西藏大花红景天提取物在制备抗肠道炎症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明是西藏大花红景天提取物在制备抗肠道炎症药物中的应用。采用水提法得到大花红景天提取物，对大花红景天提取物进行果蝇肠道炎症损伤修复实验，结果发现西藏红景天提取物具有良好的抗炎、抗氧化活性，可用于制备抗肠道炎症的药物。
【专利说明】西藏大花红景天提取物在制备抗肠道炎症药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及西藏大花红景天提取物在制备抗肠道炎症药物中的应用，涉及中药领域和果蝇天然免疫【技术领域】。
【背景技术】
[0002]肠粘膜每天接触大量的食物、细菌和病毒等不同的抗原类物质，在肠道中，宿主对病原微生物产生免疫反应，对食物抗原及其它正常的肠腔内容物产生免疫耐受等，都需肠粘膜屏障发挥作用。对抗病原微生物的肠粘膜免疫可分为先天性免疫和后天获得性免疫，其中先天性免疫构成肠粘膜屏障的基础。肠道先天性免疫是肠道重要的防御机制，是宿主抵御病原微生物和有害物质的第一道防线。
[0003]果蝇缺乏哺乳动物所具有的获得性免疫系统，即体内没有T细胞和B细胞，也没有抗体和补体系统，只能通过天然免疫系统对病原微生物的侵染做出应答。另外，果蝇和哺乳动物的肠道具有相似的结构和功能；肠道干细胞的分化机制以及天然免疫机制也十分相似。因此，可以利用果蝇作为研究哺乳动物免疫反应的模型，更重要的是可以利用其揭示与人类相关疾病的产生。当果蝇肠道受到外界环境刺激时，其肠道上皮细胞会对内部和外部因子做出应答，如产生活性氧(reactive oxygen species, R0S)和各种抗菌肽(antibacterial peptides)等来清除入侵的病原微生物,从而维持肠道内环境稳态。
[0004]大花红景天[Rhodiolacrenulata (Hook, f.et thorns.) H.0hba]为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)的多年生草本或亚灌木植物,主要分布西藏、四川和云南等西部地区。大花红景天的化学成分主要有红景天苷、大花红景天素、酪醇、红景天多糖、黄酮类化合物、酚类化合物等，其中红景天苷为其主要有效成分。研究表明红景天具有增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、防辐射、抗病毒、和保护器官免受自由基损伤等多方面药理作用。但至今为止，对西`藏大花红景天提取物抗肠道炎症方面的研究未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是揭示出西藏大花红景天提取物在制备抗肠道炎症药物中的应用。
[0006]本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
[0007]首先分别利用病原微生物Beauveria bassiana的抱子、Micrococcus Iuteus和表面活性剂SDS喂食果蝇来建立果蝇肠道免疫功能损伤模型，即诱发果蝇肠道炎症，通过比较有无添加大花红景天提取物对果蝇生存率、肠道上皮细胞死亡情况、肠道内抗菌肽的表达量、肠道上皮细胞ROS水平和肠道形态学变化等指标的影响来探究大花红景天提取物对肠道炎症损伤的修复作用。结果发现该提取物具有很好的抗炎、抗氧化、清除自由基等活性，可用于制备抗肠道炎症的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为西藏大花红景天提取物对真菌M.luteus、B.bassiana和致炎因子SDS处理后果蝇生存率的影响；
[0009]图2为西藏大花红景天提取物对SDS处理后果蝇肠道上皮细胞的影响；
[0010]图3为西藏大花红景天提取物对B.bassiana感染后肠道内抗菌肽表达量的影响；
