一种延胡索总生物碱的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了中药延胡索中总生物碱类的分离纯化方法及其纯化物在抗胃溃疡药效学方面的应用。本发明可以在延胡索中分离纯化出较高纯度的总生物碱富集物，解决了延胡索中总生物碱类与大量非生物碱类杂质难以分离，总生物碱纯度低，利用率低以及其治疗胃溃疡药效低的问题。延胡索总生物碱的分离纯化方法为：延胡索粗粉经提取、大孔吸附树脂纯化得一次纯化产物，再经有机溶剂萃取得到高纯度总生物碱富集物。本发明得到的总生物碱纯度达90%以上，大大提高了生物利用度，作为治疗抗溃疡的有效成分，用于治疗胃溃疡、口腔溃疡等各种溃疡疾病。
【专利说明】一种延胡索总生物碱的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药的制备方法，特别是涉及中药延胡索总生物碱的高纯度分离纯化方法及其抗溃疡领域的应用。
【背景技术】
[0002]胃溃疡是我国人群中常见病、多发病之一。作为消化性溃疡中的常见类型，胃溃疡的发病率呈升高趋势，是消化系统疾病的最常见疾病之一。研究证明，延胡索所含成分种类繁多(蔡梅超延胡索的化学成分及质量标准研究化工时刊2012，26 (3))，主要有效成分为总生物碱类，难溶于水，具有较强的活性，其中叔胺类成分约占65 %，季铵类成分约占30% (贺凯等延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展中草药2007,38(12))，延胡索中的生物碱具有很强的抗炎镇痛、镇静、降压和抗心律失常等作用(鲁春梅延胡索化学成分及药理作用研究进展中国现代药物应用2011，5 (15):126~127)，除生物碱外，延胡索中尚含有大量淀粉，少量黏液质、树脂、挥发油等。临床上延胡索多见于抗炎镇痛的复方中，临床治疗止痛效果显著，毒副作用小，可治疗多种疾病，本发明通过体外抗溃疡试验证明了其亦有明显的抗溃疡作用。而有关其有效成分总生物碱富集物纯度达90%以上的高纯制备方法、抗溃疡活性研究迄今为止尚未见报道。
[0003]
【发明内容】
本发明目的在于提供中药延胡索总生物碱的分离纯化方法。
[0004]本发明给出了一个能够提高总生物碱纯度的新方案，主要是纯化延胡索中的总生物碱类活性成分，解决了总生物碱纯度低，利用率低以及其治疗胃溃疡药效低的问题。
[0005]本发明的延胡索总生物碱的分离纯化方法为:一、将延胡索药材粉碎过40-60目筛，用回流提取法对其进行提取，然后将提取液进行减压浓缩；二、提取液稀释成0.1~0.2g/mL的浓度，以mL/min的流速通过大孔吸附树脂柱进行动态吸附；三、用4飞倍柱体积的蒸馏水清洗吸附后的树脂柱除去水溶性杂质，8~10倍柱体积的90%的乙醇洗脱总生物碱类有效成分，收集洗脱液并蒸干即得总生物碱一次纯化产物富集物；四、用稀酸液溶解一次纯化产物富集物，充分溶解均匀，先以有机溶剂萃取除杂，再加入碱化试剂调节PH，用有机溶剂萃取出总生物碱，收集有机溶剂层并回收有机溶剂、蒸干，即得高纯度延胡索总生物碱富集物。
[0006]经体外抗溃疡细胞药效实验，证明延胡索总生物碱可有效的治疗溃疡类疾病，且随着纯度的提高 ，其抗溃疡药效也有了明显的提高。
[0007]本发明优化了萃取方法。根据延胡索总生物碱难溶于水，易溶于有机溶剂，萃取时用酸水溶解可使生物碱以盐的形式存在于酸水中，使非生物碱类杂质游离出来，此时萃取可将非生物碱类杂质萃取出来，再向溶液中加入氨水碱化，使PH至扩10，此时生物碱又重新游离出来，加入有机溶剂萃取可将生物碱类萃取出来，经测定总生物碱纯度>90%。
[0008]本发明得到的总生物碱纯度达90%以上，大大提高了生物利用度，作为治疗抗溃瘍的有效成分，用于治疗胃溃瘍、口腔溃瘍等各种溃瘍疾病。[0009]【具体实施方式】:
本发明提供以下技术措施，实施例仅用于说明本发明，并不是限制发明的权利范围。
[0010]本发明的发明人根据临床的需要将延胡索总生物碱富集物制备为各个剂型而可添加药学上可接受的辅剂及载体供临床选择应用。
[0011]实施例一
本实施方式的延胡索总生物碱制备方式为:一、将延胡索药材粉碎过60目筛，用回流提取法对其进行提取，然后将提取液进行减压浓缩；二、提取液稀释成0.15 g/mL的浓度，以I mL/min的流速通过大孔吸附树脂柱进行动态吸附；三、用5倍柱体积的蒸馏水清洗吸附后的树脂柱除去水溶性杂质，10倍柱体积的90%的乙醇洗脱总生物碱类有效成分,收集洗脱液并蒸干即得总生物碱一次纯化产物富集物；四、用稀酸液溶解一次纯化产物富集物，充分溶解均匀，先以有机溶剂萃取除杂，再加入碱化试剂调节PH，用有机溶剂萃取出总生物碱，收集有机溶剂层并回收有机溶剂、蒸干，即得高纯度延胡索总生物碱富集物。
