异种角膜材料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种异种角膜材料的制备方法，该方法能够制备出透明性极高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的异种角膜材料，且保持胶原三维结构与新鲜角膜相近，并通过胶原交联进一步降低胶原的抗降解性和免疫原性。在制备全过程在保存、辐照和交联中使用不同浓度甘油，合理利用不同浓度甘油的特点及作用效果，达到使其异种角膜植片透明、无病毒及细胞的特性，并在全眼球保存下使用交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)交联，使其形态更接近新鲜角膜，并增加其生物力学性能。本发明制备的角膜材料在角膜胶原纤维结构的保存和移植后透明性能均有改善，能广泛应用于医疗领。
【专利说明】异种角膜材料的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，更具体地说，它涉及一种能直接应用于板层角膜移植的异种材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]角膜位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形，从前面看为横椭圆形。角膜是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力，加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。
[0003]同时，因角膜透明性丧失而导致的角膜盲是仅次于白内障的引起视力丧失的主要原因。眼外伤和角膜溃疡每年使150万~200万的人们失明。对于这种失明唯一有效的治疗是移植人类供体角膜(也称作“角膜移植术”)。
[0004]目前，市场上角膜材料的短缺和需求之间的巨大差距，在异体角膜如此缺乏并短期内难以改变的情况下，人们只能通过寻找各种方法来研制可替代的新材料来解决角膜的短缺问题。
[0005]已经报道并通过验证的新材料主要包括生物材料和异种角膜材料。按照现有的报道，生物材料的组织相容性差，尚不能在广泛应用；相比较而言，异种角膜材料具有更广阔的应用前景。目前的技术主要集中于使用蛋白酶(胰蛋白酶)或磷酸脂酶A2等化学方式去除异种角膜中的细胞。
[0006]问题是这些酶类 也会对胶原结构产生影响，对移植后的角膜细胞的长入也有一定的抑制作用，以往文献也发现移植后早期的植片混浊是异种角膜材料主要的弊端，故上述的具体处理方法和制备方法还有较大的空间去优化。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种异种角膜材料的制备方法，该方法能够制备出透明性极高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的异种角膜材料，且保持胶原三维结构与新鲜角膜相近，并通过胶原交联进一步降低胶原的抗降解性和免疫原性。
[0008]为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案，处理步骤应依次为:
一、处理:在动物死亡后四个小时内获取可作为异种角膜材料的眼球，依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球；
二、灭菌:将整个眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液IOml中，泡的时间为至少20分钟，20分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗；
三、细胞失活:将整个眼球转入溶液中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温
2-3°C，最终在_78°C的温度下进行长期保存，所述保存期限至少为4周，所述溶液包括甘油和缓冲溶液，其中甘油浓度为85%至95%，缓冲溶液浓度为5~15% ；四、灭病毒:将已经经过密封保存的整个眼球转至_20°C的保温容器中，用Y射线进行辐照，辐照剂量为25kGy ;
五、交联:将经过辐照的整个眼球转至含有20%至80%甘油的交联剂中，在4°C的温度下保存I至72小时，交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为1:1至3:1 ；EDC在溶液中最终浓度为1.0%至10.0% ；
六、植片制作:将经过交联的整个眼球取出，放于林格氏液中清洗2次，每次5分钟，清洗完成后沿眼球角膜缘后2毫米剪开，植片于角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为 200 μ m 至 550 μ m。
[0009]本发明制备异种角膜材料的方法主要有四大特点。
[0010]第一个特点是使用全眼球保存，使用全眼球保存具有以下优点:1、在步骤三中全眼球保存有效地保持了角膜胶原纤维中的三维结构和角膜固有形态；并且甘油对角膜的脱水过程更加温、缓慢和均匀，从而使胶原纤维的三维结构免受快速而强烈脱水的破坏；2、在步骤五中全眼球交联，在一定浓度的甘油保存下，眼球处于无脱水状态，有效的维持角膜的原始形态、厚度、曲率，角膜胶原纤维的构建和排列与新鲜角膜最为接近，在此状态下进行全眼球交联，有效控制交联的速度和强度，并在最接近角膜固有形态的条件下进行缓慢而均匀的交联，交联后能有效保存角膜形态和胶原纤维构象。上述原因使全眼球保存可以获得与新鲜角膜更为接近的角膜形态、胶原纤维构象，从而获得更为透明的角膜板层材料。
[0011]第二个特点 是在保存、辐照和交联中使用甘油。在步骤三中使用高浓度甘油(浓度为85~95%，其余5~15%使用缓冲溶液)有以下优点:a.甘油首先是冷冻保护剂，甘油具有保护组织和细胞免受冷冻和复温过程中的冰晶对细胞和组织损伤，可以有效保护角膜胶原纤维免受冷冻和复位的 影响，而且甘油无细胞毒性、分子量小、易溶于水，更容易洗脱；
