一种用于抑制prrsv感染的脱氧核酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制PRRSV感染的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ?NO1。本发明的脱氧核酶能够有效的抑制PRRSV感染。
【专利说明】—种用于抑制PRRSV感染的脱氧核酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物酶【技术领域】，具体的说涉及一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的脱氧核酶。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征
[0003]猪繁殖与呼吸综合征(porcine!^productive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的一种急性传染病，该病的主要特征是繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等。PRRSV基因组为不分节段的单股正链RNA，基因组3’非编码区(3’ -UTR)有ploy (A)尾序列，5’非编码区(5’ -UTR)有帽状引导序列。基因组还有9个相互重叠的开放阅读框，ORFla和ORFlb主要编码病毒的RNA复制酶和聚合酶；0RF2-7分别编码GP2，E，GP3，GP4，GP5，基质蛋白M和核衣壳蛋白N。
[0004]PRRSV侵入宿主细胞主要是通过与细胞表面的特异性受体结合，利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。如猪肺泡巨噬细胞(PAM)和猴肾细胞(MA-104，Marc-145)。至今已报道了四个独立但功能相关的PRRSV受体:唾液酸粘附素Sn，硫酸乙酰肝素HS，波形蛋白Vimentin,清道夫受体蛋白0)163。
[0005]PRRSV于1987年在美国的北卡罗纳、衣阿华等州的猪群中首次爆发，此后呈全球性流行，给养猪业造成了严重的经济损失。我国于1996年，由郭宝清首次在国内某猪场分离到了 PRRSV。特别是2006年下半年，突变的PRRSV引起我国南方一些省份猪场爆发“高热”综合征，使我国的养猪业遭到了巨大的影响，以至于猪肉价格居高不下，影响了人们的生活水平。PRRSV—年四季都可发生，在每年的深秋至次年的早春，该病更为肆虐，给养猪业带来的损失已经远远超过某些A类传染病。尽管世界各养猪大国对PRRSV给予了足够的重视，但到目前为止人们对PRRSV非编码区，结构蛋白及非结构蛋白的功能、病毒的致病机制、病毒的持续性感染机制、机体对病毒的免疫机制等缺乏深入的认识而难于防治，而且一旦猪场发生PRRS后，需要花很大的费用和时间才能够净群，所以目前PRRS还是威胁各国养猪业的主要疾病之一。目前主要依靠综合防治措施控制该病的发生和传播。预防本病的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗，尚未有有效的治疗措施。
[0006]脱氧核酶
[0007]脱氧核酶(DNAzyme)是利用体外分子进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment, SELEX),从随机脱氧核苷酸库中获得的一种具有酶活性的DNA分子。通过该技术已筛选出具有核酸酶活性、激酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能的脱氧核酶。作为一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，具有很好的应用前景。目前最具有应用前景的是经典脱氧核酶“ 10-23 ”，无论是在体外应用于RNA限制性内切酶，还是在体内作为RNA水平上的基因失活剂，都具有很好的应用前景。“10-23”型脱氧核酶由29个核苷酸组成，其中的催化中心有15个核苷酸(GGCTAGCTACAACGA)，催化中心的两侧各连有8个核苷酸的结合臂，用于结合底物RNA。DNAzyme最重要的一种性质，也是目前研究最活跃的一个方面，是具有通过酯化作用而切割RNA分子的功能。DNAzyme这种独特的性质，使其有可能成为抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。[0008]由于RNA核酶片段较大，结构复杂，对靶位点的接近性差，并且合成十分困难，极易降解，使其应用受到限制。而DNAzyme的高效性、高特异性、高稳定性、短小精悍、易修饰、廉价低毒等特性使其作为一种新型的基因抑制工具，在多种领域的基因治疗中得到了广泛应用，许多针对病毒感染性疾病设计的DNAzyme已经进入临床实验评估阶段。随着各种研究数据的积累和新型高效传送载体的开发，DNAzyme必将在病毒学研究及病毒性疾病的治疗、酶学研究、生命进化研究、分子生物学、分子遗传学和医药生物技术等领域发挥更大的作用。
[0009]早在1997年，Santoro等就设计出可特异性切割人类免疫缺陷病毒(HIV-1) gag/pol、env、vpr、tat 和 nef mRNA 起始编码区的 DNAzyme。Banerjea 等则在 2003 年建立了快速鉴别靶标RNA切割位点的方法，针对HIV-1病毒基因5’末端顺式激活反应元件(TAR)筛选出许多切割位点用于抑制病毒的复制。针对乙肝病毒，研究者设计的DNAzyme可在0.1~
2.5mmol/L范围内以剂量依赖方式特异性抑制相应病毒基因的表达，并且抑制效率远远高于反义寡核苷酸。此外，于乐成等以“10-23”型DNAzyme催化基序设计的针对丙型肝炎病毒(HCV) 5’非编码区及部分C区的DNAzyme用于治疗HCV感染，也观察到了较好的抑制效果。DNAzyme还在其他病毒(呼吸道合胞病毒、人鼻病毒)中有很好的切割效果。尽管经典“10~23”型脱氧核酶的切割范围很广，但是切割效率及特异性还有待于进一步提高，尤其是避免随机切割非靶位点带来的副作用。目前对于脱氧核酶的结构和功能已有初步了解，但多数研究仍处于实验阶段。还必须寻找催化效率更高特异性更强的脱氧核酶，进一步了解其结构和功能特点。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种抑制PRRSV感染的脱氧核酶(ASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV)，其核苷酸序列为 SEQ NOl:
