人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种能够大量分泌IL-12的人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，该试剂盒由单核细胞分离获取培养基、促DC诱导分化培养基、促DC成熟剂和肿瘤抗原组成。通过本发明所制备的DC，其应用主要为癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。本发明的优点是制备的DC能够分泌大量的IL-12，从而促使T细胞向Th1型免疫应答方向分化，同时具有制备工艺简单、成本低廉、易于规模化生产等优势。
【专利说明】人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，特别涉及一种能够大量分泌IL-12的树突状细胞疫苗的专用试剂盒。
【背景技术】
[0002]树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),最大特点是能够刺激初始型T细胞(naiVe T cell)活化和增值，是特异性免疫应答的使动者。因此，DC在肿瘤免疫细胞治疗中有着广泛的应用前景。然而，DC在人外周血中的比例非常低，而且肿瘤患者体内DC的功能大多处于抑制状态。因此，如何获得足够数量并具有诱导T细胞向Thl型免疫应答方向分化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)的DC,贝U成为临床应用的关键。
[0003]目前，DC常规的扩增方案很多，如经典的GM-CSF、IL_4诱导DC分化，然后用TNF-a或者组合细胞因子IL-1 ^、IL-6、TNF- a、PGE-2等，或者联合聚肌胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly-1:C)、细菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide,LPS)等促进其成熟，然而上述促DC成熟剂仅能使成熟DC低水平分泌IL-12，而IL-12是DC促进T细胞向Thl型免疫应答方向分化的关键分子。因此，如何诱导DC成熟并分泌高水平的IL-12，对免疫细胞实施 杀伤肿瘤细胞则起到核心作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种制备能够大量分泌IL-12的人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒。
[0005]本发明所提供的一种能够大量分泌IL-12的人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒由单核细胞分离获取培养基、促DC诱导分化培养基、促DC成熟剂和肿瘤抗原组成。
[0006]作为优选，所述单核细胞分离获取培养基为PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-MEM?培养基、RPM1-1640培养基中的任意一种。
[0007]作为优选，所述促DC诱导分化培养基的溶剂为X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基中任意一种，溶质为GM-CSF和IL-4，其中GM-CSF的浓度是800-1000IU / ml，IL-4的浓度是 800-1000IU / ml。
[0008]作为优选，所述促DC成熟剂的溶剂为X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基中任意一种，溶质为 IL-1^、IL-6、TNF-a，或者 IL-1^、IL_6、TNF_a 与 IFN-Y、Mtb-Hag 中的一种或者两种，该促DC成熟剂加入到培养体系后，IL-1 P终浓度为8-15ng / mL, IL-6终浓度为 50-150ng / mL, TNF-a 终浓度为 8_15ng / mL, Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 y g /ml, IFN-y 终浓度为 100 ~1000IU / ml。
[0009]作为优选，所述肿瘤抗原为下述抗原中的一种或多种:⑶19、⑶20、WT-1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGEA3、p53、NY-ESO-U PSMA, GD2、CEA>MeIanA / MARTKRas mutantsgp 100>p53mutant>Proteinase3>bcr-abl>Tyrosinase>Survivin, PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP, AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK,Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GMl>Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn,该抗原加入培养体系后浓度是I~20 μ g / ml ο
[0010]作为优选，所述单核细胞分离获取培养基、促DC诱导分化培养基、促DC诱导成熟培养基的PH是7.2~7.4。
[0011]本发明的另一个目的是提供一种培养人树突状细胞疫苗的方法。
[0012]该方法为按照专属试剂盒说明书操作要求并补加10%自体血浆的条件下，能高表达⑶80、⑶86、HLA-DR，低表达⑶83，同时能够分泌大量的IL-12的人树突状细胞疫苗的制备。
[0013]本发明的人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒选择性强，可以从人单核细胞中诱导出能够大量分泌IL-12的DC疫苗。用该人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒获得的人DC疫苗能够直接配合传统的手术、化疗和放疗等治疗方式，或者在体外诱导特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)进行体内回输,可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，进行清除少量残留或扩散的肿瘤细胞，以提高、巩固肿瘤治疗效果，减少复发、提高生活质量的目的；或者对癌症高危人群进行直接回输达到预防的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]1.图1流式细胞术检测不同组合DC促成熟剂诱导DC成熟第7天成熟度检测(n=8);第一列至第四列分别代表DC表面分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR，第一行至第四行分别代表 IL-1 β、IL-6、TNF-a、PGE2，IL-1 β、IL_6、TNF_a , IFN-y ,IL-1 β、IL_6、TNF_a、Mtb-HAg 和 IL-1 β、IL-6、TNF- a、IFN- y、Mtb-HAg 等不同组合 DC 促成熟剂。