b.甘油具有的强吸水作用，使角膜胶原有效地脱水。对胶原最佳的保存方法是脱水，与传统的冷冻干燥相比，高浓度甘油脱水具有相似的脱水效果，在全眼球下甘油脱水可以有效的保持角膜胶原形态，并且同时使角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞失活，降低细胞所产生的免疫反应，因此其脱水效果和优势远超过冷冻干燥法；c.甘油具有抗菌和病毒失活作用，已有文献报道甘油的病毒失活作用与甘油浓度、保存时间成正比。85%甘油保存2周可以使动物DNA病毒和RNA病毒失活，本发明中高于85%的甘油保存4周以上可以有效使病毒失活，使得异种角膜材料更加安全；d.甘油具有保护胶原纤维的作用。已知Y射线可以使胶原纤维发生强烈破坏致角膜胶原纤维构象改变，而国际公认的25kGy的Y射线虽能有效的杀灭细菌和病毒，但如此强度的射线辐照对角膜胶原纤维的破坏是非常严重的，而本发明中使用甘油保存，使角膜胶原纤维有效避免高强度的Y射线破坏，并使之更加透明；
e.在交联过程中使用具有吸水性甘油，中等浓度的甘油，有效避免角膜交联过程中的胶原溶胀，溶胀使角膜胶原纤维直径和胶原纤维间隙水肿增加而致角膜混浊，原因是角膜透明性与胶原纤维直径和纤维间隙具有高度相关性；较高程度的溶胀更使胶原纤维间的连接键断裂，角膜水肿难以恢复。中等浓度甘油有效的控制溶胀，使角膜厚度保持不变，并且在胶原纤维间隙保持与新鲜角膜相近的同时进行交联，更增加胶原纤维间的分子作用力，有效保护胶原三维结构，使之在移植术后水肿时间缩短、程度减轻，使角膜植片更透明。
[0012]第三个特点是选用的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，使角膜胶原纤维产生缓慢的胶原纤维内交联和胶原纤维间交联；且交联剂性质非常温和，胶原反应后残留的水溶性异脲很容易被洗脱。并且全眼球交联，使交联过程更温和，有效使交联剂更加缓慢地渗透至角膜胶原纤维基质和纤维束间，使组织达到均匀而完全的交联。
[0013]第四个特点是现有技术而言，工艺较简单，成本较低，且操作简便，易于工业化推广应用。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0015]实施例1
(1)处理:在猪死亡后2小时内获取猪眼球,依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球；
(2)灭菌:将整个眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液10 m中，泡的时间为至少20分钟，20分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗；
(3)细胞失活:将整个眼球转入装有溶液的甘油瓶中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温2-3°C，最终在_78°C的温度下保存8周，所述溶液包括浓度为95%的灭菌甘油和浓度为5%的缓冲溶液，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液；
(4)灭病毒:将密封保存在甘油瓶内的全眼球转至_20°C的保温盒中，用Y射线进行辐照，辐照剂量为25kGy ；
(5)交联:将保存溶液融化后，把眼球转至含80%甘油的交联剂中，在4°C下保存48小时，交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基`)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为3:1 ;EDC在溶液中最终浓度为10.0%(此处需说明的是，本发明所提及的交联剂可以为内交联剂或外交联剂，交联剂种类较多，应该实验表明，与甘油配合使用，来制备眼角膜材料的交联剂，效果最佳的是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS))；
(6 )植片制作:将经过交联的整个眼球取出后，放于林格氏液中清洗2次，每次5min，清洗完成后沿眼球角膜缘后2mm剪开，植片于自动角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为200 μ m，植片应用于实验兔角膜移植术；
(7)动物准备:选取新西兰大白兔，体重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥钠(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)进行麻醉；
(8)板层角膜移植:选取7.5mm角膜环钻，深度约2/3角膜厚度，取下角膜板层片，使用
7.75mm的环钻制作异种角膜植片，将异种植片对位缝合于角膜植床上，术后I天、I周、8周、6月观察角膜植片透明性，有无排斥反应。
[0016]实施例2
(1)处理:在猪死亡后2小时内获取猪眼球,依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球；
(2)灭菌:将整个眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液10 ml中，泡的时间为至少20分钟，20分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗；
(3)细胞失活:将整个眼球转入装有溶液的甘油瓶中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温2-3°C，最终在_78°C的温度下保存10周，所述溶液包括浓度为90%的灭菌甘油和浓度为10%的缓冲溶液，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液；
(4)灭病毒:将密封保存在甘油瓶内的全眼球转至-20°C的保温盒中，用Y射线进行辐照，辐照剂量为25kGy ；
