链激酶突变体及其共价修饰形式的制作方法
【专利摘要】本发明涉及链激酶的新的突变体、其功能片段和共价修饰形式。提供制备细菌纤溶酶原激活物蛋白链激酶、其突变蛋白、物种变体和它们的共价修饰变体的方法，它们的特征是改进的治疗性质，如增加的蛋白水解稳定性、延长的血浆半寿期、降低的免疫反应性和增强的血纤蛋白凝块特异性。所述方法涉及向蛋白质的非必需区中掺入额外的半胱氨酸残基或者用半胱氨酸残基取代天然存在的氨基酸，使得所得蛋白质的催化活性保持大部分不变。这些半胱氨酸变体通过共价连接半胱氨酸反应性聚合物如聚乙二醇(PEG)或者来自包括荧光团、自旋标记物或者其他小缀合物的基团的巯基反应性结构部分进行进一步修饰。本文公开了链激酶和其共价修饰变体的位点特异性生物活性缀合物。
【专利说明】链激酶突变体及其共价修饰形式
[0001]本申请是国际申请号PCT/IN2009/000212，国际申请日2009年3月31日，进入中国国家阶段日期为2010年11月30日，中国申请号200980120111.3，发明名称为“链激酶突变体及其共价修饰形式”的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及链激酶突变体及其共价修饰形式。本发明利用链激酶和其具有取代、添加、缺失的相关变体或结构域融合构建体的同质的、位点特异的和确定的PEG修饰来允许它们以改进的蛋白质治疗剂的形式应用。
[0003]本发明涉及使用硫羟反应性PEG试剂将PEG共价连接到链激酶的半胱氨酸变体、链激酶的突变蛋白、物种变体或血纤蛋白融合产物。还可以利用α胺基的不同PKa值在酸性PH下实施α胺特异性PEG缀合以产生链激酶或其突变蛋白的单-PEG化衍生物。
[0004]本发明还涉及基于结构和功能信息鉴定链激酶的多种半胱氨酸变体，或其突变体，包括相关的共价变体(Wang等，1998)。其他单结构域纤溶酶原激活物葡萄球菌激酶(SAK)的结构比较显示出与SKa结构域的强烈相似性，尽管这两种酶在氨基酸水平上没有显著的序列相似性(Rabijns等，1997)。这表明来自不同来源的纤溶酶原激活物尽管它们的多肽序列非常不同，但是仍然保留了相同的结构折叠。预期其受到进化限制来保持结构完整性，因为细菌纤溶酶原激活物是蛋白质辅因子，因此利用酶原的构象激活所需的多个接触点。此类结构相似性进一步延伸了本发明的范围，因为本案中实施的方法可以应用于来自其他属或种的具有相似的纤溶酶原激活结构域的细菌纤溶酶原激活物。为此，本文中公开的用于产生链激酶的生物活性半胱氨酸变体的“规则”将可以用于产生多种其他形式链激酶的生物活性的半胱氨酸变体。这些半胱氨酸变体与半胱氨酸反应性PEG的缀合将赋予与本研究中所用的变体所得的益处相似的益处。确定半胱氨酸放置位点的规则很大程度上基于从表面暴露的残基进行选择这一想法，所述表面暴露的残基落入环或螺旋或片层中或者在结构和柔性区的 边界中。为了确定表面可及性，使用DSSP程序。DSSP(Kabsch等，1983)程序确定了蛋白质的二级结构、几何特征和溶剂暴露，以蛋白质数据库(ProteinData Bank)形式给出原子坐标。DSSP以平方埃描述每个残基的暴露。从微纤溶酶复合体中链激酶的高分辨率晶体结构译解链激酶氨基酸残基的表面可及性(Wang等1998，PDBID1BML)。对于在该结构中缺失的区域(175-181和252-262)，分离的β结构域的晶体结构域(Wang等，1999，H)BIDlc4p)用于确定表面暴露。
[0005]将链激酶的半胱氨酸变体、其突变蛋白、物种变体和其共价修饰形式通过连接巯基反应试剂进一步化学修饰，接着根据经验测试生物活性的实质性保留以及新性质的获得，所述新性质如降低的免疫原性，或者与抗SK抗体的反应、降低的蛋白水解敏感性、增加的体内存活等等。更具体地，本发明涉及生产工程化的链激酶衍生物用于治疗循环系统病症的药物组合物中。
[0006]发明背景
[0007]循环系统中血栓(血块)发展可以引起血管阻塞，导致致命的状况。凝块的产生和其溶解是高度受控的止血过程。正常止血的任何偏差都导致多种临床状况，如中风、肺栓塞、深静脉血栓形成和急性心肌梗死。止血失败所引起的病理生理学状况需要迅速的临床注意。此类病例的最常用的医学干预是静脉内施用血栓溶解剂(Collen等，1988 ;Collen，1990 ； Franc is和Marder，1991)。最常用的血栓溶解剂包括链激酶(SK)、尿激酶(UK)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。在过去已经进行了急性心肌梗死处理中使用不同的溶栓剂的多种药物经济学评估(Mucklow, 1995 ；Gillis和Goa, 1996)。Banerjee等，2004,已经论述了链激酶的临床有用性和其作为选用药的适用性。就临床效果而言，链激酶和tPA几乎同样好，但是由于相差几倍的低成本和稍长的体内半寿期，链激酶是世界上最优选的溶血栓药(Sherry和Marder, 1991, Wu等，1998)。而且，tPA的使用稍微更可能引起中风,其是两种药物的主要副作用。然而，链激酶是一种细菌蛋白质，本质上是抗原性的，并且可以引起临床并发症，如过敏反应或者出血。而且，链激酶的循环半寿期(15-30分钟)不足以有效溶栓(Wu 等，1998)。
[0008]尽管存在这些问题，但是近年来，用溶血纤蛋白药如链激酶(SK)、组织纤溶酶原激活物(TPA)或尿激酶(UK)的溶栓疗法已经彻底改变了多种循环系统疾病如深静脉血栓形成、肺栓塞和心肌梗死的临床处理。这些药物通过切割纤溶酶原(PG)中残基561和562之间易断裂的肽键活化循环系统中的纤溶酶原(PG)而发挥其溶解血纤蛋白的效果。结果，无活性的酶原被转化成其活性形式:丝氨酸蛋白酶纤溶酶(PN)，其然后在系统中循环并作用于血纤蛋白以将其降解成可溶的降解产物。在这里可提及的是PN，其自身不能将PG活化成PN ;该反应被高度特异性蛋白酶像TPA、SK-纤溶酶原复合体和UK催化，所有这些蛋白酶都具有异常窄的蛋白质底物偏好性，即倾向于以高度位点特异性方式切割PG中易断裂的肽键。然而，不像UK和TPA，SK自身没有蛋白水解活性，并且它“间接”将PG活化为PN，即通过首先与PG形成高亲和力等摩尔复合体，这称作激活物复合体(Castellino，F.J.，1981综述)。该激活物复合体然后作为蛋白酶将PG的其他底物分子切割为PN。[0009]尽管在链激酶和其他细菌溶栓剂的治疗应用中取得了巨大的发展，但是仍然有一些缺点限制了这些多肽药物的有用性。这些缺点包括它们对蛋白水解酶降解的敏感性、短的循环半寿期、短的保存期、快速肾清除率和它们产生中和性抗体的倾向性。这些缺点有时也是非人源的许多其他多肽药物所固有的。这方面一般由Roberts等；2002综述。进行了多种尝试来克服多肽药物中的这些缺点，如改变氨基酸序列以减少蛋白酶解或抗原性，将多肽与球蛋白或白蛋白结构域融合以提高半寿期等等(Osborn等.2002)。这些方法对该问题提供了很少帮助并且带来了相关的负担。该领域的主要突破是蛋白质PEG化方法，其对多个问题提供了一种解决方法。通过将乙二醇的许多重复亚基聚合形成PEG(聚乙二醇)，产生具有定制的分子量的线性或分枝的PEG聚合物。一旦用PEG共价缀合，蛋白质或多肽就显示出改善的药代动力学和药效学性质，如增加的水溶性、降低的肾清除率和通常充分有限的免疫反应性(Moreadith等.2003，Doherty等，2005，Basu等，2006)。PEG缀合也使得分子对蛋白水解敏感性降低。PEG加入后降低的受体相互作用或降低的与细胞表面蛋白质的相互作用也帮助减少不利的免疫学作用。PEG化的药物在宽范围的pH和温度改变下更稳定(Monfardini等1995)。PEG的使用被FDA批准用于治疗剂并且其显示出几乎没有毒性并且被肾脏从身体完整除去或者在粪便中排出。PEG缀合的有益特征可以被潜在赋予SK使得其成为更有效和更安全的溶血栓药。在文献中报导了使用相对非特异性化学修饰反应进行SK PEG化的尝试(Rajagopalan等，1985)。此类修饰的治疗用途受到高度受损的纤溶酶原活化能力的严重限制。而且，修饰的性质的确定性很差并且在本质上是异质的。该异质性区域是由于用于PEG修饰的化学方法，其不能定向修饰特定位点。这可能是为什么此类修饰策略没有被用于开发改进的基于SK的溶栓剂的原因。
[0010]本文中使用的术语“链激酶”全体表示:链激酶的变体、其功能片段、功能突变蛋白、来自不同物种的分离物和通过连接天然或人工来源的寡肽或多肽得到的融合产物中的任一种。
[0011]已知蛋白质中存在的不同的官能团可以用于PEG引入。最常用的技术是蛋白质中赖氨酸残基或半胱氨酸残基的衍生化。N-末端的α氨基也可以用于蛋白质中PEG的单一同质缀合(Baker等，2006)。然而，使用半胱氨酸残基来携带掺入的PEG基团是尤其有利的，因为，潜在地，-SH基可以以位点定点特异性方式被靶定，尤其在蛋白质带有或使得带有非常有限数目的半胱氨酸残基的情况下。毫不夸张地说，当蛋白质缺乏任何半胱氨酸残基时，PEG缀合成为一种艺术形式，因为其对于蛋白质的位点特异性PEG “绘画”或者装饰，为半胱氨酸添加、插入或取代留下了几乎空白的画布。因为半胱氨酸向无半胱氨酸的背景的潜在加入可以对蛋白质功能具有不利效果。因此，制备半胱氨酸变体的位点选择需要小心的规划和执行。相比，例如对于PEG化的基于赖氨酸的修饰，尽管化学方法是成熟的，但是反应中的异质性是一个大的缺点。对于SK的情况，许多赖氨酸残基都沿着多肽均匀散布，因此限制了同质位点特异性PEG缀合的可能性。更有趣的是，在链激酶分子中不存在天然半胱氨酸(Malke等，1985)，从而使得可能产生链激酶的多种半胱氨酸变体。通过与血纤蛋白结合结构域融合得到的天然折叠的SK中也没有自由的半胱氨酸(参考美国专利7，163,817)。这使得可能制备多种含自由半胱氨酸的凝块特异性链激酶的变体而不实际上干扰富含半胱氨酸的蛋白质的正常再折叠(所有半胱氨酸残基都参与二硫键形成)。所引入的自由半胱氨酸可以与多种巯基反应试剂(包括PEG)反应，产生这些蛋白质的半胱氨酸加合物。
[0012]链激酶(SK)是由多种·溶血链球菌产生的分泌型蛋白质的一般名称，其能够诱导血浆凝块的溶解(Tillet和Garner，1933)。因为它可以从其亲本来源或者通过重组DNA技术从其适当的异源宿主容易且经济地产生，所以SK是非常划算的并且从而是主要的溶栓药，特别是对于全世界注重成本的市场而言。发现SK在冠状动脉血栓形成后的急性心肌梗死的临床治疗中非常有效(ISIS-3，1992)，并且在30年以上的时间里用作血栓溶解剂。然而，它有许多缺点。已知通过链激酶介导的纤溶酶原活化产生的纤溶酶在它注射不久后分解链激酶(Rajagopalan等，1985, Wu等，1998)。这将链激酶的体内半寿期限制到约15分钟(Wu等，1998)。尽管链激酶在循环中比另一种溶血栓选用药TPA (半寿期短于5分钟；R0SS，1999 ；Ouriel, 2002)存在明显更长时间，但是这对于有效的疗法仍然很短(Wu等，1998)。因为认识到与可用的纤溶酶原激活物的快速体内清除相关的缺点，正尝试开发这些化合物的改进的重组变体(Nicolini 等.1992, Adams 等.1991, Lijnen 等.1991 ；Marder.1993,和Wu等.1998)。尽管存在其内在问题，但是链激酶因为其相对低廉的成本(例如，与TPA的每次治疗约1500美元相比，链激酶的每次治疗约50美元或更低)而仍然是选用药，尤其在发展中国家中。
[0013]Tillet和Garner (1933)首次报导链激酶引起血块的溶解。然而，后来确定SK的血纤蛋白溶解活性来自其活化人纤溶酶原(HPG)的能力(Castellino，1979综述)。链激酶主要由β溶血组A、C和G链球菌分泌。SK是人PG的激活物，尽管其自身不是蛋白酶，相反，其结合到人PG/PN并且募集其他的HPG分子作为底物并且将这些底物转化为PN产物。PN在血流中循环。纤溶酶是非特异性蛋白酶，SK注射后全身且立即的PN产生导致多种血液因子的大规模破坏，导致出血危险，以及ECM和基底膜(BM)的溶解，并增强了细菌向宿主体内继发感染部位的侵入(Esmon和Mather, 1998 ; Lahteenmald等，2001)。从而，迫切需要通过设计改进的SK类似物以使副作用最小化。
