Dc细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了贴壁单个核细胞、未成熟DC细胞和成熟DC细胞的制备试剂盒和制备方法，以及利用上述方法制得的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用，属于生物【技术领域】。本发明采用CD14单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿制备贴壁单个核细胞，采用GM-CSF、IL-4和IFN-α制备未成熟DC细胞，采用TNF-α和OK-432制备成熟DC细胞。利用本发明提供的方法，能增加单个核细胞的贴壁能力，增加贴壁细胞数目，从而有利于减少杂质细胞对其转化为未成熟DC的影响；能提高未成熟DC细胞产率；能获得成熟度更高、细胞迁移能力和IL-12p70分泌能力更强的成熟DC细胞。
【专利说明】DC细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地，涉及贴壁单个核细胞、未成熟DC细胞和成熟DC细胞的制备试剂盒和制备方法，以及利用上述方法制得的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤免疫治疗被认为是手术、放疗和化疗三大常规疗法后的第四大治疗方法。肿瘤的免疫治疗是激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。树突状细胞是由2011年诺贝尔生理学或医学奖获得者拉尔夫?斯坦曼在1973年所发现并命名的一种功能最强的抗原递呈细胞，能将肿瘤抗原的信息通过主要组织相容性复合物(MHC I和MHC II)限制性方式将多肽复合物作为抗原传递给CTL和Thl细胞，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起着关键作用。
[0003]自从1996年美国斯坦福大学医学中心Hsu等在Nature Medicine上报道全球首项肿瘤DC疫苗临床试验以来，截止到2011年7月16日，全球有关DC的临床试验共424项，其中274项为DC肿瘤疫苗临床试验，其中美国165项，占了半壁江山，中国6项(其中台湾3项)。
[0004]全球进行的肿瘤DC疫苗临床试验，大部分均采用自体外周血单个核细胞等分化为未成熟DC细胞后，利用各种类型的肿瘤抗原进行负载，再使用多种细胞因子促进DC细胞的成熟，最后将负载有肿瘤抗原信息的成熟DC细胞通过各种途径回输入人体。单个核细胞来源的DC细胞不能增殖，其数量取决于单个核细胞分化为未成熟DC的转化率。目前进行的临床试验，大部分采取的是贴壁法获得单个核细胞，这种方法所获得的贴壁细胞，除了单个核细胞外，还有大量的杂质细胞(如粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、Treg细胞等)，这些杂质细胞，会限制未成熟DC细胞的生产率。若是采用充分冲洗培养皿壁的方法来去除，又会不可避免的造成半贴壁状态的单个核细胞的大量丢失，这一方法只能获得单个核细胞1%~5%的产量，且病人个体之间、实验室之间、不同操作人员之间产率差别较大。少部分临床试验采用CD14单抗磁珠分选方法，但该法操作步骤复杂，操作时间长，而且其高昂的费用必然会限制临床应用。有文献表明，利用CD14单抗磁珠分选方法，虽然可以避免杂质细胞对单个核细胞转化为未成熟DC细胞的影响，但与贴壁法生成的DC细胞相比，其吞噬能力减弱。因此，CD14+单个核细胞的提取方法，仍需进一步改善。
[0005]临床研究中的DC细胞来源，主要来自于外周血的单个核细胞，其培养方法多种多样，比如经典的GM-CSF+IL-4刺激法；GM-CSF可以促进单个核细胞等向DC细胞转化，IL-4则起到抑制粒细胞和巨噬细胞产生的作用；但是该方法获得的未成熟DC细胞的数量和纯度较低。
[0006]DC细胞的成熟状态是决定DC疫苗有效性的一个关键因素。因为未成熟的DC致敏T细胞的能力有限，还可能诱导T细胞耐受。另外，与粘附性较强的未成熟DC相比，成熟DC的迁移能力更强，能更加有效地迁移至淋巴结的T细胞区，进而有效诱导免疫反应。经典的促进DC细胞成熟的方法是利用TNF-α或者利用COOKTAIL(TNF-a、IL_6、IL_1 β、PEG2)刺激未成熟的DC细胞。然而，在一项III期的黑色素瘤的DC疫苗临床试验中，尽管使用了所谓“金标准”的COCKTAIL刺激DC细胞成熟，仍然未取得明显的临床疗效。研究者认为一个可能的原因是使用了 PEG2，虽然可以提高DC细胞CCR7的表达并增强其向二级淋巴结转移的能力，但却会显著抑制DC细胞分泌IL-12的能力。为了提高DC细胞将抗原信息递呈给CTL和Thl并诱导特异性杀伤免疫反应，发展新型的刺激DC细胞成熟的方法势在必行。
【发明内容】
[0007]为解决上述问题，本发明提出了一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，贴壁单个核细胞的制备方法，用于将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的试剂盒，利用贴壁单个核细胞制备未成熟DC细胞的方法，用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的试剂盒，利用未成熟DC细胞制备成熟DC细胞的方法，以及利用上述方法制得的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
[0008]本发明涉及一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分:
