他克莫斯fk506在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及他克莫斯逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。本发明公开了他克莫斯FK506在制备非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体增敏剂中的应用。FK506联用TRAIL可以上调细胞膜表面的DR4mRNA与受体水平。这些结果表明FK506能联用TRAIL，增强TRAIL对耐受性肿瘤的治疗效果。
【专利说明】他克莫斯FK506在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及他克莫斯逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。江苏省近几年开展了以恶性肿瘤为主的全人口死因回顾性调查，结果显示男女性第I位死因均为恶性肿瘤，其死亡率占全部死因的27.41%。资料显示，2003年江苏省城市地区位于恶性肿瘤死亡前4位的分别是肺癌、胃癌、肝癌、食管癌；而农村地区为肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明显高于农村。尤其是通过分析1973至2004年几种主要恶性肿瘤的死亡情况发现，肺癌死亡率大幅上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5.65倍。由此可见，肺癌已经成为我省恶性肿瘤数一数二的“杀手”，严重威胁着我省人民的生存健康。
[0003]为什么在短短的几十年间，肺癌的发病率及死亡率有如此迅猛的发展趋势？ 1:大样品调查研究表明肺癌的主要危险因素为吸烟和大气污染，而近年来吸烟人数有增加的趋势，汽车尾气和工业废气的大量排放，又加重了大气环境污染的程度。因此，随着我省经济的发展，城市化、工业化进程的加快，空气污染将会越来越严重，这将不可避免地导致肺癌死亡率进一步增加。2:肺癌在早期时往往没有明显的症状，当有症状被诊断出来时，常常已经是局部晚期或晚期无法手术切除的情形。一般而言，新诊断的肺癌仅约不到20%的病人属于早期可以有机会接受手术切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人则失去了外科手术根治的最佳时机。3:到 目前为止，对肺癌的治疗，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治疗干预手段。
[0004]临床上，肺癌通常分为小细胞与非小细胞肺癌两种类型，总的肺癌病例中，非小细胞肺癌(包括肺鳞癌，肺腺癌)约占80%。因此针对非小细胞肺癌的治疗研究是攻克肺癌的一项极其重要的课题，引起了全世界医学界的广泛关注。
[0005]如上所述，虽然手术治疗是治疗非小细胞肺癌的重要手段，但对绝大部分晚期肺癌病人来说手术治疗并不能有效解决肿瘤转移的问题。因此对于这些晚期或已经有远端转移的肺癌病人，全身性的化学治疗是非小细胞肺癌多学科综合治疗的主要策略之一。尤其是化疗与手术、放射等疗法综合运用能明显防止癌肿转移、复发，提高长期生存率。现在，非小细胞肺癌化疗已经初步形成共识，通常采用顺钼加泰索帝、紫杉醇、健择、诺维本等中的一种。根据患者的具体情况，选择不同的组合，可以达到提高疗效，降低毒性反应的目的，特别是出现了一些极具前景的新型靶向药物，其作用机制与传统化疗药物不同。传统化疗药物属于细胞毒性药物，是通过毒性杀死肿瘤细胞，但同时不可避免会伤害正常细胞。而靶向药物进入肿瘤细胞后，可以通过特异性作用于肿瘤生长的细胞信号途径，抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、转移，不良反应轻，患者可以很好耐受。
[0006]是目前已知的一种肿瘤细胞凋亡诱导分子，对正常细胞一般无明显作用，是一种极具前景的抗癌药物。然而目前研究发现，许多恶性肿瘤细胞对TRAIL具有耐药性，使TRAIL在临床应用中遭遇瓶颈。在这些靶向药物中，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)越来越受到人们的关注。TRAIL是由Wiley于1995年检索EST时首次发现并克隆的，是一种II型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族，与相应受体结合后，可以快速诱导细胞发生凋亡。但与其它凋亡诱导分子显著不同的是，TRAIL主要杀伤转化细胞和肿瘤细胞，而正常细胞可以逃逸它的杀伤作用。体内研究表明，TRAIL可以明显抑制肿瘤生长，甚至彻底清除肿瘤。TRAIL的这种肿瘤细胞选择性杀伤作用使该蛋白在抗肿瘤方面具有很强的开发价值与潜力。但是值得注意的是，并非所有的肿瘤细胞对TRAIL都具有很强的敏感性。体外研究表明，有些肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的耐受性。这可能与肿瘤细胞表面缺乏TRAIL受体(DR4，DR5)，或分布有假受体(DcRl，DcR2)，或过度表达一些抗凋亡蛋白如bcl-2，FLIP，surViVin有关。因此TRAIL的抗肿瘤作用因不同的肿瘤类型而异。
