一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法

一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂及其制备方法。本发明的疫苗制剂免疫原性强，活性高，能够有效刺激机体产生高效的保护性免疫应答和良好的免疫保护作用，从而抵御金黄色葡萄球菌感染。本发明的制备方法保证了疫苗抗原四种组分的吸附均一性和稳定性，提高了生产效率，降低了生产成本。
【专利说明】一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA),以下简称金葡菌,有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20%。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
[0003]随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自 1961 年首次被发现以来，已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院内感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，又被称为“第一超级细菌”。
[0004]据美国⑶C报道，美国平均每年MRSA严重感染人数约为9万人，致死病例约为2万人。中国2011年全国细菌耐药监测报告显示:临床MRSA检出率平均为60%，广泛耐药率超过40%。当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解决的感染性疾病，并位居首位。万古霉素是目前治疗MRSA感染的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的MRSA菌株相继出现，并在全球呈蔓延趋势，使MRSA感染面临“无药可治”的严峻挑战。
[0005]针对耐药金葡菌感染的严峻挑战，WHO于2011年提出“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”，并强调未来重点支持创新性疫苗等免疫防控制品的研发。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感`染具有重要的战略及现实意义。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种新的金黄色葡萄球菌疫苗制剂，用于预防和治疗金黄色葡萄球菌感染及因此引发的脓毒血症等相关感染性疾病。
[0007]在第一个方面，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白的序列选自SEQID N0.1~4任一条序列ο
[0008]优选地，所述疫苗制剂还包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种。
[0009]在另一方面，本发明提供一种制备发明的疫苗制剂的方法，包括:将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附。
[0010]本发明的疫苗制剂免疫原性强，活性高，能够有效刺激机体产生高效的保护性免疫应答和良好的免疫保护作用，从而抵御金黄色葡萄球菌感染。本发明的制备方法保证了疫苗抗原四种组分的吸附均一性和稳定性，提高了生产效率，降低了生产成本。【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1、为实施例4中SDS-PAGE结果；Μ:蛋白质分子量标准；1:为实施例4中所配制不含憐酸招佐剂的冋浓度蛋白原液样品；2:为实施例1成品尚心沉淀解尚后取样样品；3:为实施例1成品离心后上清取样样品；4:为实施例2成品离心沉淀解离后取样样品；5:为实施例2成品离心后上清取样样品；6:为实施例3成品离心沉淀解离后取样样品；7:为实施例3成品离心后上清取样样品。
[0012]图2、为实施例6中SDS-PAGE结果；Μ:蛋白质分子量标准；I:80 μ gHI蛋白样品；2:120 μ g HI蛋白样品；3:160 μ g HI蛋白样品；4:SpA5 (KKAA)不含佐剂样品；5:80 μ gSpA5 (KKAA)样品；6:120 μ g SpA5 (KKAA)样品；7:160 μ g SpA5 (KKAA)样品。
[0013]图3、为实施例6中SDS-PAGE结果；M:蛋白质分子量标准；1:mSEB蛋白不含佐剂样品；2:80yg mSEB蛋白样品；3:80μ g mSEB蛋白样品；4:160μ g mSEB蛋白样品；5 =MntC蛋白不含佐剂样品；6:80μ g MntC蛋白样品；7:120 μ g MntC蛋白样品；8:160 μ gMntC蛋白样品。
[0014]图4、为实施例7中SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1:随机取样1_离心上清取样样品；2:随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3:随机取样2-离心上清取样样品；4:随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5:随机取样3-离心上清取样样品；6:随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
[0015]图5、为实施例7中SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1:随机取样4_离心上清取样样品；2:随机取样4-离心沉淀解离后取样样品；3:随机取样5-离心上清取样样品；4:随机取样5-离心沉淀解离后取样样品；5:随机取样6-离心上清取样样品；6:随机取样6-离心沉淀解离后取样样品。
[0016]图6、为实施例9中·SDS-PAGE结果；1:HI蛋白吸附0.5小时后离心上清取样；2:HI蛋白吸附I小时后离心上清取样；3:HI蛋白吸附2小时后离心上清取样；4:HI蛋白吸附4小时后离心上清取样品；5:HI蛋白吸附8小时后离心上清取样；6:SpA5 (KKAA)吸附0.5小时后离心上清取样；7:SpA5 (KKAA)吸附I小时后离心上清取样；8:SpA5 (KKAA)吸附2小时后离心上清取样；9:SpA5 (KKAA)吸附4小时后离心上清取样品；10:SpA5 (KKAA)吸附8小时后离心上清取样。