[0014]因为SK是有效的血纤蛋白凝块溶解剂，所以其在全世界被广泛用作溶栓药，然而，其具有自身的局限。SK是从β溶血链球菌产生的蛋白质，其在人体中的应用诱导免疫原性(McGrath 和 Patterson, 1984 ；McGrath 等，1985 ；Schweitzer 等，1991)。已知首次 SK施用后产生的高滴度的抗SK免疫球蛋白(Ig)在患者中存在数月到数年(Lee等，1993)。从而，抗 SK 抗体由于施用时中和了 SK (Spottal 和 Kaiser, 1974 ； Jalihal 和 Morris, 1990)或者由于引起一系列过敏反应(McGrath和Patterson, 1984 ;McGrath等，1985)而严重限制了其作为未来的重复疗法的应用。
[0015]如前面提到的，链激酶在血栓溶解疗法中的应用除了受其免疫原性限制外还受到该蛋白质相对较短的体内半寿期(几分钟)(实际上所有当前使用的溶栓药都存在这种情况)的限制。观察到外源蛋白质当被引入脊椎动物循环系统时通常被肾脏快速清除。在链激酶的情况下该形势变得更加严重，其中不断更高剂量的蛋白质(以克服基于抗体的快速中和)可以严重增加变态反应的可能性，使得重复施用基本上是无效的和危险的。一般而言，解决这些问题的尝试在文献中详细记载，其中已经表明多种物理和化学改变可用于产生改进的治疗剂,例如见:Mateo, C.等 2000.Lyczak, J.B.Morrison, S.L.1994，Syed,
S.等；1997，Alien，T.Μ.1997。迄今这些尝试中最有希望的是通过共价连接聚环氧烷聚合物，尤其聚乙二醇(PEG)来修饰治疗性蛋白质的方法。PEG是非抗原性的惰性聚合物并且已知延长蛋白质在体内的循环半寿期(Abuchowski等，1984 ；Hershfield, 1987 ;Meyers等，1991)。这允许使用的药物延长作用时间。认为PEG与蛋白质的缀合增加了它们的总体大小并且因此降低了其快速肾清除率。PEG连接也使得蛋白质或多肽水溶性增加并且增加了其在体内条件下的稳定性以及显著降低免疫原性和增加体内稳定性(Katre等，1987 ；Katre,1990)。美国专利号4，179，337公开了使用与PEG或者聚丙二醇偶联的蛋白质提供生理活性的非免疫原性水溶性多肽组合物。尽管PEG缀合化学方法多数是一般性的但是PEG聚合物在治疗性蛋白质中的策略性放置对于获得成功的结果是至关重要的。三维结构信息以及通过多种解析研究标记的功能热点的可用性，有助于设计突变方案来保持功能完整。
[0016]通过用溴化氰产生的SK片段的顺序Edman降解分析和酶学方法测定SK的完整氨基酸序列(Jackson和Tang，1982)。结果表明分子量M,为47，408Da，在单条多肽链氨基酸序列中含有415个氨基酸。
[0017]1985年，Malke和同事对来自似马链球菌(S.equisimilis)H46A (用于SK生产的原型菌株，其最经常治疗性用于人类中)的核苷酸序列。也研究了该基因的转录控制并且报导了其复杂启动子的功能分析(Grafe等，1996)。因此，存在大量信息用于有效使用该基因在相对非致病性微生物中安全地生产链激酶。
[0018]附图简述
[0019]图1.SDS-PAGE,显示了纯化的链激酶半胱氨酸变体和它们的PEG加合物。[0020]图A显示了链激酶的α结构域的半胱氨酸变体(SEQ ID Ν0:30)，其中柔性环88-97中的第95位的天冬氨酸已经用半胱氨酸替换。这样产生的该独特的半胱氨酸用20KDa的硫羟反应性PEG聚合物甲氧基-PEG马来酰业胺PEG化，接着纯化得到同质的蛋白质-PEG加合物。
[0021]图B显示了 SKP结构域的半胱氨酸变体(SEQ ID NO:49)，其中β结构域的250环中的第258位丝氨酸被半胱氨酸替换。这样产生的该独特的半胱氨酸用硫羟反应性PEG聚合物甲氧基-PEG马来酰亚胺PEG化，得到更高分子量的蛋白质-PEG加合物。
[0022]图C显示了链激酶的半胱氨酸变体，其中链激酶的最初序列已经通过在C-末端位置加入半胱氨酸延伸了一个氨基酸(SEQ ID NO:490)。在C-末端这样产生的硫羟(C-CYS)已经与20KDa的甲氧基-PEG马来酰亚胺交联得到更高分子量的蛋白质-PEG加合物。
[0023]图D显示了链激酶的双PEG化变体(SEQ ID NO:491)，其中在链激酶的初始序列的N和C末端各自放置了一个半胱氨酸。这样产生的双半胱氨酸突变体已经用分子量为20KDa的PEG修饰。
[0024]图2描绘了 pET-23d_SK的环状图谱，pET-23d_SK是用于在大肠杆菌(E.coli)中表达链激酶的表达载体。该环状图谱突出了 pET-23d载体(基于T7-RNA聚合酶启动子的表达载体)(Studier等，1990)上的一些选择的独特RE位点，和所掺入的编码SK的基因，其用于构建和表达SK和其突变蛋白。
[0025]图3显示了通过分光光度法得到的nSK和双PEG化的链激酶变体NC1-414 (SEQ IDNO:491)对HPG活化的进行曲线。可以注意到，进行曲线显示出双PEG化的NC1-414活化纤溶酶原的能力显著滞后，但是nSK不是这样的情况。
[0026]图4显示了 nSK或者双PEG化NC1-414(SEQ ID NO:491)与人纤溶酶的等摩尔复合体的HPG活化的进行曲线。双PEG化链激酶NC1-414与纤溶酶的预先形成的复合体的使用消除了图3中看到的时间滞后，从而建立了 PEG化SK的正常纤溶酶原活化能力的纤溶酶依赖性，相反，不管反应中是否存在纤溶酶`，nSK都没有显示出滞后。
[0027]发明目的
[0028]本发明的主要目的是提供链激酶的突变体，其由于延长的作用和降低的免疫反应性而具有增加功效的潜力。
[0029]本发明的另一目的是选择性修饰链激酶以便增强其药物代谢动力学性质并且使其成为治疗上有用的溶栓剂和具有增加的蛋白水解稳定性和延长的体内半寿期。
[0030]本发明的再一个目的是选择性修饰链激酶以便保留未修饰的分子所显示出的合乎需要的生物学性质。
[0031]本发明的再一个目的是提供SK的变体，其赋予在靶定位点持续的和更有效的血纤蛋白溶解与降低的免疫反应性。
[0032]本发明的再一个目的是提供以纯的或生物学活性形式产生链激酶或其活性突变蛋白或者杂合纤溶酶原激活物分子的PEG化半胱氨酸变体的方法。
[0033]发明概述
[0034]因此，本发明提供了链激酶的突变体、其功能片段或共价修饰形式。变体包含与SK相关的多肽，其中一个或多个半胱氨酸残基替代蛋白质的一个或多个非必需氨基酸。优选地，变体包含的半胱氨酸残基替代选自如下的氨基酸:环区域、α螺旋末端和甚至二级结构形成区、或者如下区域中的氨基酸:在所述区域中在有或无加入的氨基酸延伸的条件下将半胱氨酸残基加入蛋白质的N-末端或C-末端。
[0035]本发明涉及选择、产生和使用链激酶的一般方法，所述链激酶显示出增加的蛋白水解稳定性、延长的血清清除半寿期和降低的免疫原性。衍生物具有修饰的氨基酸序列但是有效保留它们的生物学活性。本发明还描述了链激酶的半胱氨酸变体，其共价连接到不同分子量如5，10，20和40kDa的一个或多个聚乙二醇(PEG)分子。本发明的一个实施方案包括PEG化的链激酶衍生物与本领域中已知的用于在身体中有效散布的合适赋形剂、稳定剂和载体的药物组合物，其用于治疗多种循环系统病症。
[0036]发明详述
[0037]本发明基于如下实验发现:一个或多个PEG分子与链激酶中策略性取代的或添加的半胱氨酸残基的共价连接导致生物学活性的PEG化链激酶，其与天然链激酶相比具有增加的蛋白水解稳定性和延长的清除半寿期以及减少的清除，和更小的免疫反应性。PEG缀合的位点和大小可以在半胱氨酸变体的帮助下定制，其经设计成对于链激酶和其活性变体、包括凝块特异性链激酶(在本上下文中可以参考美国专利7，163，817，其描述凝块特异性链激酶变体的设计和构建，由于到在SK蛋白的一个或两个末端添加血纤蛋白结合结构域而具有增加的血纤蛋白亲和力)中的催化功能(纤溶酶原激活)是非抑制性的。在链激酶和凝块特异性链激酶多肽中取代、添加或插入一个或多个半胱氨酸使得可以在该多肽的理想位置加入不同分子量的PEG，条件是所述取代和/或添加是以“策略”方式进行，从而完全避免了功能特征的损失，并导致产生未修饰的天然蛋白质中不存在的新的有益特征。PEG放置的选择基于所选位点的表面可及性和其结构-功能相关性设计。
[0038]本发明的PEG化的链激酶与天然分子相比作为治疗剂更有用并且使用更方便，因为尽管保留了天然或接近天然状的生物活性，它们与前者相比时显示出延长的作用时间，所述天然分子在纤溶酶(原)存在下在体外快速降解，并且在注射后由于快速降解而在非常短的时间内从循环系统被 清除。相反，PEG化的链激酶与天然(非PEG化)蛋白质相比显示出显著增强的蛋白水解稳定性，免疫反应性更低并且仅在显著延长的时间后从循环系统中清除。
[0039]因此，本发明的PEG化链激酶可以用于治疗具有循环系统病症如静脉或动脉血栓形成、心肌梗死等的受试者，优点是本发明的PEG化链激酶由于延长的作用时间和降低的免疫反应性而具有了增强功效的可能性，其由于最小的抗原性而可能允许重复施用。PEG基团的数目、大小和位置可以以这样的方式使用使得重新设计链激酶以具有不同的半寿期，使得它们的应用有益于具体病症/临床综合征的需要，或者有益于所治疗的具体受试者的需要。
[0040]本发明涉及选择性修饰用于药物用途的链激酶，以增强其药物代谢动力学性质和提供治疗上有用的溶栓剂。本发明也包括链激酶的突变体、其天然或人工变体，其保留天然的未修饰分子的理想的生物学性质。本发明的所有变体可以使用本领域已知的常用方法和材料，通过在宿主细胞，如原核宿主细胞如大肠杆菌、或真核宿主细胞如酵母或哺乳动物细胞中表达编码所需要变体的重组DNA序列来制备。来自不同物种的所编码链激酶的DNA序列信息可以从公开的信息得到。已经研究了链激酶基因的多态性并且解释了它们与发病机理的关联性(Malke H，1993)。也进行了分子流行病学研究来确定不同的M型的A组链球菌菌株和其他链球菌种内链激酶基因的分布。该研究中检查的多数菌株通过酪蛋白-纤溶酶原覆盖测定法(casein-plasminogen overlay assay)显示为阳性链激酶活性。这些研究的总体结果表明，在得自不同链球菌种(streptococcal species)的链激酶中存在大量的异质性(Huang等；1989)。可能使用具有纤溶酶原活化能力的任一种可用的链激酶变体用于半胱氨酸诱变并随后用巯基反应试剂修饰。
[0041]编码突变体和物种变体的新的DNA序列可以与天然形式类似地克隆和表达。在遗传工程化宿主细胞中表达产生的链激酶然后可以进行纯化，并且如果需要，通过常规方法配制成药物组合物。
[0042]作为本发明的优选方面，将通过重组方法表达的链激酶与合适的硫羟反应试剂在允许硫羟反应性结构部分连接到链激酶中所引入的半胱氨酸残基的巯基的条件下反应。
[0043]术语“硫羟反应物”在本文中定义为具有或者能够被活化而具有能够形成与半胱氨酸残基的巯基(-SH)共价连接的反应基的任何化合物。此类化合物包括聚合物，如聚丙二醇和PEG、基于糖类的聚合物和氨基酸聚合物和生物素衍生物。需要缀合的化合物可以用巯基结构部分，如巯基、硫醇(thiol)、三氟甲基磺酸酯(triflate)、tresylate、氮丙唳(aziridine)或者环氧乙烧(oxiran),或优选地,碘乙酰胺(iodoacetamide)或者马来酰亚胺(maleimide)活化。缀合基团可以具有不同的分子量，但是对于PEG优选在5000到40，000之间。本发明的一个重要的属性是赋予PEG化或其他连接的位置选择性，同时保留蛋白质的正常功能性质。
[0044]因此，本发明提供了具有选自SEQ ID NO:1~24的氨基酸序列的突变链激酶多肽，其中取代或插入了至少一个半胱氨酸残基。表34显示了对应于SEQ ID NO:1的可能不耐受突变或取代的残基的残基。
[0045]在本发明的一个实施方案中，所制备的链激酶突变体是具有SEQ ID NO:2_6的链激酶功能片段。
[0046]在本发明的一个实施方案中，所制备的链激酶突变体是具有SEQ ID N0:7_19的链激酶突变蛋白。