[0011]图4为西藏大花红景天提取物对SDS处理后果蝇肠道上皮细胞内ROS水平的影响；
[0012]图5为西藏大花红景天提取物对SDS处理后肠道形态和肠道壁厚度的影响。【具体实施方式】
[0013]实施例1西藏大花红景天提取液的制备
[0014]称取西藏大花红景天干燥根20g，粉碎后于200mL去离子水中浸泡12h，小火加热煮沸3h，过滤，再加入200mL去离子水用同样的方法提取2次，合并3次提取液浓缩至200mL，即获得0.lg/ml (10%)的红景天提取液，4°C密封储存备用。高效液相色谱法测定大花红景天提取液含红景天苷不低于0.5%，符合《中国药典》2010年版(一部)的质量标准。
[0015]实施例2西藏大花红景天提取物对真菌B.bassiana、M.1uteus和致炎因子SDS处理后果蝇生存率的影响
[0016]B.bassiana孢子液的制备:将B.bassiana涂布到新鲜LB固体培养基上，25°C静置培养7d，培养基上的孢子用无菌PBS收集后过滤，测定孢子浓度。孢子离心后弃上清，在沉淀中加入5%蔗糖溶液(对照组)或含5%蔗糖的大花红景天提取液(实验组)，配制成A_=40的孢子溶液，4°C储存备用。
[0017]M.1uteus菌液的制备:M.luteus (LB培养基，37°C )接种到200mL液体培养基中过夜扩大培养，将菌液4000r/min、25°C，离心lOmin，弃上清，加入5%蔗糖溶液(对照组)或含5%蔗糖的大花红景天提取液(实验组)，配制成A600=180的菌液，4°C储存备用。
[0018]以普通培养基中培养的果蝇作为对照组，含大花红景天提取物的培养基中培养的果蝇作为实验组。随机收集羽化了 3~4d的果蝇，雌、雄各15只。先将果蝇饥饿处理2h，再移到放有5层滤纸的果蝇管中，向滤纸中加入450μ L试剂或菌液，使滤纸充分浸润，并吸除多余液体。每24h更换I次滤纸，同时记录果蝇死亡数，计算生存率，共记录6~7d，每组实验重复3次。
[0019]结果显不:对果蚬进行M.1uteus感染6d后,对照组果蚬生存率为5.6%,大花红景天组的生存率为47.6%，大花红景天组的生存率与对照组相比有显著性差异(P〈0.01)(图1A)。被B.bassiana孢子感染时,喂食大花红景天提取物的实验组生存率明显高于对照组。如图1B所示，对照组果蝇生存率为15.6%，大花红景天组的生存率为80.0%，大花红景天组的生存率与对照组相比差异极显著(P〈0.001)。成体果蝇用SDS (0.6%)处理6d后，对照组的生存率仅为3.3%，大花红景天组的生存率为59.2%，大花红景天组对照组相比有极显著性差异(P〈0.001)(图1C)。这些结果表明，大花红景天提取物能抵御病原微生物和致炎因子SDS对果蝇的损伤刺激，显著地提高果蝇的生存率。
[0020]实施例3西藏大花红景天提取物对SDS处理后果蝇肠道上皮细胞的影响
[0021]为了探索SDS处理后大花红景天提取物提高果蝇生存率的深一层机理，本实验利用7-氨基放线菌素(7-Aminoactionomycin D, 7-AAD)染色分析肠道上皮细胞的死亡情况。7-AAD作为一种核酸染料只能进入死亡细胞内与其DNA结合，激发后可产生红色荧光。
[0022]随机收集羽化了 3~4d的雌果蝇30~40只，喂食含5%蔗糖的SDS (0.6%)溶液96h。在显微镜下分离出完整的肠道，利用7-AAD染色30min，多聚甲醛固定10min，DAPI染色lOmin，甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照。每组分离的果蝇肠道约10条，实验重复3次。
[0023]结果显示:成体果蝇SDS (0.6%)处理后，对照组果蝇的中肠上皮细胞出现大量死亡，而喂食大花红景天提取物的实验组中，死亡的细胞数量明显减少(图2)。上述结果说明西藏大花红景天提取物能明显缓解SDS对肠道上皮细胞造成的损伤。
