点之间，经限制酶消化法鉴定重组载体(图1)构
建正确。
[0060](7)重组载体pShutt I e-SRCR5_Fc的构建:将克隆的SRCR5编码序列插在pShuttle-Fc中猪IgG重链信号肽与Fe序列之间，经限制酶消化法鉴定重组载体(图1)构建正确。
[0061 ] (8 )重组载体pShutt I e-SRCR59_Fc的构建:将克隆的SRCR59编码序列插在pShuttle-Fc中猪IgG重链信号肽与Fe序列之间，经限制酶消化法鉴定重组载体(图1)构建正确。
[0062](9)重组病毒产生:参考 AdEasy? Adenoviral Vector System (美国 Stratagene公司)说明书进行(文献:He TC, Zhou S，da Costa LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc NatlAcad SciUSA，1998,95(5):2509-2514.He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J1Kinzler Kff.etal.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95 (5): 2509-2514)。用限制酶 PacI 消化法将重组质粒pShuttle-Sn4D_Fc, pShuttle-SRCR5_Fc, pShuttle_SRCR59_Fc、pShuttle-Fc 线性化，电转化BJ-5183-AD-1大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素抗性初步筛选同源重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳法初步筛选大于20Kb的重组质粒，利用限制酶PacI消化和琼脂糖凝胶电泳法确认阳性重组质粒。用常规法将重组质粒转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞,用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒[康宁生命科学(吴江)有限公司]提取质粒DNA。在25cm2培养皿中培养AAV-293细胞至密度为80%。用限制酶PacI消化法将上述重组质粒线性化，将3 μ g质粒 DNA 与 15 μ L Lipofectmine (Life Technologies?)混合,按照试剂说明书转染 AAV-293细胞(中国科学院细胞库)。培养10-14天观察细胞缩小、变圆，反复冻融裂解细胞，收获的重组腺病毒 rAd-Sn4D-Fc、`rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59_Fc 和 rAd-Fc 用 AAV-293 细胞扩增，按照 ViraBind? Adenovirus Miniprep Kit (美国 CELL B10LABS 公司)说明书进行重组腺病毒纯化，参考Luo等方法测定病毒滴度(文献:Jinyong Luo, Zhong-Liang Deng, XiaojiLuo,et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using theAdEasy system.Nature protocols, 2007, 2 (5):1236-1247.[0063]2.游离受体基因的转录检测
[0064]在25cm2细胞瓶培养PK-15细胞，次日分别用重组腺病毒rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc (感染指数=1)，培养 24 小时后，用 RNAiso Kit[自宝生物工程(大连)有限公司]提取细胞总RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自宝生物工程(大连)有限公司]说明书进行RT-PCR扩增，结果显示在rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D_Fc和rAd-Fc感染细胞中分别能扩增出预期大小的SRCR5_Fc、SRCR59-Fc、Sn4D-Fc 和 Fe 转录子(图 2)。
[0065]3.游离受体表达免疫荧光检测
[0066]在24孔板培养PK-15、3D4/21和猪肺巨噬细胞(PAM)，次日分别用重组腺病毒 rAd-SRCR5、rAd_SRCR59、rAd-Sn4D_Fc 和 rAd-Fc (感染指数=1)，培养 24 小时后，用IRDye800CW标记山羊抗猪IgG (美国Rockland公司)进行免疫荧光检测。结果显示重组腺病毒感染PK-15和3D4/21细胞为荧光强阳性，PAM细胞为弱阳性(图3)。
[0067]4.游离受体的纯化