[0017]图7、为实施例9中SDS-PAGE结果；1:MntC蛋白吸附I小时后离心上清取样；2:MntC蛋白吸附2小时后离心上清取样；3:MntC蛋白吸附4小时后离心上清取样品；4 =MntC蛋白吸附8小时后离心上清取样；5:mSEB蛋白吸附I小时后离心上清取样；6:mSEB蛋白吸附2小时后离心上清取样；7:mSEB蛋白吸附4小时后离心上清取样品；8:mSEB蛋白吸附8小时后离心上清取样。
[0018]图8、为实施例10中保存4周后SDS-PAGE结果；M:蛋白质分子量标准；1随机取样1-离心上清取样样品；2:随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3:随机取样2-离心上清取样样品；4:随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5:随机取样3-离心上清取样样品；6:随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
[0019]图9、为实施例10中保存8周后SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1:随机取样1-离心上清取样样品；2:随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3:随机取样2-离心上清取样样品；4:随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5:随机取样3-离心上清取样样品；6:随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
[0020]图10、为实施例10中保存12周后SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1:随机取样1-离心上清取样样品；2:随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3:随机取样2-离心上清取样样品；4:随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5:随机取样3-离心上清取样样品；6:随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
[0021]图11、实施例13的不同时间点各组雄性动物体重变化趋势。
[0022]图12、实施例13的不同时间点各组雌性动物体重变化趋势。
【具体实施方式】
[0023]在第一个方面,本发明提供一种疫苗制剂。
[0024]在一种实施方式中，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白；在另一种实施方式中，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白以及MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种。
[0025]优选地,所述SpA5蛋白序列选自SEQ ID N0.1~4任一条序列，即，SpA5蛋白可以是 SpA5 (KKAA)、SpA5 (RRAA)、SpA5 (KKVV)或 SpA5 (RRVV) ；MntC 蛋白序列如 SEQ ID N0.5所示；mSEB蛋白序列如SEQ ID N0.6所示；HI蛋白序列如SEQ ID N0.7所示。进一步优选地，本发明的疫苗制剂中，SpA5蛋白是SpA5 (KKAA)或SpA5 (RRVV)。
[0026]在一种优选的实施方式中，本发明的疫苗制剂中抗原由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白组成。各抗原的浓度范围是10-100 μ g/ml。优选地，各抗原的浓度是50μ g/ml。
[0027]优选地，所述疫苗制剂中还包括佐剂，如铝佐剂(磷酸铝或氢氧化铝)。根据现有技术，本领域技术人员容易判断需要哪些试剂来制备疫苗制剂。
`[0028]上述疫苗制剂为本发明人通过反向疫苗学技术、高通量免疫优势抗原组学技术、高效可溶蛋白表达及纯化技术及大量的动物免疫保护评价实验，从金黄色葡萄球菌全基因组2742个开放阅读框(ORFs)中筛选并鉴定出抗原性强、特异性保守性好、且具有良好保护作用的多个抗原分子。它们包括:α -溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(IsdB)、金葡菌蛋白A (SpA)、肠毒素B (SEB)、锰离子结合蛋白C (MntC)0这些抗原在金黄色葡萄球菌感染致病、免疫逃逸的关键环节均发挥着重要作用。本发明人在对上述抗原的结构分析、分子融合设计、多组分选择、制剂配伍优化基础上，成功制备了含有上述抗原的重组金黄色葡萄球菌疫苗及其组合物。该疫苗在阻断金黄色葡萄球菌生存代谢途径、抑制粘附定植、控制毒素扩散、打破免疫逃逸等方面发挥着重要作用，从而有效的抵御了金黄色葡萄球菌的感染侵袭。
[0029]本发明的疫苗抗原组分复杂，抗原蛋白性质各异，直接使用单一抗原蛋白进行单组分疫苗制剂制备的难度较大，方法繁琐，免疫效果不佳，不利于疫苗的产业化制备。同时铝佐剂对不同抗原蛋白的吸附率良莠不齐，吸附均一性存在差异，从而导致疫苗接种剂量偏高，而免疫保护效果不好的现象；并且铝佐剂在制备过程中易发生理化性质的改变，从而导致疫苗制剂的免疫无效。
[0030]主要问题包含如下几个方面:①现有技术对于抗原与铝元素配比选择评价指标不统一，为追求达到较高的吸附率使用很高的铝元素量，这不利于受用者健康，并与WHO及《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》的相关要求不符，更不符合制药领域的发展趋势；②现有的制剂成分添加顺序为将抗原蛋白和佐剂分开稀释后吸附，再混合分装，对于单一抗原尚可，但制剂难度和成本会随着抗原组分数量的增加而上升；③为解决前述问题，有的方法提出将佐剂稀释后直接加入抗原，但是却无法保证多种抗原情况下的吸附均一性制剂领域缺乏科学严谨的制剂评价体系，现有的技术只针对佐剂的制备方法，而轻视制剂工艺，对于制剂工艺的评估指标仅关注吸附率，更对吸附的方式、吸附效率、吸附均一性及其检测方法、制剂工艺各种参数稳定性等方面完全忽视；⑤现有的组氨酸溶液，虽然对于组氨酸的浓度、PH等参数进行了研究，但是对于不同特性蛋白适用范围存在局限性，有的疫苗制剂工艺虽然加入了吐温等增溶剂，但是由于存在安全隐患等问题，美国FDA批准药物中，吐温的使用已不如以前普遍，而对于新增溶剂的选择却迟迟未见报道；⑥传统制剂工艺采用水平吸附混合的方式，缺乏对疫苗吸附新技术和新设备的创新和开发。