[0047]在本发明的一个实施方案中，所制备的链激酶突变体是具有SEQ ID NO:20-21的链激酶物种变体。
[0048]在本发明的一个实施方案中，所述链激酶物种变体显示出与具有SEQ ID N0:1的天然链激酶有75% -100%的氨基酸同源性。
[0049]在本发明的另一个实施方案中，至少一个半胱氨酸残基取代位于链激酶的至少一个区域中的至少一个氨基酸，所述区域选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:1或其突变蛋白或其功能变体的48-64环、88-97环、区域103-106、或119-124或螺旋形成区196-207或环形成区170-181或环形成区254-264或者卷曲螺旋区318-347或者区域360-372，其中所述变体具有如通过标准测定法测量的生物活性。
[0050]在另一个实施方案中，突变链激酶多肽包含I到3个半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代位于对应于链激酶天然氨基酸序列(SEQ ID NO:I)的至少一个区域中，所述区域选自由下列各项组成的组:氨基酸残基48-64环、氨基酸残基88-97环、氨基酸残基102-106的区域、氨基酸残基119-124的区域、氨基酸残基196-207的螺旋形成区、氨基酸残基170-181的环形成区、氨基酸残基254-264的环形成区、氨基酸残基318-347的卷曲螺旋区和氨基酸残基360-372的区域，其中该突变体可以活化纤溶酶原。
[0051]如本文所用，术语对应于用于指参考蛋白质，例如野生型链激酶(SK)或SEQ IDN0:1内列举的位置，和与参考蛋白质上位置比对的查询的蛋白质(例如突变SK)中的那些位置。从而，当主题SK的氨基酸序列，例如SEQ ID NOs:2，3，4，5等与参考SK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1比对时，主题SK序列中“对应于”参考SK序列中某些列举的位置的氨基酸是与参考SK序列的这些位置比对的那些氨基酸，但是不一定在参考SK序列中这些确切的数字表示的位置上。例如，SEQ ID N0:4中的Gly34Cys突变体将“对应于” SEQ ID NO:1中Gly49Cys突变体。
[0052]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体还包含与C-末端、N-末端或者两个末端融合的血纤蛋白结合结构域。
[0053]在另一实施方案中，如0035III中提到的突变体，其中血纤蛋白结合结构域包含至少一个半胱氨酸取代。
[0054]在另一实施方案中，如0035IV中提到的突变体，其中血纤蛋白结合结构域通过柔性连接寡肽连接到突变链激酶。
[0055]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶还包括至少一个额外的氨基酸取代，该氨基酸取代对应于选自SEQ ID NO:1的Asn90Ala，Hisl07Ala，Ser108Ala, Asp227Tyr, Asp238Ala, Glu240Ala, Arg244Ala, Lys246Ala, Leu260Ala,Lys278Ala, Lys279Ala 和 Asp359Arg 的氛基酸取代。
[0056]在另一实施方 案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶包含缺失，该缺失对应于选自Asn90，Asp227和Asp359的氨基酸缺失。
[0057]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶还包含N-和/或C-末端氨基酸延伸。
[0058]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶在对应于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置上包含至少一个半胱氨酸突变。
[0059]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶在对应于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置包含至少两个半胱氨酸突变。
[0060]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变链激酶在对应于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置包含三个半胱氨酸突变。
[0061]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其中该突变体能够治疗下述疾病或病症，其选自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中风、血管事件、心绞痛(angina)、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠状动脉介入步骤后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心脏手术、血管手术、心力衰竭、X综合征和其中发生至少一个冠状动脉狭窄的病症。[0062]在另一实施方案中，如00351中提到的突变体，其还包含在至少一个半胱氨酸突变体上取代的半胱氨酸反应性结构部分。
[0063]在另一实施方案中，如35XIII中提到的突变体，其中所述半胱氨酸反应性结构部分是聚乙二醇(PEG)。
[0064]在另一实施方案中，如35XIV中提到的突变体，其中PEG是分子大小为5000道尔顿到40，000道尔顿的线性或分枝聚合物。
[0065]在另一实施方案中，如35XIV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有增加的蛋白水解稳定性。
[0066]在另一实施方案中，如35XIV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有降低的抗原性和降低的体内免疫原性。
[0067]在另一实施方案中，如35XIV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有缓慢的肾清除率和增加的体内半寿期。
[0068]本发明的另一实施方案涉及融合多肽，该融合多肽包含链激酶结构域和血纤蛋白结合结构域，该链激酶结构域包含一到三个半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代位于血纤蛋白结合结构域内或者位于对应于链激酶的天然氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的至少一个区域内，该区域选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基48-64的环、氨基酸残基88-97的环、氨基酸残基102-106的区域、氨基酸残基119-124的区域、氨基酸残基196-207的螺旋形成区、氨基酸残基170-181的环形成区、氨基酸残基254-264的环形成区、氨基酸残基318-347的卷曲螺旋区和氨基酸残基360-372的区域，其中该突变体可以活化纤溶酶原并且结合血纤蛋白。
[0069]在另一实施方案中，如35XIX中提到的突变体，其中所述血纤蛋白结合结构域融合到链激酶结构域的N末端、链激酶结构域的C末端、或者链激酶结构域的两个末端。
[0070]在另一实施方案中，如35XXI中提到的突变体，其中所述血纤蛋白结合结构域融合到链激酶结构域的N末端，并且所述融合多肽包含选自SEQ ID NO:22的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372，K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438, L443, A450, D464, D477和R489的至少一个半胱氨酸突变。
[0071]在另一实施方案中，如35XXI中提到的突变体，其中所述血纤蛋白结合结构域融合到链激酶结构域的C末端，并且所述融合多肽包含选自SEQ ID NO:23的G49，S57，A64，I88，S93，D95，D96，D102，S105，D120，K121，D122，E148，K156，D173，D174，L179，D181，S205，A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303, L321, L326, A333, D347,D360, R372, H401, A402, D447和G465的至少一个半胱氨酸突变。
[0072]在另一实施方案中，如35XXI中提到的突变体，其中所述血纤蛋白结合结构域融合到链激酶结构域的N-末端和C末端，并且所述融合多肽包含选自SEQ ID NO:24的H16，A17, D62, G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239,E265, K273, D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372, K373, K374, S375, L377, E398, K399,F404, D420, L438, L443, A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564 和 G582 的至少一个半胱氨酸突变。
[0073]在另一实施方案中，如35XIX中提到的突变体，其中该突变体能够治疗下述疾病或病症，其选自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中风、血管事件、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠状动脉介入步骤后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心脏手术、血管手术、心力衰竭、X综合征和其中发生至少一个冠状动脉狭窄的病症。
[0074]在另一实施方案中，如35XIX中提到的突变体，其还包含在至少一个半胱氨酸突变体上取代的半胱氨酸反应性结构部分。
[0075]在另一实施方案中，如35XXV中提到的突变体，其中所述半胱氨酸反应性结构部分是聚乙二醇(PEG)。
[0076]在另一实施方案中，如35XXVII中提到的突变体，其中PEG是分子大小为5000道尔顿到40，000道尔顿的线性或分枝聚合物。
[0077]在另一实施方案中，如35XXV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有增加的蛋白水解稳定性。
[0078]在另一实施方案中，如35XXV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有降低的抗原性和降低的体内免疫原性。
[0079]在另一实施方案中，如35XXV中提到的突变体，其中该突变体与未PEG化的突变链激酶相比具有缓慢的肾清除率和增加的体内半寿期。
[0080]在本发明的再一个实施方案中，SEQ ID NO:22-24是共价修饰的杂合多肽，其包含链激酶(SK)的至少一个功能片段和血纤蛋白结合结构域4和5、人纤连蛋白的血纤蛋白结合结构域(FBDs)I和2。
[0081 ] 在本发明的再一个实施方案中，SK的功能片段和所述血纤蛋白结合结构域通过柔性连接寡肽连接。
[0082]在本发明的再一个实施方案中，上述突变体包含N和/或C-末端氨基酸延伸。
`[0083]在本发明的再一个实施方案中，半胱氨酸取代选自G49，S57，A64，188，S93，D95，D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173, D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303, L321, L326, A333, D347, D360, R372的至少一个氨基酸，其中所述变体具有如通过标准测定法测量的生物活性。
