一株产人硒蛋白p突变体的工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株产人硒蛋白P突变体的工程菌及其应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白；（2）SEQ?ID?No.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明对人硒蛋白P突变体蛋白的生物学功能进行研究发现，该蛋白能引起肝癌细胞的凋亡，并能使肝线粒体膜通透性转运孔（PTP）开放水平提高，该蛋白对癌症的治疗有重要的应用价值。
【专利说明】—株产人砸蛋白P突变体的工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产人硒蛋白P突变体的工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002]硒(Selenium, Se)是哺乳动物必需的微量元素之一。硒有多种生理功能,缺硒会导致多种病理状态，如:肝坏死、心肌病、心血管疾病的发病危险度增高、艾滋病人的死亡率增高等，流行病学调查表明，补硒可以降低癌症的发病率。
[0003]硒是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生理功能的。硒蛋白是一类特殊的蛋白质，其特征是蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine, SeCys)的形式存在。SeCys大多位于蛋白的活性中心，对蛋白的结构和功能起重要的作用。SeCys由一个特殊的密码子一位于开放读码框(ORF)内的UGA密码子来编码(在一般蛋白质中UGA作为终止密码子起作用)，在翻译的同时掺入到正在合成的多肽链中，故现在把SeCys看作是组成蛋白质的第21种氨基酸。
[0004]迄今，在哺乳动物中已发现25种硒蛋白，包括4种谷胱甘肽过氧化物酶、3种脱碘酶、硫氧还蛋白还原酶等和其他功能未知的硒蛋白，如硒蛋白P、硒蛋白W、15kDa硒蛋白等。
[0005]硒蛋白P (Selenoprotein P，SelP)最初是在1977年Herrman在大鼠血衆中被发现，以后Burk和Tappel也证实了此蛋白，因为是在血浆中发现的硒蛋白，就以血浆英文第一字母P命名，Selenoprotein P, SelP这个名称一直被大家所接受。
[0006]硒蛋白P在血浆中含量很低，因此纯化分离很困难。经过多次失败后，1987年我国学者杨建国终于在美国Burk的实验室采用免疫亲和层析技术世界首次分离纯化了大鼠血浆硒蛋白P。以后又研究了该蛋白的部分生化特性，进一步研发和克隆了大鼠和人的硒蛋白P的基因。
[0007]硒蛋白P在组织中广泛分布。SelP在结构上与别的硒蛋白不同，一般硒蛋白仅含一个SeCys，而SelP含有至少10个SeCys (人、小鼠、大鼠有10个、牛有12个、石斑鱼有17个)。人硒蛋白P(HSelP)CDNA全长2048bp，编码381个氨基酸，含10个读码框内TGA，编码10个硒半胱氨酸，3’非翻译区保守,有两个SECIS (Selenocysteine insertion sequence),是合成HSelP必不可少的结构，可指导多个硒代半胱氨酸掺入。一般硒蛋白仅有一个SECIS，而SelP有2个SECIS，并且其指导SeCys掺入作用是所有硒蛋白中最强的。另外，硒蛋白P含有多个组氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸，组成两个组氨酸富集区，有结合肝素的特性并且可利用此区的特性进行蛋白纯化。
[0008]HSelP含有的10个SeCys，其中第一个SeCys位于N端的第40位，其余9个位于C端的1/3。HSelP在血浆中天然存在两个亚型，一种为全长的硒蛋白P，一种为硒蛋白P较短亚型，即在第2个SeCys/UGA处蛋白合成提前终止。两种亚型的N端相同，C端不同。含有多达10个SeCys的人硒蛋白P的重组表达十分困难，而SelP从血衆中的纯化步骤繁琐，收率较低，保持活性困难，因为难以获得大量的蛋白，自从70年代发现SelP以来，其特性和功能至今仍不清楚。[0009]为了能够研究这种在血浆中含硒量最多的硒蛋白，许多科学家试图采用基因重组技术表达和纯化该蛋白，都没有成功，包括美国Burk教授实验室，美国哈佛大学Berry教授曾试图用中国仓鼠卵细胞表达过硒蛋白P，也仅获得只能用放射性同位素检测到极微量的蛋白，但也不排除为内源性硒蛋白P的可能。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一株产人硒蛋白P突变体的工程菌及其应用。
[0011]本发明提供的一种蛋白，为如下(I)或(2)所示:
[0012](I)SEQ ID N0.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白；
[0013](2) SEQ ID N0.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0014]上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0015]上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种:
[0016]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1107位核苷酸所示的DNA分子；
[0017]2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0018]3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0019]含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0020]上述蛋白在制备预防和/或治疗肝癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0021]上述任一所述的编码基因在制备预防和/或治疗肝癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022]上述蛋白在制备诱导肝癌细胞凋亡的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0023]上述任一所述的编码基因在制备诱导肝癌细胞凋亡的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]上述蛋白在制备提高线粒体通透性转运孔开放水平的产品中的应用，或在制备诱导线粒体肿胀的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0025]所述线粒体具体为肝线粒体。