[0031]因此，当前有必要对现有的制备疫苗制剂的相关工艺进行改进和创新，能够有效解决上述抗原蛋白吸附率、多组分抗原吸附均一性、稳定性、吸附方式合理有效性等疫苗制备中的关键工艺瓶颈，使得疫苗制剂(尤其是多组分疫苗制剂)的制备工艺更加简便、稳定及高效，并有利于降低生产成本。
[0032]因此，在另一方面，本发明提供一种制备多组分疫苗的方法，所述方法将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附，具体为: [0033]方法1:将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的用疫苗稀释液稀释后的铝佐剂溶液混合，分别吸附后再将多种蛋白溶液混合均匀后分装；
[0034]①根据铝佐剂溶液铝元素浓度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中铝元素终浓度(0.71mg/ml)，计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
[0035]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，准确量取所需单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的12.5%，充分混匀；
[0036]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C _37°C范围内。
[0037]④吸附后再将四种组分蛋白溶液混合均匀即得。
[0038]方法2:将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，再将多种蛋白溶液混合后共同吸附后分装；
[0039]①根据铝佐剂溶液铝元素浓度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中铝元素终浓度(0.71mg/ml)，计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
[0040]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，准确量取所需单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的12.5%，充分混匀；
[0041]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，再将四种组分蛋白溶液混合，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C _37°C范围内。
[0042]方法3:将多种疫苗抗原蛋白组分混合后使用疫苗稀释液稀释，混匀后与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，吸附后分装；
[0043]①根据铝佐剂溶液铝元素浓度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中铝元素终浓度(0.71mg/ml)，计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
[0044]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，量取所需四种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
[0045]③将等体积的稀释后蛋白溶液与稀释后的佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C -37°C范围内。
[0046]优选地，所述垂直混悬方式可以用水平混悬方式替代。
[0047]优选地，稀释后铝佐剂溶液与稀释后疫苗抗原蛋白溶液的添加比例为1:1。
[0048]优选地，所述铝佐剂是磷酸铝或氢氧化铝佐剂。
[0049]优选地,所述抗原蛋白与招元素质量比为1: 1.98,吸附率即可达到90%~100%。
[0050]优选地，使用的疫苗稀释液为组氨酸缓冲液，包括组氨酸(优选浓度10mmol/L)、泊洛沙姆188 (优选0.02%)、氯化钠(优选浓度0.9%)，pH值优选为6.0。
[0051 ] 本发明方法制备的·疫苗制剂在4°C至37°C范围内，稳定性在8周以上。
[0052]本发明提供的方法的功效包括:
[0053]①针对现有制剂评价体系的缺乏和不完善，本发明对已有验证指标进行了科学的优化，除传统的吸附率外，还提出了质量配伍比、吸附效率、稳定性、均一性及其检测方式等指标，以及前述各项参数的稳定性，创新性的确立了以吸附率、吸附效率、质量配伍比、均一性、稳定性为主要指标的一整套制剂工艺评价体系，能够科学、准确、快速的评估制剂工艺的效果(注:吸附效率指达到目的吸附率、均一性等指标所用的最短时间);
[0054]②本发明采用质量配伍比，可准确科学的描述吸附效率和铝元素用量，本发明在吸附率达到90%~100%情况下，抗原与铝元素质量比为1:1.98，远低于现有报道的1:45，这意味着吸附相同量的蛋白，使用铝元素量越低，有效的减少了铝元素的使用量，有利受用者健康，更符合WHO及《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》的相关要求；
[0055]③本发明采用的独特制剂工艺步骤，可有效降低实施多种抗原组分疫苗制剂制备的难度和成本；
[0056]④本发明采用的特有制剂工艺，可保证制剂的均一性及稳定性；
[0057]⑤对于疫苗稀释液，本发明优化了组氨酸缓冲体系及各种参数，并优选的加入了泊洛沙姆188作为助溶剂，增加了疫苗稀释液的适用范围的同时降低了副作用风险；
[0058]⑥对于现有的制剂方式和设备，本发明独创性的提出了垂直混悬的吸附方式和相应的垂直混悬设备，该设备已成功申请国家实用新型发明(授权专利号201220314436.4)。