[0012]本实施方式的延胡索总生物碱纯度达90%以上，体外抗溃疡药效显著。
[0013]实施例二
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤一中将延胡索粗粉过60目筛，加入6倍量的乙醇，回流提取法的提取溶剂为70%的乙醇，提取时间为1.5 h，提取次数为3次，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0014]实施例三
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤二中将提取液稀释以I mL/min的速度通过树脂柱，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0015]实施例四
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤三中用5倍柱体积的蒸馏水清洗吸附柱，用10倍柱体积的90%乙醇洗脱总生物碱，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0016]本实施方式的延胡索总生物碱纯度为48%。
[0017]实施例五
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤四中采用的稀酸溶液为0.1 mol/L盐酸溶液，采用的除杂的有机溶剂为氯仿，与药液的体积比为1:1，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0018]实施例六
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤四中经有机溶剂萃取除杂后的药液，采用的碱化试剂是氨水，碱化药液的PH为10,碱化时间为40 min,再用有机溶剂萃取的方法萃取延胡索总生物碱，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0019]实施例七
本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤四中采用的有机萃取溶剂为氯仿、乙酸乙酯或正丁醇，按照极性由小到大的顺序分段综合萃取，收集并合并有机溶剂层，其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0020]实施例八
本实施方式的延胡索总生物碱制备方式为:一、将延胡索药材粉碎过60目筛，用回流提取法对其进行提取，然后将提取液进行减压浓缩；二、提取液稀释成0.15 g/mL的浓度，以I mL/min的流速通过大孔吸附树脂柱进行动态吸附；三、用5倍柱体积的蒸馏水清洗吸附后的树脂柱除去水溶性杂质，10倍柱体积的90%的乙醇洗脱总生物碱类有效成分，收集洗脱液并蒸干即得总生物碱一次纯化产物富集物；四、用0.lmol/L的稀盐酸溶解一次纯化产物富集物，充分溶解均匀，生物碱以盐的形式存在，先以等体积的氯仿萃取除去游离的非生物碱类杂质，再加入氨水碱化调节PH为10碱化40 min，继续按照氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的顺序以药液等体积的有机溶剂分段萃取，收集并合并有机溶剂层，即得高纯度延胡索总生物碱富集物。[0021]本实施方式的延胡索总生物碱纯度为92%，大大提高了生物利用度。
[0022]药效试验:
体外细胞药效学实验
一、人胃粘膜上皮细胞GES-1细胞株用DMEM培养基加10%的小牛血清，在标准C02培养箱中常规培养2~3天，隔天换液，约90%满瓶时传代[8]。取对数生长期、状态良好的细胞，接种于96孔培养板，每孔100 UL(除空白调零孔外)。设空白调零孔(只加培养基，酶标仪调零用)、空白对照孔、模型孔，和给药试验孔(给药试验孔分为六组)，每组设6个复孔。置370C 5% C02培养箱中继续培养约12 h，待细胞贴壁完全，弃去旧培养液，PBS洗2次，用不完全培养基同步24 h，PBS洗2次。