[0009]⑶14单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿。
[0010]其中，
[0011]所述的⑶14单克隆抗体为含⑶14单克隆抗体1-10 μ g / mL的包被液；
[0012]所述的⑶14单克隆抗体选自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。
[0013]本发明还涉及一种贴壁单个核细胞的制备方法，所述的方法包括如下步骤:
[0014](I)用⑶14单克隆抗体包被培养瓶皿；所述的培养瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成；
[0015](2)从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞；
[0016](3)用培养基将步骤⑵获得的单个核细胞吹打混匀，按2~5X IO6 / mL的浓度种植于步骤(1)用⑶14单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5% C02、37°C条件下孵育2-6个小时；然后吸弃上清，轻柔洗涤后即获得贴壁单个核细胞。
[0017]其中，
[0018]步骤(1)中，所述的用⑶14单克隆抗体包被培养瓶皿的方法为:将含1-10 μ g /mL的⑶14单克隆抗体的包被液,加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4°C孵育过夜；
[0019]步骤(2)中，所述的外周血为采自正常人或肿瘤患者的外周血；或者脐带血、正常人或者肿瘤患者骨髓；
[0020]步骤(3)中，所述的培养基为GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
[0021]本发明还涉及一种用于将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分:
[0022]500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U / mL IL-4 和 500 ~1000U / mL IFN- α。
[0023]本发明还涉及一种将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的方法，所述的方法包括如下步骤:[0024](I)将单个核细胞贴壁2~4小时后，吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻轻冲洗培养瓶皿壁，吸弃上清，加入原体积的培养基、500~1000U / mL GM-CSF、500~1000U / mL IL-4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自体血浆或 AB 血浆，在 5% CO2,37 °C条件下孵育培养；
[0025](2)第2~4天，补加一倍体积的培养基、500~1000U / mL GM_CSF、500~1000U / mLIL-4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自体血浆或AB血浆，在 5% C02、37°C条件下孵育培养；
[0026](3)第4~6天，贴壁细胞分化为未成熟的DC细胞；收集悬浮生长的未成熟DC细胞。
[0027]本发明还涉及一种用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分:
[0028]500 ~1000U / mL TNF-α 和 0.1 ~5ΚΕ / mL 0K-432。
[0029]本发明还涉及一种将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的方法，所述的方法包括如下步骤:
[0030](I)第I天，将未成熟DC细胞按I~2X IO6 / mL的浓度种植于培养基中，加入肿瘤细胞裂解蛋白；放至5% CO2、37°C条件下孵育培养；
[0031](2)第2~3天，往步骤(1)中的DC细胞培养基中加入500~1000U / mL TNF-α、0.1~5ΚΕ / mL 0K-432和1%~5%自体血浆或AB血浆，吹打混匀，放至5% C02、37°C条件下孵育培养24~48小时；
[0032](3)收集刺激成熟的DC细胞。
[0033]其中，所述的肿瘤细胞裂解蛋白的终浓度为50~100 μ g / mL。
[0034]利用上述方法制备得到的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0035]本发明的有益效果为:
[0036]利用本发明提供的制备贴壁单个核细胞的试剂盒和制备贴壁单个核细胞的方法能增加单个核细胞的贴壁能力，增加贴壁细胞数目，从而有利于减少杂质细胞对其转化为未成熟DC的影响；利用本发明提供的制备未成熟DC细胞的试剂盒和制备方法能够获得更多数目的未成熟DC细胞，提高其产率；利用本发明提供的制备成熟DC细胞的试剂盒和制备方法获得的成熟DC细胞，拥有更高的成熟度，更强的细胞迁移能力和IL-12p70分泌能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是本发明实施例2中，光学显微镜下显示的单个核细胞以及杂质细胞的贴壁情况；其中，图1A为采用普通贴壁法(第2组实验)的结果图像，图1B为采用CD14单克隆抗体包被培养瓶皿法(第I组实验)的结果图像；