[0059]综上所述，本发明通过各种改进和创新，将现有的制剂工艺进行优化及改进，减少了工艺流程，降低了工艺成本，提高了生产效率。通过研究制剂成分的工艺步骤、创新吸附工艺方式、以及调整疫苗稀释液组成配方等方式，提高了抗原蛋白吸附率和配伍比，有效保证了疫苗抗原蛋白各组分的吸附均一性，并防止铝佐剂在制剂过程中发生理化性质改变，降低铝元素使用量，提高生产效率，降低了生产成本。完善了现有工艺评价指标，使用了新的评价指标和相应检测方法，创新性的提出了一整套科学严谨的制剂评价体系，填补了制剂领域的一项重大空缺。
[0060]以下实施例中所使用的抗原蛋白与各种试剂如下:
[0061]1.抗原蛋白
[0062]重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白由重庆原伦生物科技有限公司、中国人民解放军第三军医大学提供；抗原蛋白包括本发明的SpA5 (KKAA)、H1、mSEB和MntC四种。
[0063]2.试剂
[0064]SDS-PAGE, HPLC等所需试剂和仪器由重庆原伦生物科技有限公司提供；
[0065]疫苗蛋白稀释液:组氨酸(美国Merck公司，药用级)IOmM, NaCl0.9% (四川科伦，注射用生理盐水)、泊洛沙姆188 (美国Merck公司，药用级)0.01%、pH6.0，无热原；
[0066]PBS:磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g (国产分析纯)，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)2.9g(国产分析纯)，氯化钠(NaCl) 8.0g(国产分析纯)，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4 ；
[0067]磷酸铝佐剂(铝元素浓度5.3mg/ml)为美国GENERAL CHEMICAL公司原装进口产品O
[0068]3.仪器
[0069]疫苗制剂使用的大型垂直混悬仪为自主知识产权，委托上海格氏公司生产。
[0070]4.菌株`
[0071]金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；
[0072]实施例1:配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗(1920ml)
[0073]①量取磷酸招佐剂256ml,将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液704ml,加入配制瓶中，总体积为960ml,充分混匀；
[0074]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，因此，根据各抗原蛋白的初始浓度量取各蛋白:HI蛋白96ml，加入疫苗稀释液144ml ；SpA5 (KKAA)蛋白48ml，加入疫苗稀释液192ml ；mSEB蛋白60ml，加入疫苗稀释液180ml ；MntC蛋白60ml，加入疫苗稀释液180ml ;分别将各蛋白及其对应的疫苗稀释液加入到各自的配制瓶中，充分混匀；
[0075]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C _37°C范围内；
[0076]④吸附后再将四种蛋白溶液混合均匀后作为疫苗制剂。
[0077]实施例2:配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗(1200ml)
[0078]①量取磷酸招佐剂160ml,将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液440ml,加入至配制瓶中，总体积为600ml，充分混匀；
[0079]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml ;根据该要求计算所需蛋白质体积并量取对应的蛋白溶液:HI蛋白60ml，加入疫苗稀释液90ml ；SpA5 (KKAA)蛋白30ml，加入疫苗稀释液120ml ；mSEB蛋白37.5ml，加入疫苗稀释液112.5ml ；MntC蛋白37.5ml，加入疫苗稀释液112.5ml ;将各蛋白及对应体积的稀释液分别加入到各自的配制瓶中，充分混匀；[0080]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，再将四种蛋白溶液混合，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C _37°C范围内。
[0081]实施例3:配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗(600ml)
[0082]①量取磷酸招佐剂80ml,将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液220ml,加入至配制瓶中，总体积300ml，充分混匀；
[0083]②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据各蛋白的初始浓度计算所需各蛋白量:HI蛋白所用体积为30ml，SpA5(KKAA)蛋白所用体积为15ml，mSEB蛋白所用体积为18.75ml,MntC蛋白所用体积为18.75ml ;量取对应体积的四种蛋白加入到配制瓶中，再量取疫苗稀释液217.5ml加入至配制瓶中，总体积300ml,充分混匀；
[0084]③将等体积的稀释后蛋白溶液与稀释后的佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C -37°C范围内。
[0085]实施例4 =SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全性
[0086]①分别从实施例1-3的疫苗制剂中取样lml，4°C，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清,并从上清取样40 μ I ;
[0087]②补入与上清 等体积的解离液(1Μ Na2CO3)至离心沉淀物中，重悬后于室温条件下，垂直混悬I小时，取样40 μ I ;
[0088]③按照实施例3中配制方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40 μ I ;
[0089]④向所取样品加入10 μ 15Χ蛋白上样缓冲液，100°C加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10 μ I上样；