[0023]细胞损伤模型的制备:模型控和给药试验孔分别补加100 UL 8 %无水乙醇，培养
2h后吸弃培养基，PBS洗2次。经MTT检测使细胞抑制率达到30%左右。
[0024]二、MTT法测定细胞抑制率
空白对照孔和模型孔分别补加100 μ L培养基培养2 h后吸弃培养基，PBS洗2次。空白对照孔和模型孔加入100 μ? 10 %空白血浆，给药试验孔分别加延胡索一次纯化生物碱富集物高、中、低剂量组，延胡索二次纯化生物碱富集物高、中、低剂量组的供试品溶液经大鼠灌胃给药得到的含药血浆100 μ L，浓度为10 %。各组细胞经分别处理后于37 °C、5 %C02培养箱中继续培养24 h，每孔补加20 μ L培养液，继续培养3 h，每孔加入200 μ L/孔新鲜配置的含0.2 mg/mL MTT的无血清培养液于37 °C CO2培养箱中培养4 h，吸弃上清液，加入DMSO 200 μ L,震荡混匀后易溶解结晶，用酶标仪于490nm波长处读取光密度值A49tl，测定OD值。按下式计算不同组细胞的生长抑制率。MTT抑制率=(0D试验组/OD对照组一I) X100%。
[0025]表1不同组别含药血浆对损伤GES-1细胞光密度及抑制率的影响
【权利要求】
1.延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于包括下述工艺步骤: 1)将延胡索药材粉碎过60目筛，用回流提取法对其进行提取，然后将提取液进行减压浓缩； 2)提取液稀释成0.15 g/mL的浓度，以1飞mL/min的流速通过大孔吸附树脂柱进行动态吸附； 3)用5倍柱体积的蒸馏水清洗吸附后的树脂柱除去水溶性杂质，再用乙醇洗脱总生物碱类有效成分，收集洗脱液并蒸干即得总生物碱一次纯化产物富集物； 4)用稀酸液溶解一次纯化产物富集物，充分溶解均匀，先以有机溶剂萃取除杂，再加入碱化试剂调节PH，用有机溶剂萃取出总生物碱，收集有机溶剂层并回收有机溶剂、蒸干，SP得。
2.按照权利要求1所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤一中的回流提取法提取溶剂为70%的乙醇。
3.根据权利要求1或2中延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于向延胡索粗粉中加入6倍量的乙醇，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。
4.根据权利要求1所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤二中将提取液以I ml/min的流速通过AB-8大孔吸附树脂进行动态吸附。
5.根据权利要求1所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征是步骤三中以10倍柱体积90%的乙醇洗脱延胡索 总生物碱。
6.根据权利要求1所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征为步骤四中采用的稀酸溶液为0.lmol/L盐酸溶液。
7.根据权利要求1所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征为步骤四中采用的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯或正丁醇。
8.根据权利要求1和5所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征为步骤四中萃取时采用的碱化试剂为氨水、三乙胺、碳酸钠、氢氧化钙溶液或氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1和7所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于加入I倍体积的有机溶剂萃取。
10.根据权利要求1和8所述的延胡索总生物碱的分离纯化方法，其特征在于碱化试剂调节PH至10，碱化时间为40 min。
【文档编号】A61P1/02GK103623064SQ201310569458
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】孟宪生, 李爽, 包永睿, 王帅 申请人:辽宁中医药大学