[0038]图2是本发明实施例2中，流式细胞仪检测的贴壁的单个核细胞表面CD14表达情况；其中，图2A为采用普通贴壁法(第2组实验)的结果，图2B为采用⑶14单克隆抗体包被培养瓶皿法(第I组实验 )的结果；
[0039]图3是本发明实施例4中，流式细胞仪检测的未成熟DC细胞的数目和纯度情况；其中，图3A为采用GM-CSF和IL-4细胞因子组合(第2组实验)的结果，图3B为采用GM-CSF, IL-4和IFN- α细胞因子组合(第I组实验)的结果；
[0040]图4是本发明实施例6中，RT-PCR方法检测的成熟DC细胞迁移标志物CCR7的表达情况；其中，图中的第2组为采用TNF-α刺激组的结果，图中的第I组为采用TNF-α和0Κ-432细胞因子组合的结果；
[0041]图5是本发明实施例6中，流式细胞仪检测的成熟DC细胞的表面标志情况；其中，图5Α为采用TNF- α刺激组(第2组)的结果，图5Β为采用TNF- α和0Κ-432细胞因子组合(第I组)的结果。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明:
[0043]下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]下述实施例中涉及的试剂的浓度均为终浓度。
[0046]实施例1:贴壁单个核细胞制备
[0047](I)将含1-1Oyg / mL的⑶14单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4°C孵育过夜；其中，使用的⑶14单克隆抗体类型可为IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种；
[0048](2)第I天，无菌条件下抽取正常人或肿瘤患者50_100mL外周血或者取采血(即单采)初步分离得到的正常人或肿瘤患者的外周血单个核细胞80-100mL，转入50mL离心管中，加入等体积生理盐水稀释，获得经稀释的样品；再按经稀释的样品与淋巴细胞分离液的体积比2:1或1:1的比例，将经稀释的样品转至淋巴细胞分离液上方，慢升慢降(升I降O)，2000转/分离心20-30分钟；然后小心吸取白膜层，用生理盐水、D-Hanks液或PBS洗涤两次，即得到单个核细胞；
[0049](3)用培养基GT-T551 / AIM V / X-VIV0将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2~5X106 / mL的浓度种植于步骤(1)用⑶14单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5% CO2、37°C条件下孵育2-6个小时；然后吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻柔冲洗培养瓶皿壁3次，吸弃上清，即获得贴壁单个核细胞。
[0050]其中，本实施例采用的培养基GT-T551购自TAKARA，AIM V购自LIFE，X-VIVO购自L0NZA，⑶14单克隆抗体购自EB10SCIENCE，淋巴细胞分离液购自美国Mediatech的CELLGR0ο
[0051]IgG与聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等固相有较强的吸附能力，其连接多发生在Fe段，抗体结合点暴露于外。本发明采用CD14单克隆抗体(IgG型)包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制备的培养瓶皿，利用CD14单克隆抗体结合单个核细胞表面的CD14分子，使CD14+单个核细胞更好的吸附于培养瓶皿壁，获得的单个核细胞的贴壁能力更强，贴壁细胞的数目比常规方法更多；同时减少了杂质细胞对贴壁细胞的影响，提高了贴壁的单个核细胞向DC细胞转化的能力；且制备方法简单，费用低廉。
[0052]上述利用⑶14单克隆抗体包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的培养瓶皿所获得的CD14+单个核细胞的数目与纯度与普通贴壁法相比的优点将通过实施例2来进一步详细说明。[0053]实施例2:CD14单克隆抗体包被法能增加单个核细胞的贴壁能力，增加贴壁细胞数目，从而有利于减少杂质细胞对其转化为未成熟DC的影响
[0054](I)按照实施例1的方法制备单个核细胞细胞，分组:
[0055]第I组:将单个核细胞按2~4X IO6 / mL种植于⑶14单克隆抗体包被的聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料制成的培养瓶皿中；
[0056]第2组:将单个核细胞按2~4X IO6 / mL种植于聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料制成的培养瓶皿中；
[0057]2~4小时后吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS冲洗瓶皿壁，获得的即为贴壁的单个核细胞；
[0058](2)比较两种方法获得的⑶14+单个核细胞的数目与纯度:
[0059]使用光学显微镜观察单个核细胞以及杂质细胞的贴壁情况(如图1所示)；由图1可见，采用本发明提供的CD14单克隆抗体包被聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料制成的培养瓶皿的贴壁方法，能够获得更多的单个核细胞，同时能减少杂质细胞的数量；
[0060](3)使用胰酶将贴壁的单个核细胞从瓶皿壁上消化下来，PBS吹打混匀两次后进行⑶14-FITC标记，进行流式细胞仪检测(结果见图2);从图2可知，⑶14单克隆抗体包被法获得的CD14+单个核细胞的数目与纯度远高于普通贴壁法。
