止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞el4细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用及止眩安神片的制备方法。本发明的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得淫羊藿苷含量有很大提高。
【专利说明】止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的
应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用及止眩安神片的制备方法。
【背景技术】 [0002]止眩安神颗粒标准号WS-11411 (ZD-1411)_2002，记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸率仁140g、制半夏120g、泽湾120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成,具有补肝肾，益气血，安心神的功效。用于肝肾不足，气血亏损所致的眩晕，耳鸣，失眠，心悸。
[0003]现有技术中，尚未有止眩安神颗粒在在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有止眩安神颗粒提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而挥发油提取，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的目的在于提供一种止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种止眩安神片的制备方法。
[0006]本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007]止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成:取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生药.min，萃取时间300_340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
[0008]优选的，上述的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成:取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药.min，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
[0009]现有技术中，止眩安神颗粒每次I袋，每袋重5g (无糖型)或IOg (有糖型)，一日3次。止眩安神颗粒服药量大，且颗粒剂制备需要加大量的糖，糖尿病患者不适宜，不加糖的话味道不佳，患者不容易服下，依从性差。采用本发明方法制备成的止眩安神片每片重
0.5g，每次仅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。
[0010]试验一、不同方法制备的止眩安神片中淫羊藿苷含量的比较
[0011]1、仪器及试药本发明止眩安神片:按实施例1方法制备，使用2160g原料药，经提取制成200片，每片重0.5g。原止眩安神颗粒，按照WS-11411 (ZD-1411) -2002标准方法制备。Agilentl200高效液相色谱仪；METTLER AE240电子分析天平；淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。
[0014]色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(26: 74)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于8000。
[0015]对照品溶液的制备精密称取在105°C干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，加70%乙醇制成每Iml含50 μ g的溶液，即得。
[0016]供试品溶液的制备取本发明的止眩安神片，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，称定重量，密塞，放置过夜，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得。
[0017]对照产品供试品溶液的制备取本对照的止眩安神颗粒，研细，取4g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，称定重量，密塞，放置过夜，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得。
[0018]测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0019]3、结果
[0020]结果表明，本发明止眩安神片中淫羊藿苷的含量为3.5-6g/片；而原止眩安神颗粒中淫羊藿苷的含量为1.2mg/袋，每次服用量2片的淫羊藿苷含量为原颗粒剂含量的6-10倍，在服用量减少的情况下，淫羊藿苷含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本发明制备方法制备的止眩安神片，有效成分含量远远高于WS-11411 (ZD-1411) -2002标准记载的方法制备的止眩安神颗粒。
【具体实施方式】[0022]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0023]实施例1
[0024]取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川弯200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药.π?η，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
[0025]经检测，成品中淫羊藿苷的含量为5.9mg/片。
[0026]实施例2
[0027]取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川弯200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度50°C，C02流量3ml/g生药.π?η，萃取时间300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
[0028]经检测，成品中淫羊藿苷的含量为3.6mg/片。
[0029]实施例3
[0030]取鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川弯200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g，将干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药.π?η，萃取时间340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
[0031]经检测，成品中淫羊藿苷的含量为4.5mg/片。
[0032]实施例4:止眩安神片抑制小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞增殖的实验研究资料
[0033]1.实验材料
[0034]1.1实验用 细胞株[0035]小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0036]1.2实验药物
[0037]研究药物:本发明止眩安神片:按实施例1方法制备。
[0038]药液储液:称取IOOmg止眩安神片，溶于5ml无水乙醇中，0.2 μ m滤器过滤，500 μ Idoff管分装，-20°c存储，同时0.2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0039]1.3实验试剂
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810-033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESCO 公司)；EDTA (AMRESCO 公司)！Penicillin G SodiumSalt (AMRESCO公司I );Streptomycin Sulfate (AMRESCO);无水乙醇(溜博亚杜兰经贸有限公司)；MTT (Biosharp批号:0793) =PBS (实验室自配)；
[0041]1.4实验器材
[0042]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);C02培养箱(F0RMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号=SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:ΚΑ-1000);0.2μπι滤器(MILLIP0RE 型号:SLGP033RB);Icm 培养皿(NEST 公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.实验方法
[0044]I) EL4细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(IOcm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X IO4个/ml。
[0045]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ 1，培养板放入细胞培养箱中(37°C，5%C02)常规培养。
[0046]3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入止眩安神片溶液，继续培养24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，继续培养 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0049]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0050]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0051]3.统计处理
[0052]采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean + SD 表不。
[0053]4.实验结果[0054]MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对EL4细胞增殖抑制有差异(p〈0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P〈0.001)。
[0055]表1止眩安神片对EL4细胞增殖抑制影响研究(X土 SD)
[0056]
【权利要求】
1.止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，其特征在于，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成:取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，C02流量l_3ml/g生药.π?η，萃取时间300_340min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0.5g。
2.根据权利要求1所述的止眩安神片在制备抑制淋巴瘤细胞EL4细胞增殖药物中的应用，所述止眩安神片由鹿衔草400g、淫羊藿160g、黄芪160g、当归140g、川芎200g、葛根240g、炒白术120g、酸枣仁140g、制半夏120g、泽泻120g、干姜100g、甘草100g作为原料药制成，其特征在于，所述止眩安神片的制备方法由下列步骤组成:取干姜、川芎、炒白术、当归、鹿衔草，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，C02流量l_3ml/g生药.π?η，萃取时间320min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入6.5L50%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥,压片，制成200片，每片重0.5g。`
【文档编号】A61K36/9068GK103768561SQ201310669929
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】孙波 申请人:济南新起点医药科技有限公司