[0084]在本发明的再一个实施方案中，半胱氨酸取代选自SEQ ID N0.22的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372，K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438，L443，A450, D464，D477，R489的至少一个氨基酸，其中所述变体具有如通过标准测定法测量的生物活性。
[0085]在本发明的再一个实施方案中，半胱氨酸取代选自SEQ ID N0.23的G49，S57，A64，I88，S93，D95，D96，D102，S105，D120，K121，D122，E148，K156，D173，D174，L179，D181，S205,A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281，K282，F287, D303, L321, L326, A333, D347,D360，R372，H401，A402，D447，G465的至少一个氨基酸，其中所述变体具有如通过标准测定法测量的生物活性。
[0086]在本发明的再一个实施方案中，半胱氨酸取代选自SEQ ID N0.24的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372, K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438, L443, A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564, G582 的至少一个氨基酸，其具有如通过标准测定法测量的生物活性。
[0087]在本发明的再一个实施方案中，取代的半胱氨酸残基用半胱氨酸反应性结构部分修饰。
[0088]在本发明的再一个实施方案中，取代的半胱氨酸残基用聚乙二醇修饰。
[0089]在本发明的再一个实施方案中，上述PEG分子是分子大小为5000道尔顿到40，000道尔顿的线性或分枝聚合物。
[0090]在本发明的再一个实施方案中，上述变体与它们最初未修饰的对应物相比具有增加的蛋白水解稳定性。
[0091]在本发明的再一个实施方案中，上述变体与它们最初未修饰的对应物相比具有降低的抗原性和体内免疫原性。
[0092]在本发明的再一个实施方案中，上述变体与它们最初未修饰的对应物相比具有缓慢的肾清除率和因此增加的体内半寿期。
[0093]在本发明的再一个实施方案中，所述药物组合物包含任选与可药用赋形剂一起的至少一种半胱氨酸变体。
[0094]在本发明的再一个实施方案中，所述药物组合物可用于治疗下述疾病或病症，其选自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中风、血管事件、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠状动脉介入步骤后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心脏手术、血管手术、心力衰竭、X综合征和其中发生至少一个冠状动脉狭窄的病症。
[0095]具体地，本发明描·述了链激酶或其突变蛋白的PEG化半胱氨酸变体或杂合的纤溶酶原激活物的PEG化半胱氨酸变体(所述杂合的纤溶酶原激活物包含链激酶(SK)之间或者SK的修饰形式或其能够活化纤溶酶原(PG)的合适部分之间的多肽键联合，和人纤连蛋白的血纤蛋白结合区，该血纤蛋白结合区选自人纤连蛋白的血纤蛋白结合结构域(例如，结构域4和5的配对、或结构域I和2的配对，或其修饰形式))，使得杂合的纤溶酶原激活物具有独立地结合血纤蛋白的能力，从而由于它们对血块物质(即血纤蛋白)的增强的亲和力而变成凝块特异性的(美国专利号7，163，817)。
[0096]提供了链激酶或其截短形式的单PEG化或双PEG化或多PEG化的半胱氨酸变体，其不仅对于PG活化能力具有活性，而且显示出新的和出乎意料的功能属性。例如，SK的双PEG化的半胱氨酸变体(其中额外的半胱氨酸置于多肽的两个末端，即N和C末端)在其人纤溶酶原活化特征方面显示出出乎意料的特性，因为其与未修饰的SK相比具有显著更慢的初始纤溶酶原(PG)活化速率，但是当在体外测定PG活化时，在几分钟的初始滞后之后，变得完全能够以相似于未修饰SK的方式活化纤溶酶原。不能立即自身活化(天然未修饰的SK为立即自身活化，其几乎在接触时活化PG)是由于其依赖血纤蛋白的作用方式。相反，天然SK不需要任何纤溶酶被活化，但是几乎在其与PG复合时被活化。从而，在注射到体内后，这种SK变体将通过血管系统开始其旅程，但是仍然为无活性的或者部分活性的状态。然而，在其接触凝块那一刻在凝块的紧邻附近，其优先被活化，已知凝块富含纤溶酶而全身循环系统不是这样(由于存在纤溶酶特异性Serpins [丝氨酸蛋白酶抑制剂]如α _2_抗纤溶酶和α -2-巨球蛋白)，游离的纤溶酶在“开放”循环系统中被快速失活)，从而避免或者显著减小了与天然SK施用同时发生的系统性PG活化，天然SK施用在施用时立即活化PG，具有随后的副作用，如出血和血管系统的多种蛋白质组分的大规模破坏。该性质，即纤溶酶依赖性活化，以及延长的清除半寿期和低免疫原性和抗原反应性，将不仅导致在全身循环中游离纤溶酶的产生总体上减少，而且导致以相对较低的剂量为多种循环疾病反复施用血栓溶解剂而避免不需要的免疫反应的能力。净结果将是通过显著降低的治疗有效剂量的血栓溶解剂维持靶标处持续并且更有效的血纤蛋白溶解，并且减小副作用，如降低的免疫反应性，和减轻用常规SK经常看到的出血性并发症。
[0097]本发明提供了链激酶或其突变蛋白的PEG化半胱氨酸变体或杂合的纤溶酶原激活物(其包含链激酶(SK)之间或者SK的修饰形式或其合适部分之间的多肽键联合)的PEG化半胱氨酸变体，如通过纤溶酶原激活测定法测量，所述变体显示出与天然链激酶相当的体外生物活性，在一些情况下发生的活性降低通过该衍生物的延长的半寿期和/或更低的清除速率而被很好的弥补。
[0098]本发明提供了链激酶的PEG化的半胱氨酸变体，在该纤溶酶原激活物暴露于合适的动物或人类纤溶酶原后仅仅超过5分钟的滞后期后，所述变体显示出纤溶酶原活化的特征。
[0099]本发明提供了用表达载体转化或转染的原核或真核细胞，在所述表达载体中，克隆了表达链激酶、其突变蛋白或共价修饰形式的基因，并且能够表达链激酶或其突变蛋白或杂合纤溶酶原激活物的半胱氨酸变体。为了有效表达，对编码链激酶、其突变蛋白和共价修饰形式的DNA序列针对基于细菌或酵母的表达宿主的密码子偏好进行优化。
[0100]本发明详述了为了临床和研究应用以纯的和生物学活性形式产生链激酶或其活性突变蛋白或杂合纤溶酶原激活物分子的PEG化半胱氨酸变体的方法。
[0101]本发明考虑那些半胱氨酸变体的PEG化，其使用模板多核苷酸，其中用于表达SK的SK编码多核苷酸通过诱变、通过已知的生物化学或化学DNA合成技术或它们的组合进行修饰，使得保留纤溶酶原激活物活性。
[0102]本发明考虑SK或其截短形式的半胱氨酸变体，其被PEG化但还具有通过多肽连接融合的额外的血纤蛋白结合结构域，使得所得的嵌合体/融合多肽除了显示出纤溶酶原活化能力外，还显示出血纤蛋白结合特征。血纤蛋白结合结构域和SK之间的融合可以是直接的，但是也可以通过短的接头肽区融合，所述接头肽区包含在构象上不是刚性而是柔性的一段氨基酸序列，如主要由Gly，Ser, Asn, Gln和相似氨基酸组成的那些序列。
[0103]使用标准质粒在强启动子如tac, trc, T7RNA聚合酶等的控制下,在大肠杆菌中表达SK或其突变蛋白或共价修饰形式的半胱氨酸变体，所述质粒也含有引起所结合的开放阅读框高水平表达所需的公知特征，所述开放阅读框编码SK或其突变蛋白或共价修饰的SK构建体。
[0104]使用标准质粒在酵母表达系统中表达SK或其突变蛋白或物种变体或共价修饰形式的半胱氨酸变体，其中N-末端信号肽被优化用于成熟多肽的有效细胞外分泌。这些信号肽的序列信息可以从酵母表达系统的分泌蛋白得到。此外，此类信息也可以从超分泌并且含有优化的信号序列的其他重组蛋白得到。
[0105]本发明提供了一种方法，其中将使用化学、机械或酶学方法从含有SK或SK嵌合多肽的单、双或三半胱氨酸变体的细胞得到的粗细胞裂解物进行空气或巯羟-二硫化物试剂催化反应，或者酶催化的巯羟-二硫化物氧化再折叠以再折叠成含有天然半胱氨酸配对(采用SK的共价修饰形式)的生物活性构象，同时保持额外的半胱氨酸自由用于巯基反应性化学修饰。
[0106]本发明提供了一种方法，其中将使用化学、机械或酶学方法从含有SK的共价修饰形式的单、双、三或多半胱氨酸变体的细胞得到的粗细胞裂解物用还原和氧化的谷胱甘肽或其他此类试剂的混合物进行氧化和再折叠，所述其他此类试剂有效用于如通过合适的氧化还原电位的巯羟-二硫化物交换(例如，半胱氨酸和胱氨酸)的此类氧化折叠反应，所述氧化折叠反应允许共价修饰形式的SK再折叠成它们的生物活性构象同时保持额外的半胱氨酸自由以用于巯基反应性化学修饰。
[0107]使用标准遗传方法，SK、其突变蛋白或共价修饰形式的半胱氨酸变体在真核生物如酵母或动物或植物细胞中作为主基因组中掺入的遗传单位或作为本领域已知的自主遗传单元表达，以便获得所掺入的开放阅读框的高水平表达，该开放阅读框编码SK或其突变蛋白或共价修饰的SK构建体。
[0108]本发明提供了一种方法，其中SK或SK嵌合纤溶酶原激活物蛋白的PEG化的半胱氨酸变体可以用作血栓溶解疗法或者预防多种血管血栓形成。激活物可以根据常规步骤配制为适于施用于人类的药物组合物，并且可以包括但不限于稳定剂，如人血清白蛋白、甘露醇等，增溶剂，或者麻醉剂，如利多卡因(Iignocaine)等，以及稳定和/或促进该变体的体内递送的其他试剂或其组合。
[0109]本发明提供了包含SK或杂合纤溶酶原激活物的PEG化的半胱氨酸变体和稳定剂、以及增溶剂、麻醉剂等的药物组合物，所述稳定剂包括但不限于，人血清白蛋白、甘露醇等。
[0110]本发明将在下面的实施例中更详细解释，然而，实施例不意在限制本发明的范围。本发明的其他变体、组合和改进将是本领域技术人员显而易见的。从而，类似的工作或其小心的模拟甚至可能在本发明中没有公开的和属于人或非人来源的不同分离物的其他链激酶变体中产生相似或改进的特征。
[0111]实施例中使用的 一般方法
[0112]通常，利用分子生物学和蛋白质科学领域中公知的分子方法和技术。这些方法和技术易于从一些标准来源如属于本【技术领域】的教科书和实验手册得到，如SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)(I1.sup.nd edition,Cold Sparing Harbor Press, New York, 1989 ；McPherson, M.J., Quirke, P.,和 Taylor,G.R.， [Ed.]PCR:A Practical Approach(PCR:实用方法)，IRL Press, Oxford,1991,Current Protocols in Protein Science (现代蛋白质科学方法)，由 John Wiley & sons,Inc出版。对于免疫学实验,参考来自Immunochemical Protocols (免疫化学方法)，HudsonL7Hay FC(1989)第3版.Blackwell Scientific的教科书和实验手册。然而,这并不限制描述本发明的具体实验背景中的详细解释，尤其当引入修改以建立步骤时，无论何时相关，在实施例中指出。
[0113]试剂