[0061]实施例3:利用GM-CSF、IL_4和IFN- α细胞因子组合对贴壁细胞进行培养
[0062](I)将利用实施例1的方法制备的单个核细胞贴壁2~4小时后，吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻`轻冲洗瓶皿壁3次，吸弃上清，加入原体积的培养基GT-T551 /AIM V / X-VIV0.500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U / mL IL_4、500 ~1000U / mLIFN-α和I~5%自体血浆或AB血浆，在5% CO2、37°C条件下孵育培养；
[0063](2)第 3 天，补加一倍体积的培养基 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U /mLGM-CSF、500 ~1000U / mL IL_4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自体血浆或 AB血浆，在5% CO2、37 °C条件下孵育培养；
[0064](3)第5天，贴壁细胞分化为未成熟的DC细胞；收集悬浮生长的未成熟DC细胞，600 X g离心洗涤，得到未成熟DC细胞。
[0065]其中，本实施例采用的IFN- α、GM-CSF和IL-4购自PEPR0TECH。
[0066]采用GM-CSF、IL_4和IFN- α细胞因子组合，能够获得更多数目的未成熟DC细胞，使其恢复抗原递呈功能。该培养方法与普通培养方法(GM-CSF和IL-4)相比的显著优势将在实施例4中得到阐明。
[0067]实施例4:采用GM-CSF、IL-4和IFN-α细胞因子组合获得的未成熟DC细胞，与GM-CSF和IL-4细胞因子组合获得的未成熟DC细胞相比，拥有更多的数目和更高的纯度
[0068](I)将按照实施例1的方法获得的贴壁细胞分为2组:
[0069]第I 组:用 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U /mLIL-4、500~1000U / mL IFN-α和I~5%自体血浆或AB血浆进行培养，细胞种植密度为 I ~2Χ IO6 / mL ；
[0070]第2 组:用 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U /mLIL-4和1%~5%自体血浆或AB血浆进行培养，细胞种植密度为I~2X106 / mL ；
[0071](2)第 3 天，第 I 组添加一次同体积的 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U /mLGM-CSF、500 ~1000U / mL IL-4,500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自体血浆或 AB血浆；第 2 组添加一次同体积的 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM-CSF,500~1000U / mL IL-4和I %~5 %自体血浆或AB血浆；
[0072](3)第5天，收集悬浮的未成熟DC细胞，细胞计数；利用⑶11C(+)LIN(_)HLA-DR(+)标记DC细胞进行流式细胞仪检测，观察细胞的数目与纯度(结果如图3所示)；可见，采用GM-CSF、IL-4和IFN- α细胞因子组合，能够获得更多数目、更高纯度的未成熟DC细胞。
[0073]实施例5:未成熟DC细胞抗原负载和刺激成熟
[0074](I)收集实施例3中所得培养瓶皿中的悬浮的未成熟DC细胞，用生理盐水、D-Hanks液或PBS洗涤细胞2~3次，按I~2 X IO6 / mL种植于培养基中；加入肿瘤细胞裂解蛋白，使其终浓度为50~100μ g / mL ;放至5% C02、37°C条件下孵育培养；
[0075](2)第6天，往步骤⑴中的DC细胞培养基中加入500~1000U / mL TNF-α、0.1~5ΚΕ / mL 0K-432和1%~5%自体血浆或AB血浆，吹打混匀，放至5% C02、37°C条件下孵育培养24~48小时；
[0076](3)收集刺激成熟的DC细胞，冻存或者进入临床应用。
[0077]其中，本实施例采用的TNF- α购自PEPR0TECH公司，0Κ-432是已经进入临床应用的一种溶血性链球菌A型S u株制剂，例如采用日本中外制药公司生产的0Κ-432或者采用国产制剂，商品名为“力尔凡”。
[0078]采用TNF- α和0Κ-432刺激DC细胞成熟，所得到的DC细胞与普通刺激方法(只采用TNF-α )相比的显著优势可见实施例6。
[0079]实施例6:采用TNF- α和0Κ-432细胞因子组合刺激成熟的DC细胞，与TNF- α刺激成熟的DC细胞相比，拥有更高的成熟度，更强的细胞迁移能力和IL-12p70分泌能力
[0080](I)收集实施例5所得的未成熟DC细胞，分成两组:
[0081]第I 组:采用 GT-T551 / AIM V / X-VIVO、1000u / mL TNF-α、0.I ~5ΚΕ / mL0K-432和I %~5 %自体血浆或AB血浆吹打混匀DC细胞，按I~2 X IO6 / mL种植于培养瓶皿中；
[0082]第2 组:采用 GT-T551 / AIM V / X-VIVO、1000u / mL TNF-α 和 I %~5% 自体血浆或AB血浆吹打混匀DC细胞，按I~2Χ IO6 / mL种植于培养瓶皿中；