[0090]⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图1，结果显示:三种方法磷酸铝佐剂均能充分吸附蛋白，且吸附效果无显著差异，但是方法二、三制剂工艺步骤均较方法一简化，而如果多种抗原成分按照方法一进行制剂，每个抗原成分均需要吸附、混合仪器各一套，且不能共用，所需要的仪器设备是方法二、三的数倍。
[0091]实施例5:重组金黄色葡萄球菌疫苗质量配伍比的研究
[0092]①量取磷酸铝佐剂溶液720 μ I (铝元素浓度为5.3mg/ml)，将其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀释液6.48ml，充分混匀，等体积均分为12等分，每份600 μ 1，含磷酸铝60 μ 1，招元素318μ g ；
[0093]②依据每个抗原蛋白使用剂量递增原则，分为80 μ g、120 μ g、160 μ g三组，4个抗原蛋白共计12组，根据每个蛋白浓度计算所需体积，以此加入对应容器中，再以疫苗稀释液定容至600 μ I ；
[0094]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附I小时，环境温度控制在4°C _37°C范围内。
[0095]实施例6 =SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗质量配伍比[0096]①将实施例5中12个样品，4°C，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从各上清取样40 μ I ;[0097]②按照实施例20中配制方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40 μ I ;
[0098]③将所取样品加入10 μ 15Χ蛋白上样缓冲液，100°C加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10 μ I上样；
[0099]④进行12%SDS_PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图2、3，结果显示:对于蛋白H1、SpA5 (KKAA)和MntC，318y g铝元素即可100%吸附160 μ g蛋白，而100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1:1.9875 ;对于mSEB蛋白，318 μ g铝元可100%吸附80 μ g蛋白，90%吸附160 μ g, 100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1:3.975,90%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1:1.9875。故而可以认为对于重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，90~100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1:
1.9875。
[0100]同时需要指出的是，如果对配伍比不加限定，仅仅描述体积，而忽略质量的话，蛋白铝元素配伍比将会更低，甚至达到1:1以下。
[0101]实施例7 =SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗均一性
[0102]①将实施例3中吸附混匀完毕后的溶液中随机取样6个，取样位置和时间完全随机，每个样品取样Iml ；
[0103]②4°C，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40 μ I ;
[0104]③补入与上清等体积的解离液至离心沉淀物中，重悬后室温条件下，垂直混悬I小时，取样40μ I ；
[0105]④将所取样品加入10μ 15Χ蛋白上样缓冲液，100°C加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10 μ I上样；
[0106]⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图4、5，结果显示:所取样品的离心上清中均未见条带，离心沉淀解离后，条带位置、灰度、面积均相同，说明每个随机取样点佐剂所吸附的抗原蛋白量和种类完全相同，即为制剂工艺吸附均一性完全一致。
[0107]实施例8:重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白制剂吸附率与吸附效率
[0108]①量取磷酸铝佐剂溶液1.2ml (铝元素浓度为5.3mg/ml )，将其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀释液10.8ml，充分混匀，等体积均分为20等份，每份600 μ 1，含磷酸铝60 μ 1，招元素318μ g ；
[0109]②依据每个抗原蛋白吸附时间倍增的原则，分为0.5小时、I小时、2小时、4小时、8小时，共20组，根据每个蛋白浓度计算所需体积，以此加入对应容器中，再以疫苗稀释液定容至600 μ I ；
[0110]③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附至设定时间后停止吸附并处理样品，环境温度控制在4°C -37°C范围内。[0111]实施例9 =SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗制剂吸附率与吸附效率
[0112]①将实施例8中20个样品，4°C，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从各上清取样40 μ I ;
[0113]②将所取样品加入10 μ 15Χ蛋白上样缓冲液，100°C加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10 μ I上样；
[0114]③进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图6、7，结果显示:对于重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，吸附2小时即可达到100%吸附率,吸附I小时可达到90%以上的吸附率,故而重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白90~100%吸附率的吸附效率为I小时。