[0114]在基于T7RNA聚合酶启动子的表达载体pET_23d中进行SK基因的克隆，并在得自Novagen Inc.(Madison, WI)的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中转化。热稳定的DNA聚合酶(Pfu)、限制性内切核酸酶、T4DNA连接酶和其他DNA修饰酶来自New EnglandBiolabs (Beverly, MA)。寡核苷酸引物由下列公司之一提供:加拿大的Biobasic, Inc.,美国的 Integrated DNA technologies,或美国的 Sigma-Aldrich。DNA 的纯化和 PCR 扩增产物从琼脂糖凝胶的提取用来自Qiagen GmbH(德国)的试剂盒进行。使用荧光染料的自动化DNA测序在Applied Biosystems3130xl遗传分析仪16毛细管DNA测序仪上进行。Glu-纤溶酶原购自 Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,德国)或通过亲和层析(Deutsch 和 Mertz,1970)从人血衆纯化。N-末端氨基酸测序用Applied Biosystems测序仪476A和491clc型进行。尿激酶、EACA、氰基硼氢化钠、L-赖氨酸购自美国圣路易斯的西格玛化学公司(SigmaChemical C0., St.Louis, USA)。苯基琼脂糖(Phenyl Agarose) 6XL和DEAE Sepharose (FastFlow)购自瑞典乌普萨拉的法玛西业生物技术(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden),而N1-NTA珠来自Qiagen。所有其他试剂都是可得到的最高的分析级别。
[0115]酪氨酸-纤溶酶原覆盖用于检测SK活性:通过在软琼脂中覆盖酪蛋白和人纤溶酶原检测不同SK衍生物的活性。修改Malke和Ferretti，1984的最初方法，其中将纯化的SK(0.5微克)直接点在LB-Amp琼脂板上标记的凹陷处。然后平板在37°C温育10分钟；之后，通过在含有所述点的平板上方轻轻倒出溶液A和B的混合物覆盖酪蛋白-HPG-琼脂。溶液A如下制备:将Ig脱脂乳在15ml50mM Tris, Cl (pH7.5)中加热，然后将其在水浴中保持在37°C备用。溶液B如下制备:在15ml50mM Tris.Cl (pH7.5)中在50°C加热0.38g琼脂糖。溶液回火到37°C后，加入3μ I TritonX-1OO (0.04% ν/ν)和200ygHPG。然后平板在37°C温育并观察由于HPG活化之后酪蛋白水解引起的透明区域的产生(晕圈形成)。 [0116]对于蛋白水解稳定性,将每种PEG化的衍生物和天然SK与蛋白水解酶如胰蛋白酶或纤溶酶温育。用于反应中的蛋白酶浓度为所述蛋白质浓度的500-10，000倍。反应物在摇动条件下25°C保持2到4小时。对于测试和对照，在LB-Amp琼脂板上点样相同量的受胰蛋白酶作用的蛋白质，并在平板的酪蛋白-纤溶酶原覆盖后测量残留活性。
[0117]蛋白质的SDS-PAGE分析:基本上根据Laemmli，U.K.，1970进行SDS-PAGE，如果需要进行微小改动。简言之，通过与等体积的2倍样品缓冲液(0.1M Tris Cl，pH6.8 ；6% SDS ；30%甘油；15% β-巯基乙醇和0.01%溴酚蓝染料)混合制备蛋白质样品。对于非还原性SDS-PAGE，在样品缓冲液中不包括β -巯基乙醇。在装入凝胶前，将样品在沸水浴中加入5分钟。不连续凝胶系统通常在浓缩胶中具有5% (丙烯酰胺浓度)和在分离胶中具有10%(丙烯酰胺浓度)。首先使用Laemmli缓冲液在15mA的恒定电流下进行电泳，直到样品浓缩，然后转换到30mA直到电泳结束。电泳结束时，将凝胶浸入甲醇:乙酸:水(4:1:5)中的0.1%考马斯蓝R250中，轻微震荡，然后在脱色溶液(20%甲醇和10%冰醋酸)中脱色直到背景变得透明。
[0118]PEG化的蛋白质可以通过Kurfiirst (Kurfirst MM., 1992)开发的标准方法用碘额外染色，其特异染色PEG分子。对于纯化的PEG变体的碘染色，简言之，在电泳后，将凝胶浸入5%戊二醛(Merck)溶液中室温下15分钟用于固定。之后，如下对PEG进行凝胶染色。首先，将凝胶置于20ml高氯酸(perchloric acid) (0.1 Μ)中15分钟,然后加入5ml0.5%氯化钡溶液和2ml0.1M碘溶液(Merck，Titrisol9910)。染色的PEG化蛋白质条带在几分钟内出现。对于SDS PAGE的双重染色，将碘染色的凝胶使用如[0044]中描述的Laemmli方案通过考马斯蓝R250进一步染色。
[0119]动力学测定法(Shi等，1994，Wu等，1987，Wohl等，1980)用于测定PEG修饰的或未修饰的SK或者其共价修饰变体对HPG的活化，特别当需要测定动力学常数时。加入不同浓度的PEG修饰的或未修饰的SK或者其共价修饰形式(10nM-200nM)至多孔板中至100微升终体积，该多孔板含有在测定缓冲液(50mM Tris-Cl缓冲液，pH7.5，含有0.5_lmM显色底物和 0.1M NaCl)中的 l-2uM HPG。使用的显色底物(S-2251，Roche Diagnostics GmbH，德国)为纤溶酶特异的并且在切割时产生黄色产物，其可以在405nm监测。向孔中加入所有其他组分后加入蛋白质等分试样并将第一次分光光度吸光度设为O。然后在来自美国分子装置(Molecular Devices USA)的Versa-Max可调微平板读出器中随时间测量405nm下吸光度的改变。从英国WHO，Hertfordshire得到的似马链球菌链激酶的合适稀释液用作参照标准来校准未知制剂中的国际单位。
[0120]用于确定PEG修饰的或未修饰的SK和其共价修饰形式的HPG活化活性的稳态动力学常数的测定法。
[0121]为了测定HPG活化的动力学参数，向如上述多孔板中含有不同浓度HPG(0.035到
2.0微摩尔)的测定缓冲液中加入固定量的PEG修饰的或未修饰的SK或其共价修饰形式(0.05-0.1纳摩尔)。然后在25°C下10-40分钟内405nm下用分光光度计测量吸光度的改变。然后通过标准方法(Wohl等，1980)从Michaelis-Menton倒数曲线计算HPG活化的动
力学参数。
[0122]将多种PEG化的SK或其突变蛋白和天然SK用碘125 (I125来自PerkinElmerSingapore Pte Ltd)进行放射性碘化。使用 1dogen(1, 3,4,6_ 四氯 _3 α-6 α - 二苯基 glucoluril(1,3,4,6-Tetrachloro-3α-6 a-diphenylglucoluril))方法(Fraker &Speck, 1978)。根据Fraker和Speck所用的方法,将1dogen溶解在氯仿中并通过喷射氮气蒸发溶剂而涂布在硼硅玻 璃管壁上。为了碘化，将磷酸缓冲盐水(PBS)中的蛋白质溶液加入1dogen涂布的管中，并与I125混合。约10_30分钟后,通过在含有Sephadex G25细小基质的柱(Amersham Biosciences)上脱盐将放射性标记的蛋白质与游离的放射性碘分离。
[0123]遗传构建体
[0124]链激酶的构建
[0125]含有SK基因的pET载体(pET-23d_SK)的设计和构建已经在Nihalani等，(1998)中描述。其涉及在PBR322中克隆来自似马链球菌(Streptococcus equisimilis)H46A的SK基因(Pratap等，1996)，接着亚克隆到pET_23d (含有来自噬菌体T7主要衣壳蛋白的高度有效的核糖体结合位点的表达载体)(Studier和Moffatt, 1986),并进一步修饰该基因的5’末端以减小形成二级结构的倾向。其在编码SK的开放阅读框开始处具有Met的起始密码子的框内并置以便将蛋白质表达为Met-SK。详细参考可以见Sahni等，2007(美国专利号:7，163,817)
[0126]在SK的情况下也使用修整的模板设计SK突变蛋白以便得到高细胞内表达能力。pET-23d-SK的环状图已经在图2中描述。制备SK的截短衍生物的方案由Nihalani等，1998详细解释。除了基因测序外,通过在Applied Biosystems-Perkin Elmer蛋白质测序仪476A或491clc型上蛋白质的气相N-末端氨基酸测序也建立了 SK和其截短衍生物的真实性。
[0127]通过制备SK编码DNA和人纤连蛋白的血纤蛋白结合结构域之间的杂合DNA多核苷酸构建SK的共价修饰形式和其在大肠杆菌中的克隆和表达在美国专利号7，163，817中详细解释。简言之，将血纤蛋白结合结构域融合到链激酶N-末端或者C-末端或者N和C两个末端以产生链激酶的多种共价修饰形式。
实施例
[0128]实施例1
[0129]选择用于产生链激酶的半胱氨酸变体的蛋白质残基或区域
[0130]用于取代或缺失的残基选择对于保持经修饰多肽的功能性是关键的。因此，半胱氨酸诱变计划需要晶体结构中存在的结构信息和通过解析研究得到的功能知识。在数年内的广泛结构和功能研究已经收集了关于链激酶的不同区域在纤溶酶原活化中的作用的大量信息。为了决定其中可以优选用半胱氨酸取代的天然存在的氨基酸的残基或者区域，我们利用了存在于SK的三维结构或其分离的结构域中的信息以及它们的功能相关性。用于半胱氨酸诱变的残基的选择部分基于确定所述残基的表面可及性。半胱氨酸插入位点也局限于链激酶的柔性区域。为了确定表面暴露，使用DSSP程序。DSSP代码经常用于以单字母代码描述蛋白质二级结构。DSSP是“蛋白质二级结构字典(Dictionary of ProteinSecondary Structure) ”的首字母缩写。DSSP(Kabsch 和 Sander, 1983)程序定义了蛋白质的二届结构、几何特征和溶剂暴露，以蛋白质数据库的形式给出原子坐标。DSSP以平方埃描述每个残基的暴露。DSSP程序在给定PDB文件上的运行产生了缩写的DSSP形式输出。可以在DSSP形式输出中在标题Acc下得到表面可及性值。为了确定表面暴露，使用微纤溶酶复合体中链激酶的解析的晶体结构(Wang等1998，PDB ID1BML)。对于在该结构中缺失的区域(175-181和252-262)，分离的β结构域的晶体结构(Wang等，1999，PDB IDlc4p)用于确定表面暴露。在晶体结构中缺失的一些环被移植在通过实验获得的结构中，并且通过分子建模工具确定最优选的构象。不一定在结构中检测到但是被定义为与它们存在于柔性区中一样高度可及的残基也被选择用于半胱氨酸诱变。表1显示了 SK (SEQ ID NO: I)的不同半胱氨酸变体的表面可及性值，所述变体被半胱氨酸取代。然而，该表并不限制SK的其他天然存在的氨基酸的半胱氨酸取代的范围。通过程序DSSP计算的可及性值被直接作为表面暴露的度量。DSSP程序列出了许多表面暴露的残基。但是在决定用于半胱氨酸取代的残基时进行小心的选择。该选择包括沿着三个不同结构域，即链激酶的α、β和Y结构域均匀扩散的突变。也选择落入二级结构区中`的突变。选择还包括一些残基的半胱氨酸替换，所述残基显示出非常低的表面可及性，仅仅确保原则上链激酶的每个残基都可以被半胱氨酸替换并且用硫羟反应性试剂成功修饰。
[0131]尽管存在核苷酸和多肽序列多样性，但是在不同的细菌纤溶酶原激活物之间存在强烈的结构相似性。一个结构域的葡萄球菌激酶与链激酶的α结构域有结构同源性。来自乳房链球菌(Streptococcus uberis)的两结构域牛纤溶酶原激活物也显示出与链激酶的α和β结构域的结构相似性。在不同细菌纤溶酶原激活物中蛋白质三维结构的进化保守性使得可能计划分离自不同的细菌物种的其他链激酶变体的半胱氨酸修饰。
[0132]实施例2
[0133]链激酶的半胱氨酸变体的遗传构建