[0024]实施例4西藏大花红景天提取物对B.bassiana感染后肠道内抗菌肽表达量的影响
[0025]随机收集羽化了 3~4d的雌果蚬30~40只，喂食B.bassiana的孢子(A_=40)4h后显微镜下分离果蝇的肠道，提取肠道的总RNA，反转录成cDNA后利用半定量PCR法检测多种抗菌肽的表达。
[0026]结果显示:大花红景天组的果蚬抗菌肽Dfn (Defencin)、Drs (Drosomycin)>AttA(Attacin A)、CecAl (Cecropin A2)和 CecA2 (Cecropin A2)的基因表达量较对照组均升高，这表明西藏大花红景天提取物可提高果蝇肠道的抗菌肽表达量，增强肠道抵御病原微生物的能力(图3)。
[0027]实施例5西藏大花红景天提取物对SDS处理后果蝇肠道上皮细胞内ROS水平的影响
[0028]ROS在抗菌、消炎和抑制肿瘤等方面具有重要意义。但当机体受到疾病或某些外源性药物和毒物入侵时，机体内的抗氧化体系可能会发生紊乱，自由基代谢平衡失调。其中，ROS的过量产生会引起细胞损伤，在一定程度上，这些过度损伤的细胞将会通过凋亡机制被清除，但是，超过一定量的ROS将会通过脂质过氧化反应引起器官功能异常或组织病变。为了检测红景天提取物清除ROS的能力，本实验对果蝇进行SDS (1%)处理48h，利用二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE)染色方法分析细胞内ROS的含量。
[0029]果蝇肠道上皮细胞内ROS水平的检测步骤同7-AAD染色。
[0030]结果显示:对照组前中肠的大部分细胞和后中肠一半以上的细胞产生了大量的R0S，而喂食大花红景天提取物的实验组果蝇中，中肠上皮细胞内ROS含量明显减少(图4)。这说明西藏大花红景天提取物可以抑制肠道上皮细胞产生过量的R0S，保护机体免受氧化损伤。
[0031]实施例6西藏大花红景天提取物对SDS处理后肠道形态和肠道壁厚度的影响
[0032]随机收集羽化了 3~4d的雌果蝇30~40只，喂食含5%蔗糖的SDS (0.6%)溶液96h。在显微镜下分离出完整的肠道于PBS中，显微镜下观察并拍照。每组分离的果蝇肠道约10条，实验重复3次。
[0033]结果显示:用SDS (0.6%)处理4d后，对照组果蝇和只喂食蔗糖的正常果蝇相比，果蝇肠道长度明显缩短，而且在中肠和后肠连接处出现了明显的黑色素瘤。而喂食大花红景天提取物的实验组果蝇肠道长度是对照组的2倍，其肠道长度稍短于只喂食蔗糖的正常果蝇，并且未发现黑色素瘤(图5A，B)。另外，对SDS (0.6%)不同处理时间后果蝇肠道壁厚度变化观察发现，处理4d时，对照组和实验组的肠道壁厚度相近；处理6d时，对照组果蝇的肠道壁厚度明显变薄，而喂食大花红景天提取物的实验组果蝇肠道壁厚度没有明显变化(图5C)。 此结果进一步证明了西藏大花红景天提取物可保护肠道上皮细胞免受SDS诱导的炎症损伤，维持果蝇的肠道形态。
【权利要求】
1.一种西藏大花红景天提取物，是通过以下方法得到: 称取干燥西藏大花红景天根，粉碎后于200mL去离子水中浸泡12h，小火加热煮沸3h，过滤，再加入200mL去离子水用同样的方法提取2次，合并3次提取液浓缩至200mL。
2.权利要求1所述的西藏大花红景天提取物用于制备抗肠道炎症的药物。
3.根据权利要求2所述的西藏大花红景天提取物用途，其特征在于:所述的药物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液中的任意一种。
【文档编号】A61P1/00GK103599162SQ201310594361
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】金丽华, 朱彩霞, 关法春, 兰小中 申请人:东北林业大学, 金丽华