(5)交联:将保存溶液融化后，把眼球转至含50%甘油的交联剂中，在4°C下保存48小时，交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为2:1 ；EDC在溶液中最终浓度为10.0%(此处需说明的是，本发明所提及的交联剂可以为内交联剂或外交联剂，交联剂种类较多，应该实验表明，与甘油配合使用，来制备眼角膜材料的交联剂，效果最佳的是1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS))；
(6 )植片制作:将经过交联的整个眼球取出后，放于林格氏液中清洗2次，每次5min，清洗完成后沿眼球角膜缘后2mm剪开，植片于自动角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为200 μ m，植片应用于实验兔角膜移植术；
(7)动物准备:选取新西兰大白兔，体重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥钠(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)进行麻醉；
(8)板层角膜移植:选取7.75mm角膜环钻，深度约7/12角膜厚度，取下角膜板层片，使用8.0Omm的环钻制作异种角膜植片，将异种植片对位缝合于角膜植床上，术后I天、I周、8周、6月观察角膜植片透明性，有无排斥反应。
[0017]实施例3
(1)处理:在猪死亡后2小时内获取猪眼球,依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球；
(2)灭菌:将整个眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液IOml中，泡的时间为至少20分钟，20分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗；
(3)细胞失活:将整个眼球转入装有溶液的甘油瓶中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温2-3°C，最终在_78°C的温度下保存12周，所述溶液包括浓度为85%的灭菌甘油和浓度为15%的缓冲溶液，缓冲溶液为生理盐水；
(4)灭病毒:将已经经过密封保存的整个眼球转至-20°C的保温容器中，用Y射线进行辐照，剂量为辐照25kGy ;
(5)交联:将保存溶液融化后，把眼球转至含20%甘油的交联剂中，在4°C下保存48小时，交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为1:1 ;EDC在溶液中最终浓度为1.0% ；
(6)植片制作:将经过交联的整个眼球取出，放于林格氏液中清洗2次，每次5分钟，清洗完成后沿眼球角膜缘后2毫米剪开，植片于角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为150 μ m，植片应用于实验兔角膜移植术；
(7)动物准备:选取新西兰大白兔，体重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥钠(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)进行麻醉；(8)板层角膜移植:选取10.0mm角膜环钻标记，在12点钟深度约1/2角膜厚度，分离角膜层间，层间植入5.5mm大小的异种角膜植片，植片植入，术后I天、I周、8周、6月观察角膜植片透明性，有无排斥反应。
[0018]本发明制备的角膜材料在角膜胶原纤维结构的保存和移植后透明性能均有改善，能广泛应用于医疗领。
【权利要求】
1.一种异种角膜材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)细胞失活:在已死亡动物体上获取可作为异种角膜材料的眼球，整个眼球转入溶液中密封保存，保存过程中逐渐降温，每分钟降温2-3°C，最终在-78°C的温度下进行长期保存，所述保存期限至少为4周，所述溶液包括甘油和缓冲溶液，其中甘油浓度为85~95%，缓冲溶液浓度为5~15% ； (2)灭病毒:将上述步骤(1)中已经经过密封保存的整个眼球转至-20°C的保温容器中，用Y射线进行辐照，辐照剂量为25kGy; (3)交联:将上述步骤(2)中的整个眼球转至含有20~80%甘油的交联剂中，在4°C的温度下保存I~72小时； (4)植片制作:将上述步骤(3)中的整个眼球沿眼球角膜缘后2毫米剪开，植片于角膜板层切削器中，切削器对角膜的切削厚度为200~550 μ m。
2.根据权利要求1所述的异种角膜材料的制备方法，其特征是:交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，它们之间的质量比为1:1~3:1 ；EDC在溶液中最终浓度为1.0~10.0%。
3.根据权利要求1或2所述的异种角膜材料的制备方法，其特征是:眼球应是在动物死亡后四个小时内获取,对已获取的整个眼球在进行密封保存之前,应依次用浓度为2%的碘伏和浓度为0.9%的生理盐水来冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用浓度为2%的碘伏冲洗整个眼球，冲洗完后再用浓度为0.9%的生理盐水冲洗整个眼球。
4.根据权利要求3所述的异种角膜材料的制备方法，其特征是:在进行密封保存之前，还应该将整个眼球泡入含有40毫克妥布霉素的50%高糖溶液中，泡的时间为至少20分钟，20分钟后用浓度为0.9%的生理盐水对整个眼球进行冲洗。
5.根据权利要求1或2所述`的异种角膜材料的制备方法，其特征是:在沿眼球角膜缘后2毫米剪开之前,应该将整个眼球放于林格氏液中清洗2次,每次5分钟。
【文档编号】A61L27/24GK103550826SQ201310527550
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】陈蔚, 郑钦象 申请人:广州优得清生物科技有限公司