[0134]一般通过使用本领域已知的常规方法构建用于表达链激酶的所有遗传构建体。例如在'PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR 方法:方法和应用指南)'，Innis.Μ.Α.等编辑，1990.，Academic Press Inc.，San Diego, Calif,和'PCR Protocols:Current Methods and Applications (PCR方法:现代方法和应用)',B.A.White, 1993 编辑，Humana Press, Inc.，Totowa, N.J.，USA 中描述了 DNA 操作以惨入突变的方法。如下制备细菌和酵母表达盒:将编码需要的链激酶的DNA分子插入到合适载体(或者将亲本模板DNA插入到载体中并如本文需要那样诱变序列)，然后用本领域已知的常规方法用所述表达盒转化宿主细胞。用多种方法如PCR诱变技术(Innis等，1990)、诱变试剂盒，如 Stratagene (" Quick-Change Mutagenesis" kit, San Diego, Calif.)或Promega(Gene Editor Kit,Madison ffis.)出售的那些试剂盒将特定突变引入需要的构建体中。通常，设计寡核苷酸以将核苷酸改变掺入链激酶的编码序列中，其导致天然存在的残基被需要的残基取代、缺失或添加。还设计诱变引物在成熟蛋白起始处，即靠近N-末端氨基酸或者突变蛋白的最后一个氨基酸，即在链激酶和其截短构建体的C-末端氨基酸之后加入半胱氨酸。使用类似的策略在链激酶或者表2中SEQ IDs代表的其任何形式的任何两个选择的氨基酸之间插入半胱氨酸残基。使用标准方法，对SK的多种形式产生相应含半胱氨酸的突变体。不同突变体的转化克隆然后进行筛选并在Applied Biosystems 3130x1遗传分析仪16毛细管DNA测序仪上用荧光染料通过自动化DNA测序来验证。
[0135]表2列出了表达下面之一的不同多肽构建体:链激酶、其突变蛋白、物种变体、或者共价修饰形式。链激酶的天然全长多肽序列已经被指定为SEQ ID N0:1。SK的截短形式(其中C-末端31个残基被缺失)通过SEQ ID NO:2描述。SK的截短形式(其中N-末端15个残基被缺失)通过SEQ ID NO:3描述。含有SK的N-末端15个氨基酸和C-末端31个残基的缺失的多肽在SEQ ID NO:4中给出。SK的功能片段(其中缺失N-末端49个残基)被指定为SEQ ID NO:5。其中缺失的N-末端59个和C-末端31个残基的链激酶构建体已经在SEQ ID NO:6中给出。在α结构域中含有天冬酰胺90的丙氨酸取代的SK全长多肽(残基1-414)通过SEQ ID Ν0:7表示。具有酪氨酸取代丙氨酸的全长SK的β结构域突变多肽在SEQ ID NO:8中给出。类似地，SEQ ID NO:9代表SK的β结构域突变体，其中238位的天冬氨酸残基用丙氨酸取代。SEQ ID NO:10指定给链激酶的β结构域突变体，其中240位的谷氨酸用丙氨酸取代·。SEQ ID Ν0:11和SEQ ID NO: 12分别代表全长SK中244和246位残基处精氨酸向丙氨酸和赖氨酸向丙氨酸的突变。在SEQ ID Ν0:13中给出了 SK的β结构域的250环突变体，其中260位的亮氨酸残基用丙氨酸取代。SEQ ID NO: 14显示了SK的Y结构域突变体，其中359位的天冬氨酸残基用精氨酸取代。SEQ ID Ν0:15代表SK的双突变体，其中组氨酸92和丝氨酸93都被丙氨酸取代。SEQ ID NO:16代表SK的另一双突变体，其中278和279位的两个连续的赖氨酸残基用丙氨酸取代。SEQ ID NO:17、SEQID NO:18和SEQ ID NO:19分别给出了 SK的突变体，其中α结构域中90位天冬酰胺、β结构域中227位天冬氨酸或者Y结构域的359位天冬氨酸被缺失。SK的成熟和活性形式可以从链球菌属的许多种和亚种变体得到。为了验证半胱氨酸诱变和后续不同形式SK的PEG化的可行性,我们选择了来自链球菌(Streptococcus)种，即酿脓链球菌(pyogenes)和停乳链球菌(dysgalactiae)的SK的变体。来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SK物种变体在SEQ ID NO:20中给出并且来自停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)的SK物种变体在SEQ ID N0:21中给出。SEQ ID NO:22给出了 SK的共价修饰形式，其中血纤蛋白结合结构域存在于SK的N末端。SK的C-末端血纤蛋白结合结构域融合产物被指定为SEQ ID NO:230在SK的N和C末端都含有血纤蛋白结合结构域的杂合多肽由SEQID NO:24给出。SK的血纤蛋白结构域融合形式的遗传构建在美国专利号7，163,817中详述。包括天然全长SK、其突变蛋白、物种变体和共价修饰形式的不同多肽进一步用于产生半胱氨酸变体。
[0136]对表2中提到的不同形式SK产生的半胱氨酸变体已经被指定唯一的SEQ ID。表3到28列出了各变体以及它们唯一的SEQ ID。
[0137]表3:对天然全长SK(SEQ ID NO:1)设计的变体。
[0138]表4:对截短的SK1-383(SEQ ID NO:2)设计的变体。
[0139]表5:对截短的SK16_414(SEQ ID NO:3)设计的变体。
[0140]表6:对截短的SK16-383(SEQ ID NO:4)设计的变体。
[0141]表7:对截短的SK50-414(SEQ ID NO:5)设计的变体。
[0142]表8:对截短的SK60_383(SEQ ID NO:6)设计的变体。
[0143]表9:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:7)设计的变体。
[0144]表10:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:8)设计的变体。
[0145]表11:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:9)设计的变体。
[0146]表12:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:10)设计的变体。
[0147]表13:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:11)设计的变体。
[0148]表14:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:12)设计的变体。
[0149]表15:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:13)设计的变体。
[0150]表16:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:14)设计的变体。
[0151]表17:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:15)设计的变体。
[0152]表18:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:16)设计的变体。
[0153]表19:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:17)设计的变体。
[0154]表20:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:18)设计的变体。
[0155]表21:对突变的SK多肽(SEQ ID NO:19)设计的变体。
[0156]表22:酿脓链球菌MGAS10270(SEQ ID N020)的半胱氨酸变体。
[0157]表23:停乳链球菌马样亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)(SEQ ID N021)的半胱氨酸变体。
[0158]表24:具有N-末端融合的血纤蛋白结合结构域的SK (SEQ ID NO:22)的半胱氨酸变体。
[0159]表25:具有C末端融合的血纤蛋白结合结构域的SK (SEQ ID NO:23)的半胱氨酸变体。
[0160]表26:具有N-末端和C-末端融合的血纤蛋白结合结构域的SK (SEQ ID NO:24)的半胱氨酸变体。
[0161]表27:SK的半胱氨酸插入突变体。
[0162]表28:SK的变体,其中半胱氨酸置于N或C-末端,有或没有肽延伸。
[0163]这些实例表明可以对几乎所有形式的SK产生半胱氨酸变体，所述形式如天然全长的、截短的、N或C-末端延伸的或者与其他多肽序列的融合。我们也产生了 SK的取代、插入或缺失突变体的半胱氨酸变体。这证明本发明可应用于所有形式的SK用于半胱氨酸诱变和随后用硫羟反应试剂修饰。[0164]从实施例2得到的构建体用于所进行的所有进一步实验以实现本发明。然而，应该理解链激酶的半胱氨酸变体列表仅仅是示例性的而不是排他性的。根据本发明的备选和额外半胱氨酸变体的设计和合成在本领域技术范围之内。可以方便地使用常规技术和方法容易地实现此类变体的合成。
[0165]实施例3
[0166]生物活性链激酶的过表达和纯化
[0167]待纯化的天然链激酶蛋白(nSK)、其突变体和其随后的半胱氨酰突变体都各自从它们的BL21 (DE3)甘油储液在LB-Amp平板上划线生长的单个菌落生长。在摇动条件(180-280rpm)下，将pET-23d_SK或SK变体接种到含有100微克/mL氨苄青霉素(LB-Amp培养基)的IOml LB培养基中并在30-37°C下培养8-16小时产生原代培养物。该预先接种物用于以2-10% ν/ν接种500ml LB-Amp培养基并允许在30-37 °C，180_280rpm下生长到0.D6tltlnm(在600纳米下测量的光密度)为0.5-1.0。在该阶段，其用IPTG(终浓度0.5-1.0毫摩尔)诱导(Chaudhary等，1999 ；Dhar等,2002)并在40°C在摇动条件下进一步生长6-12小时。然后在6000-7000g下离心10分钟收获细胞。然后将沉淀用冰冷的缓冲液(终浓度 100-150mM NaCl, 10-50mM Tris-Cl, pH8.0，和 l_5mM EDTA)洗涤两次并在4°C下进行超声处理，处理条件为30秒超声脉冲接着停止相等时间。然后将细胞裂解物以高rpm(10000-14000g)离心15分钟。SDS-PAGE分析表明90%需要的蛋白质已经进入包含体(IB)。然后在室温恒定温和震荡条件下在8M尿素中溶解IB45分钟。上清液中的蛋白质在上样缓冲液(20mM PB中0.4MNaCl)中10倍稀释(Sundram等，2003)后折叠。样品然后在苯基琼脂糖6XL珠上层析并在水中洗脱。将如此得到的蛋白质通过阴离子交换层析在DEAE-Sepharose?柱(GE-Amersham Biosciences)上进一步纯化。合并HIC后的蛋白质级分并加入Tris.Cl pH7.5至终浓度20mM Tris.Cl，之后将其装入填充DEAE-Sepharose (Fast Flow)的用 20mM Tris.Cl (pH7.5)预先平衡的柱子上。用含有 20mMTris.Cl (pH7.5)的缓冲液洗涤后，用20-25mMTris.Cl中盐的线性梯度(0-0.5M NaCl)洗脱结合的蛋白质。洗脱的SK蛋白质纯度通常大于95%，其通过SDS-PAGE分析。用Bradford的蛋白质估计方法(Bradford., 1976)测量每个级分中蛋白质的量并通过280nm下的吸光度证实。所有层析步骤在4°C下进行。含有蛋白质的级分与标准SK和分子量标准一起在SDS-PAGE上分析。适当地合并需要的级分以得到SK或SK突变体的同质制备物。
[0168]在美国专利7，163，817中描述了在大肠杆菌中SK和血纤蛋白结合结构域(FBDs)形成的多种构建修饰的构建体的过表达和纯化以及它们的体外再折叠，其中将表达的蛋白质进行体外再折叠并通过柱层析纯化。简言之，将溶解的包含体用蒸馏水稀释到lmg/ml的最终蛋白质浓度；加入下面的额外组分(给出了在稀释的混合物中的终浓度):Tris-Cl，pH8.0,50mM ；NaCl 100-150mM ；EDTAl-5mM ;还原和氧化的谷胱甘肽 1.25mM:0.5mM 的混合物。在填充血纤蛋白-sepharose珠的层析柱上分离和纯化再折叠群体。关于再折叠蛋白质的再折叠、纯化和表征的详细描述参见Sahni等；2007(美国专利号7，163，817)。
[0169]实施例4
[0170]链激酶的半胱氨酸变体与聚乙二醇的共价缀合