[0068]在75cm2细胞瓶内培养PK-15细胞至密度约80%，次日分别用重组腺病毒rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc 转导(感染指数=1)，培养 48 小时后收集细胞上清，500g离心10分钟后小心吸取上清，按照Protein A Sefinose? (上海生工生物有限公司)说明书进行Fe融合蛋白纯化，各取10 μ L进行SDS-PAGE (12%分离胶)分离。结果显示:在四种重组腺病毒感染细胞中，能纯化到预期分子量的猪IgG Fe片段(SEQID N0.9)及 Sn4D-Fc (SEQ ID N0.10)、SRCR5_Fc (SEQ ID N0.11)和 SRCR59_Fc (SEQ IDN0.12)融合蛋白(图4)。
[0069]5.游离受体免疫鉴定
[0070]各取上述纯化蛋白10 μ L进行SDS-PAGE分离，按照IRDye800CW标记山羊抗猪IgG(美国Rockland公司)说明书进行免疫转印。结果显示:纯化的融合蛋白Sn4D_Fc，SRCR5_Fc和SRCR59-Fc以及猪IgG Fe片段均能与猪IgG反应(图5)。
[0071]6.游离受体的病毒结合试验
[0072]纯化游离受体与PRRSV结合试验参考报道的方法进行(文献:Van BreedamWj Delputte PL,Van Gorp H，Misinzo G,Vanderheiiden N，Duan X，Nauwynck HJ.Porcinereproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage.1Gen Virol，2010，91 (Pt7):1659_1667)。取 50%Protein A Sefinose Bead Slurry (上海生物工程有限公司)100 μ L，分别与PBS或25 μ g具体实施方案4纯化的pFc、Sn4D_Fc、SRCR5-Fc、SRCR59-Fc 混合，然后加入 VR2332 株 PRRSV，37°C孵育 90min，用 PBS 离心洗去未结合病毒，用试剂盒中的洗脱 液洗脱结合病毒，用RNAiso Plus Kit抽提病毒RNA，按照RevertAid? Reverse Transcriptase说明书反转录后，以下列PRRSV VP5特异引物进行PCR扩增。
[0073]正向引物:5-TTGAATGTTCAAGTATG_3(SEQID N0.13),
[0074]反向引物:5-ATCATTGCAGAAGTCGT-3(SEQID N0.14)。
[0075]结果显示:游离受体Sn4D-Fc和SRCR59_Fc能与PRRSV结合，而SRCR5_Fc和猪Fe不能与PRRSV结合(图6)。
[0076]7.游离受体的中和病毒作用检测
[0077]在24孔板培养PAM细胞(IO6细胞/孔)，次日用PRRSV感染。先将PRRSV(感染指数=1)与 O、25、50、100 μ g/mL 纯化猪 pFc、Sn4D_Fc、SRCR59_Fc 或 Sn4D-Fc+SRCR59_Fc 混合，37°C孵育I小时，然后接种PAM细胞培养。感染24h，用胰酶消化分散细胞，用4%多聚甲醛溶液室温固定30min，各取IO5细胞，以PRRSV N蛋白单克隆抗体(美国Rural Technologies公司)进行流式细胞术分析。结果与猪Fe处理组相比:Sn4D-Fc、SRCR59_Fc单独处理组的PRRSV阳性细胞数均下降55%，两者共同处理组(Sn4D-Fc+SRCR59-Fc)的病毒阳性细胞数平均下降78%)，两种游离受体对PRRSV感染具有协同抑制作用，且具有剂量依赖关系(图7)。
[0078]8.重组腺病毒及其组合细胞转导的抗病毒作用检测
[0079]将3D4/21或PK-15细胞培养于24孔双层培养板(CORNING公司)的上层作为供体细胞，PAM细胞培养于下层作为接受细胞。供体细胞用rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc单独转导或用rAd-Sn4D-Fc与rAd-SRCR59_Fc同时转导(转导指数=1)，设rAd-Fc转导对照组，洗去未结合重组病毒后继续培养48h。然后用VR2332株PRRSV感染PAM细胞(感染指数=0.5),感染后24h收获病毒,按报道的方法在MARC-145细胞上进行病毒滴定(文献:Jacobs AC, Hermann JR, Munoz-Zanzi C，Prickett JR, Roof MB, Yoon KJ.Stability ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus at ambient temperatures.JVet Diagn Invest, 2010, 22:257_260)。结果与 rAd-Fc 转导 3D4/21 细胞共培养组的 PRRSV滴度(5.61og TCID5tl)相比，与rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc单独转导细胞共培养的PAM细胞的PRRSV滴度分别下降1.0和1.1log,与两种重组腺病毒同时转导细胞共培养的PRRSV滴度下降3.51og (图8);与rAd-Fc转导PK-15细胞共培养组的PRRSV滴度(5.51og)相比，与rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59_Fc单独转导细胞共培养的PAM细胞的PRRSV滴度分别下降
