一种j亚群禽白血病dna疫苗的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用；本发明构建了表达鸡免疫球蛋白G的Fc片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env。通过瞬时转染及间接免疫荧光试验，证实pcDNA3.1-Fc-env能够在293T细胞中正确表达。大量提取质粒，质粒纯化定量到1mg/ml，然后将重组质粒免疫小鼠，每只100ug，免疫三次，每次间隔两周。通过检测血清中ALV-J?env蛋白特异性抗体水平；显示pcDNA3.1-Fc-env具有预防J亚群禽白血病的作用。
【专利说明】一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用，属于兽用核酸疫苗领域。
二、【背景技术】
[0002]J 亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J, ALV-J)是 1988 年首次从大不列颠白羽肉鸡中分离得到的一种禽白血病病毒新的亚群，主要引发白羽肉鸡的髓细胞组织增生和肿瘤。ALV-J与A、B亚群一样，属于外源性禽白血病病毒，在鸡体内既能垂直传播也能水平传播，且J亚群水平传播的速度远远高于A、B亚群病毒，该病已迅速蔓延到许多国家，使养鸡业面临一个严重问题。 [0003]在我国，ALV-J随着引进的白羽肉种鸡带进了我国白羽肉鸡群。在1999年，从市场上的商品代肉鸡中首次分离检测到ALV-J，最早的毒株分别定名为SD9901、SD9902和YZ9901、YZ9902。后来又不断从其他不同的省份分离到ALV-J。随后，ALV-J又进一步传入到我国自主培育的黄羽肉鸡、固有型地方品种鸡及蛋用型鸡。ALV-J不仅给我国规模养鸡业带来很大损失，也威胁到我国历史上形成的地方鸡品种的种质资源库[1_3]。
[0004]目前ALV-J的防治没有商品化的疫苗，主要依靠净化种鸡群的办法来控制和清除ALV-J。由于养殖环境已被污染，完全实施净化是艰难和不可能完全实现的。早在20年前，欧美国家就有学者研制鸡ALV疫苗，但没有成功。Brumester等人曾经尝试研制ALV灭活疫苗，但是发现在灭活病毒的同时，也会使疫苗的免疫原性几乎随之丧失，不致病性的ALV弱毒活疫苗的研制也宣告失败。国外随着ALV在商品化鸡群中被基本净化，就不再做ALV疫苗的研究了。目前已经证实使用重组的ALV作为疫苗清除或降低ALV感染是可行的。通过表达ALV-A和ALV-J的重组囊膜糖蛋白作为免疫原的亚单位疫苗可作为潜在的疫苗，用于防止ALV的水平传播。近年来，崔志中等分别实验了 A、B、J亚群ALV感染细胞的灭火疫苗及病毒中和反应相关的gp85亚单位疫苗的免疫效果。结果表明，机体对不同亚群ALV灭活疫苗或亚单位疫苗的免疫反应性都很差,但经过重复免疫后，还能够诱发一定水平抗体的形成，而且有助于缩短攻毒后病毒血症的持续期[4]。
[0005]env蛋白是ALV三个主要结构蛋白之一，是病毒的囊膜蛋白。env蛋白在与宿主细胞表面的特异性受体结合，是病毒进入宿主细胞复制，诱导肿瘤发生的必须条件，所以从病毒感染细胞、复制和表达以及肿瘤发生的整个过程来看，env蛋白在ALV的致病、致瘤中具有非常重要的作用[5]。因此我们选择env蛋白作为核酸疫苗的靶基因。
[0006]核酸疫苗是20世纪90年代后发展起来的新型疫苗之一，具有制备方便、免疫力持久、副作用少并能诱导T细胞和B细胞介导的细胞核体液免疫等优点，但是该疫苗存在产生抗体慢、水平低的缺点，需要有效的佐剂进行克服。目前ALV-J DNA疫苗的开发还未见报道。
[0007]抗体是一个呈“Y”形的蛋白，Y的上面与抗原表位结合，下面的那一竖又叫Fe，即可结晶片段。在巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面具有免疫球蛋白G的Fe片段受体。Fe与Fe受体结合，可以让巨噬细胞吞噬被抗体结合的抗原[6]。[0008]本专利就是利用抗体Fe基因表达产物作为分子佐剂，增强env蛋白基因疫苗的免疫效果。
三、
【发明内容】
:
[0009]为了解决上述问题，本发明提供了一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用；构建了表达鸡免疫球蛋白G的Fe片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env。通过瞬时转染及间接免疫荧光试验，证实pcDNA3.1-Fc-env能够在293T细胞中正确表达。大量提取质粒，质粒纯化定量到lmg/ml，然后将重组质粒免疫小鼠，每只IOOug,免疫三次,每次间隔两周。在每次免疫一周后小鼠尾部采血,分离血清,检测血清中ALV-J env蛋白特异性抗体水平。结果显示pcDNA3.1-Fc-env能够诱导小鼠产生较高水平的抗体。且随着免疫次数的增加不断上升，与空白对照组差异显著。综上，pcDNA3.1-Fc-env具有预防J亚群禽白血病的作用。
[0010]具体的，本发明包括以下各项内容:
[0011]1、一种J亚群禽白血病DNA疫苗，所述J亚群禽白血病DNA疫苗是包含编码鸡免疫球蛋白G的Fe片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因的重组真核表达质粒。
[0012]2、所述鸡免疫球蛋白 G的Fe片段基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]3、所述J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0014]4、具有如SEQ ID N0.3所示的序列重组真核表达质粒用作预防J亚群禽白血病DNA疫苗的作用。