`[0015]2.图2不同组合DC促成熟剂对DC产生IL-12的影响(n=8) ；IFN- Y和Mtb-HAg对DC产生IL-12均有促进作用，特别是两者与IL-1 β、IL-6和TNF- a进行组合诱导促进DC分泌IL-12的量不低于IL-1 β、IL-6、TNF- a和PGE2组合诱导的1000倍。
【具体实施方式】
[0016]下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0017]实施例1
[0018]第一步:从分离获得的PBMCs中进一步分离并获取单核细胞。包括以下步骤:
[0019]1.采集患者外周静脉血50ml，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞。
[0020]2.将上述分离的PBMCs重悬于单核细胞分离获取培养基内，调整细胞密度为(5~10) X IO6 / ml，总体积为IOml加入T75ml的细胞培养瓶内，于37°C>5% C02和饱和湿度的培养箱内贴壁2h。[0021]3.轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮；然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，则留下的贴壁细胞即为单核细胞。
[0022]第二步:诱导单核细胞向DC分化。包括以下步骤:
[0023]1.将添加有10%自体血浆的促DC诱导分化培养基20ml加入上述T75的培养瓶内，然后置于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内培养。
[0024]2.第三天(72h)后吸弃IOml培养瓶内的培养基，并补加IOml新鲜的含有10%自体血浆的促DC诱导分化培养基；同时添加肿瘤抗原，使其终浓度为IOyg / ml。
[0025]第三步:诱导已向DC分化的单核细胞成为成熟的DC，并进行成熟度和IL-12分泌量的检测。包括以下步骤:
[0026]1.在细胞培养的第五天，加入促DC成熟剂。
[0027]2.细胞培养的第6~7天，分别通过流式细胞术和ELISA进行DC的成熟度和IL-12分泌量检测。
[0028]本发明相对原有培养基培养出的DC成熟度不高和IL-12分泌不足的情况下，其成熟度和IL-12的分泌均较高。 参见图1和图2。
【权利要求】
1.一种人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于包括: (1)单核细胞分离获取培养基； (2)促DC诱导分化培养基； (3)促DC成熟剂； (4)肿瘤抗原。
2.根据权利要求1所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述单核细胞分离获取培养基为PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opti_MEM?培养基、RPM1-1640培养基中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述促DC诱导分化培养基的溶剂为X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基中任意一种，溶质为 GM-CSF 和 IL-4，其中 GM-CSF 的浓度是 800-1000IU / ml，IL-4 的浓度是 800-1000IU /ml o
4.根据权利要求3所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述促DC成熟剂的溶剂为X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基中任意一种，溶质为IL-1 ^、IL-6、TNF-a，或者IL-1P、IL_6、TNF-a与IFN-y ,Mtb-Hag中的一种或者两种，该促DC成熟剂加入到培养体系后，IL-1 P终浓度为8-15ng / mL，IL-6终浓度为50-150ng / mL，TNF_a终浓度为 8-15ng / mL，Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 y g / ml, IFN- y 终浓度为 100 ~1000IU /ml。
5.根据权利要求1或2或4所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述肿瘤抗原为下述抗原中的一种或多种:CD19、CD20、WT-l、MUCl、LMP2、HPVE6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA, MelanA / MART1、Rasmutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl、Tyrosinase、Surviving PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、Fucosyl GMl、Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn，该抗原加入培养体系后浓度是 I ~20 y g /ml o
6.根据权利要求3所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述肿瘤抗原为下述抗原中的一种或多种:CD19、CD20、WT-1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA, MelanA / MART1、Rasmutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl> Tyrosinase、Surviving PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC, TRP-2、⑶3、Fucosyl GMU Mesothelin、PSCA、MAGEAUsLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn，该抗原加入培养体系后浓度是 I ~20 y g /ml o
7.根据权利要求1或2所述人树突状细胞疫苗制备的专用试剂盒，其特征在于，所述单核细胞分离获取培养基、促DC诱导分化培养基、促DC诱导成熟培养基的PH是7.2~7.4。
8.根据权利要求1-7任一项所述专用试剂盒培养人树突状细胞疫苗的方法，其特征在于:所述专用试剂盒需要与10%的自体血浆配合使用，能高表达⑶80、⑶86、HLA-DR，低表达⑶83，同时能够分泌大量的IL-12的人树突状细胞疫苗。
【文档编号】A61K39/00GK103638517SQ201310638797
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】马飞, 黄浩, 申珊珊 申请人:深圳市合一康生物科技有限公司