[0115]实施例10 =SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗稳定性
[0116]①将实施例3中吸附混匀完毕后的溶液按Iml每只进行分装，灌装至无菌2ml西林瓶中压盖密封后37°C保存；
[0117]②每4周随机取样3只，样品4°C，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40 μ I ;
[0118]③补入与上清等体积的疫苗解离液至离心沉淀物中，重悬后室温条件下，垂直混悬I小时，取样40 μ I ；
[0119]④将所取样品加入10 μ 15Χ蛋白上样缓冲液，100°C加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10 μ I上样；
[0120]⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳20分钟，再调至180V电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图8、9、10，结果显示:所取样品的离心上清中均未见条带，离心沉淀解离后，条带位置、灰度、面积均相同，说明每个随机取样点佐剂所吸附的抗原蛋白量和种类完全相同，除了再次证明了制剂的均一性外，还揭示了制剂的稳定性，包括吸附率的稳定性、均一性的稳定性、抗原蛋白的稳定性。
[0121]经试验结果验证，37°C的加速温度条件下，本发明的制剂稳定性至少可维持12周不变，再次证明了本制剂工艺的有效性和稳定性。
[0122]实施例11:不同组分疫苗的免疫效价和攻毒保护
[0123]选择SpA5 (KKAA)作为候选抗原，与H1、MntC、mSEB进行单价、双价、三价及四价组合，制备成多组分疫苗，对小鼠进行进一步的动物免疫后抗体效价评估。取血清作ELISA检测，结果见表1。
[0124]然后进行攻毒保护实验(免疫及攻毒保护同实施例12)，从V34到V39进行六轮实验，每组6周龄Balb/C小鼠(北京华阜康)20只。肌注免疫，蛋白量为每种组分30 μ g。攻毒试验的过程为:将各疫苗分别三次股四头肌肌注(0、14、21天)免疫；末次免疫后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射金黄色葡萄球菌MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25X IO9CFU,观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果见表2。
[0125]表1:ELISA检测不同组分中各种蛋白免疫小鼠后抗体滴度
[0126]
【权利要求】
1.一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂，包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白序列选自SEQ IDN0.1~4中任一条。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中还包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种，所述MntC蛋白序列如SEQ ID N0.5所示，mSEB蛋白序列如SEQ ID N0.6所示，HI蛋白序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根据权利要求2所述的疫苗制剂，其中，疫苗制剂的抗原成分由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白组成；各抗原的浓度范围是10-100 μ g/ml ;优选地，各抗原的浓度是50μ g/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗制剂，还包括铝佐剂；优选地，所述铝佐剂是磷酸招佐剂或氢氧化招佐剂。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的疫苗制剂的方法，所述方法将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附，具体为: (1)将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的用疫苗稀释液稀释后的铝佐剂溶液混合，分别吸附后再将多种蛋白溶液混合均匀后分装； (2)将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，再将多种蛋白溶液混合后共同吸附后分装；或者 (3)将多种疫苗抗原蛋白组分混合后使用疫苗稀释液稀释，混匀后与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，吸附后分装。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述铝佐剂是磷酸铝或氢氧化铝佐剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，抗原蛋白与铝元素质量比为1:1.98。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述吸附方式为垂直混悬吸附或水平混悬吸附；混悬时间为I小时，温度为4°C -37°C。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中，所述疫苗稀释液为组氨酸缓冲液，包括组氨酸、泊洛沙姆188、氯化钠，pH值为6.0。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述疫苗稀释液为:10mmol/L组氨酸、0.02%泊洛沙姆188、0.9%氯化钠，pH值为6.0。
【文档编号】A61K39/39GK103705914SQ201310665062
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】邹全明, 曾浩, 樊绍文, 卢陆, 董衍东, 敬海明, 冯强, 章金勇 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学