[0171]链激酶的半胱氨酸变体的硫羟基用不同大小如5KDa，20KDa和40KDa的马来酰亚胺活化的线性甲氧基PEG而选择性PEG化(JenKem Technology, USA)。关于PEG化反应，将待PEG化的多肽保持在含有100-150mM NaCl的50_100mM Tris-Cl缓冲液pH8.0中。向其中加入5摩尔过量PEG试剂。计算摩尔过量时考虑要与PEG试剂反应的自由硫羟基数目而不仅仅是蛋白质的摩尔浓度。将反应混合物在室温下搅拌1.5-4小时，然后通过加入ImMDTT终止反应。通过DEAE sepharose柱(GE-Amersham Biosciences)上的阴离子交换层析从游离PEG和未反应的SK纯化PEG化的蛋白质。用pH7.4的25mM磷酸钠缓冲液稀释反应混合物10-15倍，之后将其上样到填充DEAE-Sepharose (Fast Flow)的预先用相同缓冲液平衡的层析柱上。用含有25mM磷酸钠的缓冲液洗涤后，用25mM磷酸钠中的线性盐梯度(0-0.5M NaCl)洗脱结合的蛋白质。备选地，如果一些PEG化的衍生物不能通过离子交换与未反应的PEG完全分离,将这些反应物进行在Sephadex75 (Amersham Biosciences)上的大小排阻层析，使用中性pH和最终NaCl浓度100-150mM的缓冲液。而且，在一些情况下，显示出二硫键结合的二聚体的纯化的半胱氨酰基化蛋白质样品首先通过加入IOmM DTT还原。DTT处理的样品在填充S^hadex G-25 (细小)珠的层析柱上脱盐，立即用于PEG缀合。由于分子间二硫键形成的SK的同二聚体形式也可以用大小排阻层析在S印hadex75上分离，并且由于其大尺寸和缓慢清除而比单体链激酶在治疗用途方面更有用。
[0172]通过SDS PAGE证实所有情况下的PEG交联。凝胶电泳表明在除去未反应的蛋白质和游离PEG试剂后得到的级分中PEG化蛋白质>95%。图1显示了 SK的一些单和二 PEG化的变体。图A显示了链激酶的α结构域的一个代表性(D95C，SEQ ID N0:30)PEG化半胱氨酸变体，其中天然存在的天冬氨酸残基已经用半胱氨酸替换并且用分子量20KDa的甲氧基PEG马来酰亚胺缀合。图B描述了链激酶的β结构域的一个代表性(S258C，SEQ IDNO:49)PEG化半胱氨酸变体，其中β结构域中的250环中的天然存在的丝氨酸残基已经用半胱氨酸替换并且用20KDa分子量的甲氧基PEG马来酰亚胺缀合。图C显示了链激酶的Y结构域的一个代表性(C_Cys，SEQ ID NO:490)PEG化半胱氨酸变体，其中一个半胱氨酸已经置于SK的C-末端并且用20KDa分子量的甲氧基PEG马来酰亚胺缀合。图D显示了 SK的一个双PEG化的半胱氨酸变体(SEQ ID NO:493)，其中一个半胱氨酸置于分子的N-末端和C-末端各端并且用20KDa分子量的甲氧基PEG马来酰亚胺缀合。进行SK的两个末端处的PEG缀合，假设两个大的PEG基团将在柔性袋(flexible cocoon)中包住蛋白质并且在延长的时间内延长其体内存活。 同时，免疫显性区的广泛掩蔽可以在受试者中引起注射分子的可忽略的免疫反应性。合并含有PEG化蛋白质的级分并配制用于活性测定，在一些情况下，通过MALD1-T0F质谱法进一步表征。质谱法还证实链激酶和其共价修饰形式的PEG加合物的预期分子量。
[0173]实施例5
[0174]酪蛋白-纤溶酶原覆盖用于快速检测纤溶酶原活化能力
[0175]通过在软琼脂中覆盖酪蛋白和HPG检测SK和SK嵌合体的不同半胱氨酸变体的活性。修改了 Malke和Ferretti, 1984的初始方法，其中将纯化的SK(0.1-0.5微克)直接点到LB-Amp琼脂平板上经标记的凹陷上。然后将平板在37°C温育10分钟；之后，通过在含有点的平板上方小心倾倒溶液A和B的混合物覆盖酪蛋白-HPG-琼脂。溶液A如下制备:将Ig脱脂乳在15ml50mM Tris, Cl (pH7.5)中加热，然后将其在水浴中保持在37°C备用。溶液B如下制备:在15ml50mM Tris.Cl (ρΗ7.5)中在50°C下加热0.38g琼脂糖。溶液回火到37。。后，加入3 μ I TritonX-100 (0.04% ν/ν)和 100-200 μ g HPG并温和混合，不产生泡沫。然后平板在37°C温育1-4小时并观察由于HPG活化之后酪蛋白水解引起的透明区域的产生(晕圈形成)。考虑琼脂糖培养基中围绕孔的裂解区(晕圈)的面积以比较链激酶和其共价修饰变体的纤溶酶原活化能力。链激酶的所有半胱氨酸变体都保持了大部分纤溶酶原活化能力，如通过酪蛋白-HPG覆盖测定法检测。取链激酶的半胱氨酸变体用于与5000道尔顿到40，000道尔顿的不同分子量的硫羟反应性PEG进行PEG缀合并使用酪蛋白-HPG覆盖测定法测定它们的活性和与PEG缀合的活性，验证纤溶酶原活性能力的损失。链激酶的所有PEG修饰的变体在酪蛋白裂解测定法下显示出重要的纤溶酶原活化能力并且在治疗上有用。然而，临床上需要的合适半寿期与降低的免疫原性的理想组合使得一些衍生物比其他的更有用。相比，一些情况下降低的活性可以通过增加的蛋白水解能力和PEG蛋白质加合物的体内半寿期弥补。
[0176]备选地，也如[0046]和[0047]中解释的，测量纤溶酶原活化能力。表29显示了一些代表性PEG化SK变体的HPG活化能力和动力学常数。表30概述了含有血纤蛋白结构域融合的共价修饰链激酶的不同PEG化变体的活性范围。
[0177]截短形式SK(50-414和60-383)和它们的PEG化变体的活性测量需要补充合成的肽1-49用于最佳氨基裂解和纤溶酶原活化能力。文献中已经记载了缺少对应于1-59区的N-末端肽的SK截短变体，其是弱的纤溶酶原激活物，并且在反应混合物中补充SK1-59肽时对于最佳氨基裂解和纤溶酶原活化能力显示出增加的活性(Nihalani等，1998和Sazonova等，2004)。不含有1-49或者更短的N-末端肽的SK的PEG化衍生物显示出对纤溶酶原活化的血纤蛋白依赖性；因此它们的作用主要局限于凝块，使得它们是凝块特异性的。
[0178]实施例6
[0179]链激酶的 PEG化半胱氨酸变体的蛋白水解稳定性
[0180]对于蛋白水解稳定性，将50微克每种PEG化的衍生物和天然SK (作为对照)与50微升50mM Tris-Cl和IOOmM NaCl温育。向其中加入胰蛋白酶到PEG化蛋白质:胰蛋白酶的最终比例为1000:l(w/w)。反应物在摇动条件下25°C下保持2到4小时。将胰蛋白酶化蛋白质的等分试样点样到LB-Amp琼脂板上并以与实施例5中对于检测SK活性所解释的类似的方式测量残留活性。点样来自对照反应的相等等分试样，对照反应中，向反应物中仅仅加入胰蛋白酶或者仅仅SK或SK杂合物。在这种情况下，对每种胰蛋白酶化的PEG化链激酶或者共价修饰变体测量琼脂糖覆盖物上裂解区。裂解区面积成为受保护的链激酶或其变体的残留纤溶酶原活化能力的直接度量。当不同的SK变体用单、双或三PEG结构部分缀合并与胰蛋白酶或纤溶酶温育时，在该研究中该测定法显示出对不同SK变体的显著保护。我们发现将一个以上的PEG基团连接到SK变体使得蛋白水解稳定性倍增。
[0181]备选地，通过使用前面描述的一步分析法使用生色底物通过分光光度法[0046]测试其纤溶酶原活化能力，也证实了胰蛋白化PEG化链激酶或其共价修饰变体的残留活性测量。向在测定缓冲液(50mM Tris-Cl缓冲液，pH7.5，含有0.5_lmM生色底物和0.1M NaCl)含有1_2μ M的HPG的多孔板中加入不同浓度(1-1OnM)的胰蛋白酶化SK和PEG化SK变体至最终体积100微升。向孔中加入所有其他组分后加入蛋白质等分试样。然后在来自Molecular Devices Inc., USA的Versa-Max型可调微平板读出器中测量405nm下吸光度随时间的改变。通过该方法得到的结果与通过酪蛋白裂解测定法得到的结果一致。发现当与胰蛋白酶温育时在链激酶和其共价修饰形式的所有PEG化形式中保留了显著功能活性。未PEG化的链激酶当进行相似条件时仅仅显示出可检测的活性并且易于被胰蛋白酶消化。
[0182]也在还原SDS-PAGE上检查了进行胰蛋白酶处理的样品以物理上观察蛋白水解稳定性，和由于蛋白水解导致的截短片段的产生。这得到了受保护蛋白质进行胰蛋白酶消化的定性评估。为此，从反应混合物以不同时间间隔取等分试样并通过加入20M过量大豆胰蛋白酶抑制剂(GE-Amersham Biosciences)抑制以终止任何进一步的胰蛋白酶活性。在不同时间点(5-180min)收集的样品在10% SDS-PAGE上进行电泳并分析受保护的完整蛋白质。从该工作得到的结果也证实了我们的胰蛋白酶化蛋白质的功能检查。在测定条件下更多残留的纤溶酶原激活能力也反映在当在SDS-PAGE上检查物理完整性时蛋白质的更多保护中。
[0183]实施例7
[0184]N和C末端延伸的SK变体和它们的PEG修饰形式
[0185]为了建立在链激酶或其变体的N或C末端的一些氨基酸的任意延伸将不变地产生与用它们未延伸的对应物所得到的相同结果，将SK或其半胱氨酸变体在N-末端或C-末端用小的氨基酸延伸进行修饰。
[0186]使用两种不同策略制备N-末端延伸形式，得到两种不同长度的多肽，即一个具有6个氨基酸的延伸，另一个具有20个氨基酸的延伸。使用重叠延伸策略,将编码6个组氨酸残基的18个核苷酸的延伸置于成熟链激酶的N-末端氨基酸之前。该修饰的产物为N-末端延伸的蛋白质，其具有额外的6个氨基酸。为了掺入20个氨基酸的延伸，将编码SK或其变体的盒从 pET23d 转化为 pET15b (Cat.N0.69661-3，Novagen, Inc.US)。将盒置于 pET15b中得到了 20个氨基酸的N-末端延伸，其包括一段6个组氨酸残基和凝血酶切割位点。用凝血酶可以实现从多肽切割N-末端延伸。这除去了一段组氨酸标记并且产生了仅具有SK的氨基酸序列的经加工的多肽。SEQ ID N0496显示了由于在pET15b中克隆得到的SK的氨基酸序列。
[0187]为了产生C-末端延伸产物，使用`重叠延伸策略将一段6个组氨酸残基加入刚好SK或其变体的最后一个氨基酸之后。这导致额外的6个残基置于C-末端。使用金属亲和层析或者实施例2中解释的纯化方法纯化蛋白质得到同质的纯化产物。随后，使用实施例4中解释的化学方法用PEG修饰SK或其变体的这些纯化的N或C-末端延伸产物。功能活性和蛋白水解稳定性的生物化学表征产生了与它们的未延伸对应物所得的结果相似的结果。这给出了有力的证据断定SK或其变体的其他N-或C末端延伸产物将产生相似的结果。技术人员可以想到延伸SK或其变体的N-和C-两个末端以产生链激酶的功能形式的无数可能性，所述功能形式可以用于半胱氨酸取代、插入或添加和随后用PEG或其他巯基反应试剂对它们进行巯羟修饰。
[0188]实施例8
[0189]对SK变体分配新的功能属性，其中PEG基团连接到SK或其截短变体的两个末端，即N和C末端。
[0190]观察到对研究中的链激酶和其任何截短的功能变体的N-和C末端同时加入PEG基团使得其活性依赖于纤溶酶。当我们观察到双PEG化的SK变体在纤溶酶原激活图谱中显示出几分钟的滞后(见图3)时，指定了该新的功能属性。让我们惊奇的是，当双PEG化的SK变体在与纤溶酶复合后检查纤溶酶原激活时，其显示出纤溶酶原激活的正常(即天然SK样)动力学(见图4)。不能立即自活化(天然的未修饰SK是立即自活化，其几乎在接触时就活化PG)是由于其作用的纤溶酶依赖模式。相反，天然SK不需要任何纤溶酶被活化，而是其与PG—旦复合就几乎被活化。在实验中，在纤溶酶原激活的进展曲线的不同时间点(即在早期(滞后期中)、快速活化期等)从反应物抽取样品，并用SDS-PAGE分析以跟踪产物的类型，观察到在产生截短的片段后紧接着活化，其中在多肽末端含有PEG的肽区段被纤溶酶的作用切除。通过质谱法分析得到相似的结果。这些结果清楚地建立了 PEG修饰的SK的纤溶酶原活化与去除PEG基团之间的相关性，表明纤溶酶介导的活化机理，其中大的PEG基团一旦被除去，允许SK片段与纤溶酶原相互作用，正如nSK —样，并将其快速活化。因此，末端PEG基团的存在——除了赋予(不管位置如何)预期的对蛋白水解的稳定影响、免疫反应性等之外——还导致出乎意料地产生纤溶酶依赖的“开关”，其在血栓溶解疗法中具有非常有益的作用。