[0083]两组均在5% CO2、37 °C条件下孵育培养24~48小时；
[0084](2)收集刺激成熟的DC细胞，进行流式检测，结果如图4、图5和表1所示。
[0085]由图4可见，第I组的DC细胞CCR-7的表达明显高于第2组；
[0086]由图5可见，第I组的DC细胞的细胞成熟标志物⑶40、⑶80、⑶83、⑶86均高于第2组；
[0087]由表1可见，第I组的DC细胞IL_12p70分泌量明显高于第2组；
[0088]表1
[0089]
M|IL-12p70 分泌量(ng 7 mL)
TNF- α 和 0Κ-432 (第 I 组)~10.3 + 2.4
【权利要求】
1.一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分:CD14单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿。
2.根据权利要求1所述的用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，其特征在于，所述的CD14单克隆抗体为含CD14单克隆抗体1-10 μ g / mL的包被液；所述的CD14单克隆抗体选自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。
3.—种贴壁单个核细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)用CD14单克隆抗体包被培养瓶皿；所述的培养瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成； (2)从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞； (3)用培养基将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2~5X1O6 / mL的浓度种植于步骤(1)用⑶14单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5% C02、37°C条件下孵育2-6个小时；然后吸弃上清，轻柔洗涤后即获得贴壁单个核细胞。
4.根据权利要求3所述的贴壁单个核细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的用CD14单克隆抗体包被培养瓶皿的方法为:将含1-10 μ g / mL的CD14单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4°C孵育过夜；步骤(2)中，所述的外周血为采自正常人或肿瘤患者的外周血；步骤(3)中，所述的培养基为GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
5.一种用于将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分:
500 ~1000U / mL GM-CSF、500 ~1000U / mL IL-4 和 500 ~1000U / mL IFN-α 。
6.一种将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将单个核细胞贴壁2~4小时后，吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻轻冲洗培养瓶皿壁，吸弃上清，加入原体积的培养基、500~1000U / mL GM_CSF、500~1000U /mLIL-4、500~1000U / mL IFN-α和1~5%自体血浆或AB血浆，在5% C02、37°C条件下孵育培养； (2)第2~4天，补加一倍体积的培养基、500~1000U/ mL GM_CSF、500~1000U /mL IL-4、500~1000U / mL IFN-α和1~5%自体血浆或AB血浆，在5% C02、37°C条件下孵育培养； (3)第4~6天，贴壁细胞分化为未成熟的DC细胞；收集悬浮生长的未成熟DC细胞。
7.一种用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的试剂盒，其特征在于，含有如下成分:
500 ~1000U / mLTNF-α 和 0.1 ~5KE / mL 0K-432。
8.一种将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)第I天，将未成熟DC细胞按I~2X 1O6 / mL的浓度种植于培养基中，加入肿瘤细胞裂解蛋白；放至5% CO2、37 °C条件下孵育培养； (2)第2~3天，往步骤⑴中的DC细胞培养基中加入500~1000U/ mL TNF- a、.0.1~5KE / mL 0K-432和1%~5%自体血浆或AB血浆，吹打混匀，放至5% C02、37°C条件下孵育培养24~48小时； (3)收集刺激成熟的DC细胞。
9.根据权利要求8所述的用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞裂解蛋白的终浓度为50~100 μ g / mL。
10.利用权利要求8 或9所述的方法制备得到的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。
【文档编号】A61K35/28GK103602634SQ201310579065
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】罗昀, 曾钢, 张立媛, 王敏杰 申请人:山东迪博生物技术有限公司