[0026]上述任一所述的编码基因在制备提高线粒体通透性转运孔开放水平的产品中的应用，或在制备诱导线粒体肿胀的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0027]所述线粒体具体为肝线粒体。
[0028]本发明以人硒蛋白P (Homo sapiens selenoprotein P, NM_005410)编码基因的核苷酸序列为基础，参照大肠杆菌密码子使用频率参数，突变了基因中硒代半胱氨酸的密码子TGA为半胱氨酸密码子TGT (或TGC)，获得全新的人硒蛋白P突变体基因SePm，SePm是世界首次人工合成的。
[0029]本发明进一步构建了含SePm基因的工程菌株，用于生产人硒蛋白P突变体蛋白。本发明对人硒蛋白P突变体蛋白的生物学功能进行研究发现，该蛋白能引起肝癌细胞的凋亡，并能使肝线粒体膜通透性转运孔(PTP)开放水平提高，该蛋白对癌症的治疗有重要的应用价值。【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为SePm蛋白的电泳检测。
[0031]图2为SePm基因在细胞内的表达分布。
[0032]图3为SePm对细胞形态的影响。
[0033]图4为转SePm基因细胞的DNA片段化分析。
[0034]图5为SePm对细胞生长的影响。
[0035]图6为流式细胞仪检测SePm对细胞的凋亡作用。
[0036]图7为荧光分光光度法检测SePm对肝线粒体膜通透性转运孔(PTP)的作用。【具体实施方式】[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]大肠杆菌JM109 (DE3)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MCC023。
[0040]细菌裂解液:由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为NaCl、咪唑和十二烷基肌氨酸钠；Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM，NaCl在细菌裂解液中的浓度为150mM，咪唑在细菌裂解液中的浓度为5mM，十二烷基肌氨酸钠在细菌裂解液中的浓度为0.1%(%代表质量体积百分含量，g/100ml)。
[0041]质粒pEGFP-C3购自Clontech公司，产品目录号为632498。
[0042]转染试剂FuGENETM6购自Promega公司，产品目录号为E2311。
[0043]pUCm-T载体购自生工生物(上海)工程股份有限公司，产品目录号为SK2212。
[0044]pET-30a ( + )载体购自Novagen公司，产品目录号为69909-3。
[0045]HiTrap Chelating 预装柱购自 GE Healthcare 公司。
[0046]人肝癌细胞BEL-7402购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心，产品目录号为168。
[0047]雄性Balb/c小鼠(20-25克)购自北京实验动物研究中心。
[0048]实施例1、SePm基因的合成
[0049]根据Genbank的人硒蛋白P基因序列(NM_005410序列)，将硒代半胱氨酸密码子TGA突变为半胱氨酸密码子TGT (或TGC)，结合大肠杆菌基因密码子偏爱特点(密码子使用频率)，将原人硒蛋白P基因SeP变为人硒蛋白P突变体基因SePm。通过全基因合成的方法获得人硒蛋白P突变体基因SePm。
[0050]一、人工合成如下引物:
[0051 ] RO: 5 ’ -CACCACCACCCATATGC-3，
[0052]FO1:5 ’ -GCATATGGGTGGTGGTGGTACTGAATCTCAAGATCAGAGC-3，
[0053]R17:5 ’ -CGGTTGTTTGCACAGAGAGCTCTGATCTTGAGATTCAGTAC-3，
[0054]F40:5 ’ -TCTCTGTGCAAACAACCGCCAGCATGGAGCATTCG-3，
[0055]R58:5 ’ -GCATCGGATCTTGGTCACGAATGCTCCATGCTGG-3，
[0056]F75:5 ’ -TGACCAAGATCCGATGCTGAACTCCAATGGTTCCG-3，
【权利要求】
1.一种蛋白，为如下(I)或(2)所示: (1)SEQID N0.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白； (2)SEQ ID N0.2中自N端起第4位至第368位氨基酸所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种: 1)SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1107位核苷酸所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白在制备预防和/或治疗肝癌的产品中的应用。
6.权利要求2或3所述的编码基因在制备预防和/或治疗肝癌的产品中的应用。
7.权利要求1所述的蛋白在制备诱导肝癌细胞凋亡的产品中的应用。
8.权利要求2或3所述的编码基因在制备诱导肝癌细胞凋亡的产品中的应用。
9.权利要求1所述的蛋白在制备提高线粒体通透性转运孔开放水平的产品中的应用，或在制备诱导线粒体肿胀的产品中的应用； 所述线粒体具体为肝线粒体。
10.权利要求2或3所述的编码基因在制备提高线粒体通透性转运孔开放水平的产品中的应用，或在制备诱导线粒体肿胀的产品中的应用； 所述线粒体具体为肝线粒体。
【文档编号】A61K48/00GK103641904SQ201310594051
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】张雷, 张明程, 杨建国 申请人:张雷, 张明程