[0191]在截短SK的其他双PEG的半胱氨酸变体中发现了纤溶酶依赖性的功能属性，即内在的“纤溶酶开关”，其中将额外的半胱氨酸置于多肽的两个末端，即N和C末端，其在人纤溶酶原激活特征方面显示出出乎意料的性质，因为它与未修饰的SK相比显示出活化纤溶酶原(PG)的显著更慢的初始速度，但是当测定体外PG活化时，在几分钟的初始滞后之后，变得完全能够以类似于未修饰SK的方式活化纤溶酶原。表4显示了 SK和两种不同的双PEG化SK变体的HPG活化的稳态动力学参数。NC1-414表示SK变体，其中半胱氨酸已经加入天然存在的N-末端氨基酸之前和C-末端氨基酸之后以产生SK的双半胱氨酸突变体。NC1-383表示SK的截短变体，其中一个半胱氨酸分别被加入天然存在的N-末端氨基酸之前和与第383个氨基酸相邻的三个连续甘氨酸残基之后。数据表明两种双PEG化的变体在变得完全有功能之前都显示出显著的初始滞后。当从消除滞后期之后的反应进行曲线的线性期计算时，动力学参数表明初始滞后结束后一旦完全活化，两种双PEG化的变体当与SK比较时在它们的PG活化能力方面变得有显著活性。用两种双PEG化SK变体(其中PEG连接到末端)得到了相似结果，表明该新的功能属性有效地依赖于位置的并且不仅仅依赖于同一分子中存在双PEG修饰。从而，只要SK的任何功能片段中N和C-末端的两个末端之一或两者被PEG化，纤溶酶依赖性`都被赋予该分子。
[0192]此外，将对本领域技术人员显而易见的是，此类功能属性也可以通过在两个末端中和周围的任何修饰(如合适的赖氨酸侧链)而赋予该分子，由于链激酶的蛋白水解加工将也导致纤溶酶原激活特征的纤溶酶依赖性滞后，其中通过蛋白水解除去此类“封端”基团，其可以是PEG结构部分、其他蛋白质结构域、完整蛋白质如白蛋白等等，允许多肽的其余部分相对于纤溶酶原活化变成功能活性的。因此，当使用可利用的任何化学方法将PEG基团连接在末端时可以预期类似的效果。一种此类化学方法利用N-末端的α氨基的差别性PKa值来将胺反应性PEG基团特异性缀合在α胺处。末端的不同的截短组合的类似属性表明只要两个PEG基团置于两个末端中或周围的任意位置，就可以在分子中产生纤溶酶依赖性。
[0193]从而，注射到体内后，此类SK变体将通过血管系统输送，而仍然处于无活性的或部分活性状态。然而，其将在接触凝块时在凝块附近优先变得活化，已知凝块是富含纤溶酶的而全身循环不富含纤溶酶((由于存在纤溶酶特异性Serpins [丝氨酸蛋白酶抑制剂]如α -2-抗纤溶酶和α -2-巨球蛋白)，游离的纤溶酶在“开放”循环中被快速失活)，从而避免或者显著减小了与天然SK施用同时发生的系统性PG活化，天然SK施用在施用时立即活化PG，这具有随后的副作用，如出血和血管系统的多种蛋白质组分的大规模破坏。该性质，即纤溶酶依赖性活化，以及延长的清除半寿期和低免疫原性和抗原反应性，将不仅导致在全身循环中游离纤溶酶的产生总体上减少，而且导致以相对较低的剂量为多种循环疾病反复施用血栓溶解剂而避免不需要的免疫反应的能力。净结果将是通过显著降低的治疗有效剂量的血栓溶解剂维持靶标处持续并且更有效的血纤蛋白溶解，并且减小副作用。
[0194]在该属性上的进一步改进是通过将PEG基团置于SK50-414或SK60-383变体的两个末端赋予双PEG化分子血纤蛋白依赖性。该结果是可能的，因为“催化性开关”(SK残基1-59)的缺失改变了 SKa结构域的构象，并且将此类截短的片段转化为血纤蛋白依赖的纤溶酶原激活物，如Reed等，1999和Sazonova等，2004报道。设计此类双PEG化变体的预期结果是纤溶酶依赖性和改进的血纤蛋白依赖性/亲和力。这两者属性，即纤溶酶依赖性和血纤蛋白亲和力/选择性使得该分子成为高度针对血纤蛋白凝块的PG激活物。此类分子可以有效避免全身性PG活化的问题，并且允许仅仅在血纤蛋白凝块附近发生严格的PG活化。
[0195]实施例9
[0196]链激酶的PEG化半胱氨酸变体的药物代谢动力学分析
[0197]用于动物中注射的所有蛋白质通过穿过由多粘菌素B (Polymyxin)琼脂糖(BioRad Inc., Palo Alto, CA,美国)凝胶组成的柱子完全处理以除去内毒素。代表每个结构域中半胱氨酸掺入的多种单PEG化的SK衍生物和天然SK(作为对照)用1dogen (Fraker&Speck.1978)方法用125I放射性碘化,并通过穿过Sephadex G-25脱盐柱与游离的放射性碘分离。用3%异氟烷(iso-fluorane)麻醉⑶I小鼠(23_25g)并通过将尾巴暴露于100瓦荧光灯诱导 轻微血管舒张。然后通过尾静脉对小鼠注射在无菌盐水中的约7微克放射性碘化的蛋白质，使用尾部处理或者从后眼窝窦随时间收集约50微升全血样品并保持在肝素化的eppendorf管中。处理样品以产生血衆并在Perkin-Elmer Y -闪烁计数器中评估125I活性。测定血浆125I活性后，向每份血浆等分试样加入等体积的20% TCA,以测定保持与完整蛋白质结合的125I活性量。将样品快速涡旋混合并置于冰上15分钟。等分试样以约3000x g离心10分钟，从每个样品吸取含有游离标记或者与片段化蛋白质结合的标记的上清液。分析所得的TCA沉淀的沉淀物的125I活性。通常，处理一式两份样品并将值平均。
[0198]注射链激酶的PEG化半胱氨酸变体后不同血浆样品中残留的酸可沉淀的放射性用于体内半寿期测定。半寿期研究结果表明当它们与单或双或三个PEG结构部分缀合时，不同的PEG变体的不同程度的体内保留。结果表明加入多于一个PEG基团，所得的半寿期也增加。一些所选的PEG化SK变体的半寿期总结在表32中，其显示了对于链激酶的不同的单、双和三PEG化的半胱氨酸变体，清除半寿期平均增加5到120倍。发现SK的PEG化半胱氨酸变体的血浆保留时间取决于PEG连接的位置。α 88-97环PEG变体显示出体内保留时间的最大增加(~15-20倍)，而SK的β结构域PEG变体显示出体内保留的中等增加(~10-12倍)。Y结构域PEG变体显示出体内半寿期接近4-5倍增加。通常，所有PEG化的链激酶当与天然SK(12-15分钟)相比时显示出半寿期的多倍增加。这表明PEG化半胱氨酸变体的体内半寿期的显著增加，并且表明PEG化SK的延长的作用时间。PEG化后用其他半胱氨酰SK变体得到了相似的结果。公知PEG化变体的延长的作用时间是PEG结构部分的结果并且不依赖于SK上PEG聚合物的位置。从而，通过半胱氨酸残基连接PEG结构部分将导致PEG化或SK嵌合变体具有延长的作用时间特征，这允许较少施用PEG化的化合物而在延长的时间内保持高血液水平的该化合物。
[0199]当连接两个PEG基团时清除半寿期的相加性表明可以通过以所需的数目、位置缀合PEG基团以及通过改变PEG聚合物大小，随意地或者定制操纵清除半寿期。
[0200]实施例10
[0201 ] 链激酶的PEG化半胱氨酸变体的免疫反应性 [0202]通过基于ELISA的方法检查nSK和SK与其共价修饰的形式的PEG化半胱氨酸变体针对兔中产生的SK(多克隆)抗血清的反应性。ELISA的步骤如下。
[0203]1.将SK和PEG化SK变体首先在0.2M碳酸氢盐缓冲液，pH9.2中稀释得到100微升含有0.75微克到1.5微克蛋白质的溶液，并将其加到微量滴定板(Nunc96-孔微量板，Cole-Parmer USA)的每个孔中。
[0204]2.将抗原包被的平板用石蜡覆盖并在冷室中在含有湿纸巾的潮湿盒子中过夜温育或者在室温并且潮湿、温和摇动的条件下温育2小时。
[0205]3.将平板倒空，并且将未占据的位点用200μ I封闭缓冲液在室温封闭I小时，所述封闭缓冲液含有在磷酸缓冲盐水(PBS)中的5-10%脱脂乳。
[0206]4.将平板倒空并且用由PBS组成的洗涤缓冲液洗涤四次。
[0207]5.首先在PBS中稀释一级抗体溶液，得到50000倍的稀释倍数。向每孔加入100 μ I稀释的抗体。然后在温和摇动下室温下温育平板45-60分钟。
[0208]6.再次倒空平板并用洗涤缓冲液洗涤四次。
[0209]7.在PBS中适当稀释针对抗原的辣根过氧化物酶(Horse-redish peroxidase)标记的抗体。向每孔中加入100 μ I该稀释液并在室温温育I小时。
[0210]8.再次倒空平板并用IX PBS洗涤六次。
[0211]9.向每孔加入ΙΟΟμΙΙΧ TMB(四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine)液体底物，Sigma-Aldrich,美国)并在室温下放置平板10分钟。
[0212]为了停止反应，向每孔加入50 μ IlN硫酸并在450nm通过分光光度计读出显色。
[0213]为未修饰的nSK和SK的多种PEG化变体得到的ELISA中450nm下的吸光度值用于评估它们针对兔中产生的SK多克隆血清的免疫反应性的相对水平。ELISA研究表明在SK的三个结构域的任一个中缀合一个20KDa的PEG基团将其针对SK多克隆血清的反应性降低到20%以下。缀合两个20KDa的PEG基团，即一个在SK的N末端，另一个在C末端，将它们针对SK多克隆血清的反应性降低到10%以下。缀合三个20KDa的PEG基团，即SK的每个结构域一个，使得反应性基本上检测不到。所以，PEG结构部分与SK的不同区域的缀合明显降低了它们对SK多克隆血清的反应性。体外测试表明降低的抗体反应性，确定了一旦PEG化的蛋白质被注射到活动物中，就降低了免疫反应的诱导。
[0214]表33列出了 PEG化SK变体中保留的免疫反应性百分比，这是将野生型未修饰SK的反应性视作100%。本发明从而公开了具有显著降低的免疫反应性而具有完整的溶血栓效力的PEG化的链激酶变体。
[0215]本发明的优点[0216]本发明的优点在于公开了链激酶、其突变蛋白、物种变体和共价修饰形式的半胱氨酸变体的设计。本发明中公开的与半胱氨酸变体的位点特异性PEG缀合对链激酶分子赋予了多种有用的治疗性质，如增加的蛋白水解稳定性、增加的体内半寿期和降低的免疫反应性。更具体地，本发明涉及生产工程化的链激酶衍生物用于治疗循环系统病症的药物组合物中。
[0217]表1
[0218]为半胱氨酸取代所选的多种氨基酸的溶剂可及性值
[0219]
SK或变体.Τ_胱鉍酸突变位置可及性
188α结构域的88-97环30
S93α结构域的88-97环42
D95α结构域的88-97环
D96α结构域的88-97环58
D102α结构域的β458
S105β4，前123
D120β5和β6之间的区域65
Κ12〗β5和β6结构域 之间的区域1Q9
D122α结构域的β5和β6结构域之间的区域 101
Ε148α和β结构域的接头区118
Κ156α和β结构域的接头区109
Dl73β结构域的β?和β2之间的环145
D174β结构域的β?和β2之间的环111
L179β结构域的β254
[0220]
【权利要求】
1. 一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨基酸序列。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包含具有选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨基酸序列的多肽。
3.一种治疗血栓形成的方法，所述方法包括具有选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨基酸序列的多肽。
4.具有选自由SEQID NO:22-24组成的组的氨基酸序列的多肽在制备用于治疗血栓形成的药物中的用途。
5.一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含SEQ ID NO:24的多肽。
7.一种利用SEQ ID NO:24的多肽治疗血栓形成的方法。
8.SEQ ID NO:24的多肽在制备用于治疗血栓形成的药物中的用途。
【文档编号】A61P7/02GK103627690SQ201310559849
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2009年3月31日 优先权日:2008年3月31日
【发明者】谢卡尔·库马, 尼拉·马赫什瓦里, 吉里什·萨尼 申请人:科学与工业研究委员会