1.1log,与两种重组腺病毒同时转导细胞共培养的PRRSV滴度下降3.81og (图8)。
[0080]9.重组腺病毒表达的游离受体协同中和PRRSV感染的剂量关系检测
[0081]将PK-15细胞培养于24孔双层培养板上层，PAM细胞培养于下层。供体细胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同时转导(转导指数=1)，设rAd-Fc转导对照组，洗去未结合重组病毒后继续培养48h，用不同剂量VR2332株PRRSV感染PAM细胞，感染后24h收获病毒，按上述方法进行病毒滴定。结果与rAd-Fc转导细胞共培养组的PRRSV滴度相比，4个PRRSV接种剂量的PAM细胞与rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同时转导细胞共培养后，PRRSV滴度下降3.9~5.21og,两者表达的游离受体对PRRSV感染的协同中和作用具有剂量依赖关系(图9)。
[0082]10.重组腺病毒表达的游离受体协同中和PRRSV感染的动态检测
[0083]将PK-15细胞培养于24孔双层培养板上层，PAM细胞培养于下层，供体细胞用rAd-Sn4D-Fc与rAd-SRCR59_Fc同时转导(转导指数=1)，设rAd-Fc转导对照组，洗去未结合重组病毒后继续培养48h，用VR2332株PRRSV感染PAM细胞，感染后不同时间收获病毒，按上述方法进行病毒滴定。结果与rAd-Fc转导细胞共培养组的PRRSV滴度相比，与rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同时转导细胞共培养不同时间后，PAM细胞的PRRSV滴度下降3.8~4.61og，两种重组腺病毒表达的游离受体对PRRSV感染的协同中和作用至少维持60h (图 10)。
[0084]11.重组腺病毒表达的游离受体协同中和不同毒株PRRSV感染的检测
[0085]将PK-15细胞培养于24孔双层培养板上层，PAM细胞培养于下层，供体细胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同时转导(转导指数=1)，设rAd-Fc转导对照组，洗去未结合重组病毒后继续培养48h，PAM细胞分别用JXA1、CH-1R、VR2332株PRRSV感染，感染后24h收获病毒，按上述方法进行病毒滴定。结果与rAd-Fc转导细胞共培养组的PRRSV滴度相比，接种3株病毒的PAM细胞与rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同时转导细胞共培养后，PRRSV滴度分别下降4.1,4.3和4.21og (图11)。
【权利要求】
1.表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组，是由表达猪唾液酸粘附素前4个IgV结构域和与猪IgG Fe片段融合蛋白的重组腺病毒，及表达脱衣壳受体⑶163第5_9个SRCR结构域与猪IgG Fe片段融合蛋白的重组腺病毒组成。
2.权利要求1所述重组腺病毒组在制备防治猪繁殖与呼吸综合征制剂中的应用。
3.权利要求1所述表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组的制备方法，其步骤如下: (O用化学合成法合成猪IgG重链信号肽序列，用反转录聚合酶链式反应扩增猪IgGFe片段、唾液酸粘附素前4个IgV结构域Sn4D和⑶163第5_9个结构域SRCR59编码序列。 (2)将Sn4D与Fe融合序列插入腺病毒载体pShuttle_CMV，获得重组载体pShuttle-Sn4D-Fc ;将猪IgG信号肽、SRCR59与Fe融合序列插入腺病毒载体pShuttle-CMV,获得重组载体 pShuttle-SRCR59_Fc.(3)用步骤(2)获得的两种重组载体转染AAV-293细胞，获得重组腺病毒rAd-Sn4D_Fc和 rAd-SRCR59-Fc0 (4)用AAV-293细胞扩增重组腺病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)是:将猪IgGFe片段编码序列分别与Sn4D、SRCR59编码序列融合，用Sn自身信号肽引导Sn4D_Fc融合蛋白分泌性表达，以猪IgG重链信号肽引导 SRCR59-FC融合蛋白分泌性表达。
【文档编号】A61K31/14GK103525775SQ201310485894
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】孙怀昌, 陈阳, 郭睿, 张鑫宇, 夏晓莉 申请人:扬州大学