[0011]59 -nnnnnnnnnnnnnnnnaagtacnnnnnnnnnnggctacaacgannnnnnnn-3> ；
[0012]其中η可以为a或g或c或t ;
[0013]其中5’ -aagtac-3’为一个非配对环“Bugle”，其可以增强脱氧核酶的切割效率和特异性；
[0014]其中优选的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ N02:
[0015]5’ -ggtaaaagcacaattcaagtacagatcaaaaggggctagctacaacgagcagaagc-3> ；
[0016]其中另一个优选的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ N03:
[0017]5’ -gtgttcccgtgcagcaaagatcttgggctgggctagctacaacgagccaatgg-3> ；
[0018]其中另一个优选的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ N04:
[0019]5’ -tttttttttttttttttttaagtacttttttttaaggctagctacaacgatacggccgc-3> ；
[0020]其中另一个优选的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ N05:
[0021]5’ -acttttaagttcacaggaggtacagggtgaaggggctagctacaacgaccggttgtg-3> ；
[0022]其中另一个优选的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ N06:[0023]5’ -tcgacaagaaacatgaaagtactccaaatgcgggctagctacaacgaccagaacc-3>。
[0024]本发明的抑制PRRSV的脱氧核酶的设计原理为:
[0025]本发明的脱氧核酶的结合部位通过Watson-Crick碱基配对与底物RNA分子结合，催化部位(5’ -GGCTAGCTACAACGA-3’)在RNA分子的一个未配对的嘌呤和一个已配对的嘧啶碱基处切割RNA ;同时，于5’端加入一个6bp非配对环“Bugle”(5’ -AAGTAC-3’ )，增强脱氧核酶的切割效率和特异性；其次，所设计的脱氧核酶不形成自身分子内Watson-Crick碱基配对，同时，能够避开底物RNA中过长分子内碱基配对区和其它特殊高级结构；利用加拿大科学院ZUKER编写的PCFOLD计算机软件预测靶mRNA (M，5’_UTR，3’_UTR，ORFlb, CD163)切点两翼碱基序列切割片段的结合自由能，最后，将设计好的脱氧核酶直接在核酸合成仪上大量合成。
[0026]本发明的脱氧核酶能够有效的抑制PRRSV的感染，体外实验证明，其能有效的控制PRRSV感染Marc-145细胞，因此，可用于PRRSV感染的预防与治疗。
[0027]本发明的有益效果:
[0028]脱氧核酶既可以针对RNA，也可以切割或修饰DNA。病毒的基因组较简单，加之病毒生存周期活细胞依赖的特殊性，使病毒对于核酸损伤特别敏感，同时也使DNAzyme在病毒感染性疾病的治疗和诊断中的应用具有很好的可操作性和可行性。本发明的脱氧核酶在切割效率和稳定性上比经典“10~23”脱氧核酶效果更好，可以更有效的抑制PRRSV。对该脱氧核酶的深入研 究，对PRRSV的致病机理及防治有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图lASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV 转染后 72h 对 PRRSV 的抑制效果。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0031]材料来源
[0032]1.细胞、病毒及PRRSV阳性猪血清
[0033]本发明中细胞Marc-145登载于中国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取；PRRSV-S3毒株由上海市农业科学院畜牧兽医研究所病毒课题组从PRRSV感染病猪的内脏组织中分离获得(分离方法为:猪繁殖呼吸综合征病毒S3毒株的分离及其免疫特性研究.动物医学，2002，23(4):87-90)，后期经血清学试验，分子生物学试验，测序分析确定为美洲型PRRSV ；PRRSV阳性猪血清由上海市农业科学院畜牧兽医研究所病毒课题组攻毒PRRSV阴性仔猪获得。
[0034]2.工具酶和主要商品试剂
[0035](I)DMEM培养基(HycI ine )购自上海皓嘉科技发展有限公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco0
[0036](2) 100X青链霉素溶液:10,000单位/mL青霉素，10，000 μ g/ml链霉素溶于
0.85%NaCL溶液，-20°C保存。购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。
[0037](3) PBS 缓冲液(0.01M, pH=7.4):配制 400mL 溶液时，在 350mL ddH20 中加入:
[0038]
【权利要求】
1.一种用于抑制PRRSV感染的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQ NOl0
2.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQN02。
3.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQN03。
4.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQN04。
5.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其核苷酸序列为SEQN05。
6.根据权利要求1所述的脱·氧核酶，其核苷酸序列为SEQN06。
【文档编号】A61P31/14GK103525819SQ201310501257
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】李红, 易建中, 刘成倩 申请人:上海市农业科学院