[0015]一种J亚群禽白血病DNA疫苗的制备过程，包括以下步骤:
[0016]1、鸡IgG-Fc基因克隆
[0017]根据NCBI已发表的鸡IgG重链序列(X07174.1)，设计引物，在上游引物中加入EcoR I酶切位点和ATG起始密码子，下游引物去除终止子，通过RT-PCR方法得到鸡IgG-Fc基因;
[0018]2、ALV-J env 基因的克隆
[0019]按照ALV-J env基因设计引物，上游引物中加入与IgG Fe段互补序列，下游引物中加入Xba I酶切位点，克隆得到ALV-J env基因；
[0020]3、Fc-env融合基因的扩增
[0021]将鸡IgG-Fc基因和ALV-env基因核酸分别做1000倍稀释，作为反应的模板，以鸡IgG-Fc上游引物和env下游引物作为一对引物进行重叠PCR ;利用限制性内切酶EcoR 1、Xba I酶切pcDNA3.1克隆载体；利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收线形化的载体；利用限制性内切酶EcoR 1、Xba I酶切重叠PCR产物(Fc-env)利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收已切好的Fc-env DNA ;将线形化的载体与回收的DNA片断用T4DNA连接酶连接过夜即完成重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env的构建。
[0022]将pcDNA3.1-Fc-env转化大肠杆菌DH5 a，即得到重组大肠埃希氏菌ALVFc(Escherichia coli)。已于2013年9月5日保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编=100101 ;菌种保藏编号为:CGMCC NO:8136。[0023]本发明的有益效果:[0024]将pcDNA3.l_Fc-env肌肉注射小白鼠，可产生抗禽白血病病毒的特异性抗体和细胞免疫。
四、【专利附图】
【附图说明】
[0025]图lALV-env 基因、IgG Fe 片段基因与 pcDNA3.1 载体构建的 pcDNA3.1-Fc-env酶切鉴定结果:1是pcDNA3.1-Fc-env表达载体双酶切产物；M是DNA分子量标记8K DNAMarker0
[0026]本图显示pcDNA3.1-Fc-env构建成功及酶切特性。
[0027]图2间接免疫荧光检测pcDNA3.1-Fc-env转染293T细胞中的表达:A为pcDNA3.1-Fc-env转染的293T细胞；B为阴性对照
[0028]本图显示pcDNA3.1-Fc-env可表达出重组Fc-env融合蛋白。
[0029]图3Env蛋白特异性抗体检测结果
[0030]本图说明pcDNA3.1-Fc-env可诱导抗禽白血病病毒Env特异性抗体。
五、【具体实施方式】
[0031]实施例一 J亚群禽白血病DNA疫苗pcDNA3.1-Fc-env的制备
[0032](一)鸡IgG-Fc基因克隆及鉴定
[0033]根据NCBI已发表的鸡IgG重链序列(X07174.1)，设计引物，在上游引物中加入EcoR I酶切位点和ATG起始密码子，下游引物去除终止子，通过RT-PCR方法得到鸡IgG-Fc基因。
[0034]1、鸡脾脏总RNA的提取
[0035]I)称取适量大小的脾脏组织于1.5ml离心管中，加入500ulBuffer LY和IOul^ —巯基乙醇在振荡器上剧烈震荡2分钟。然后静置2分钟，将组织碎块沉在管底。
[0036]2)将上清液倾倒入一个DNA间隙柱内，13000rpm两分钟,弃去DNA柱子(将溶液中的DNA滤去)，保留下边收集管中的液体。
[0037]3)在步骤2)收集管中的液体中加入收集液1/2体积的100%乙醇。
[0038]4)将步骤3)中收集管中的混合溶液倒入一个RNA柱子里，13000rpm离心I分钟，弃去收集管中的液体和收集管，将RNA柱子放入一个新的收集管中。
[0039]5)加入500ul Buffer RB到RNA柱子中，13000rpm离心I分钟，弃去流出液将RNA
柱子重新放回收集管中。
[0040]6)加入500ulRNA Wash Buffer到RNA柱子中，13000rpm离心I分钟，弃去流出液。
[0041]7)重复步骤6 —次，将RNA柱子打开盖子放进一个新的收集管中。
[0042]8) 13000rpm离心2分钟。将残存的乙醇去除干净对于下一步RNA的洗脱是至关
重要的。
[0043]9)将RNA柱子放到一个没有RNA酶的1.5ml的离心管中。加入50_100ulDEPC处理过的双蒸水，13000rpm离心I分钟。RNA保存于离心管中，_80°C储存备用。
[0044]2、反转录反应[0045]按下列组份配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)
[0046]
【权利要求】
1.一株保藏号为CGMCC N0:8136的大肠埃希氏菌ALVFc，已于2013年9月5日保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如SEQID N0.3所示序列的重组真核表达质粒pcDNA3.l_Fc_env在预防J亚群禽白血病中 的应用。
【文档编号】A61P35/02GK103614329SQ201310547369
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】常维山, 崔治中, 郭浩 申请人:山东农业大学