[0007]研究表明，非小细胞肺癌细胞对TRAIL有明显的耐受性，但具体的机理目前并不清楚。为了充分发挥TRAIL对肿瘤细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小细胞肺癌细胞株对TRAIL的敏感性，从而达到运用TRAIL有效治疗非小细胞肺癌的目的。
[0008]他克莫斯FK506是从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素，广泛应用于自身免疫疾病的治疗以及器官移植导致的免疫排斥反应，但是到目前为止，将FK506用于肿瘤增敏剂治疗肺癌并没有相关报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供他克莫斯FK506的一种新用途。
[0010]本发明公开了他克莫斯FK506在制备他克莫斯FK506在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0011]本发明公开了他克莫斯FK506在增强非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)敏感 性中的应用。
[0012]基于上述应用，他克莫斯FK506用于制备非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)增敏剂。
[0013]本发明公开了他克莫斯FK506与TRAIL —起制成药物组合物，在制备治疗非小细胞肺癌的药物中应用。
[0014]本发明中，我们首次发现FK506能显著增强TRAIL耐药肿瘤细胞株，肺癌细胞株A549对TRAIL诱导凋亡的敏感性，且这种增强效应具有明显的剂量效应和时效性。而FK506对TRAIL诱导凋亡的增敏性对PMBC以及非肿瘤细胞的正常肺支气管细胞株HBE以及BEAS-2B无明显作用。另外，FK506对TRAIL诱导细胞凋亡的增敏性还具有广谱性，在对TRAIL耐药的白血病细胞株中，FK506能明显增强HL_60、U937对TRAIL诱导凋亡的敏感性。分子机制研究表明FK506联用TRAIL处理的A549细胞中，参与凋亡调控的相关蛋白发生应答，其中TRAIL受体DR4的表达水平显著增加，FK506联用TRAIL可以上调细胞膜表面的DR4mRNA与受体水平。这些结果表明FK506能联用TRAIL，增强TRAIL对耐受性肿瘤的治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1FK506剂量依赖性地增强A549细胞对TRAIL诱导的凋亡。[0016]图2FK506时间依赖性地增强A549细胞对TRAIL诱导的凋亡。
[0017]图3BEAS-2B与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。
[0018]图4PBMC与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。
[0019]图5HBE与A549细胞对FK506联用TRAIL诱导凋亡的敏感性比较。
[0020]图6FK506联用TRAIL对白血病细胞U937的凋亡的影响。
[0021]图7FK506联用TRAIL对白血病细胞HL-60的凋亡的影响。
[0022]图8FK506联用TRAIL对白血病细胞K562的凋亡的影响。
[0023]图9FK506联用TRAIL对白血病细胞CCRF-CEM的凋亡的影响。
[0024]图10FK506联用TRAIL增强A549细胞促凋亡蛋白的应答。
[0025]图11FK506联用TRAIL增强A549细胞表面DR4的水平。
[0026]图12不同剂量的FK506联用TRAIL对DR4mRNA水平的影响。
[0027]图13FK506联用TRAIL时间依赖性地上调DR4mRNA水平。
[0028]图14FK506联用TRAIL DR4mRNA转录后调控水平的影响。
【具体实施方式】
[0029]1、实验材料、试剂
[0030]细胞:A549(ATCC，CCL_185，由中国科学技术大学生命科学学院吴清发课题组惠赠)用含10%的FBS、1%的链霉素青霉素双抗的DMEM培养基培养，HBE、BEAS-B、U937、HL-60、K562 (该5株细胞系由南京大学生命科学学院徐强课题组惠赠)、CCRF-CEM (由南京大学化学化工学院朱俊杰课题组惠赠)以及从新鲜抗凝血(来自江苏省南京市省肿瘤医院)分离的PBMC细胞用含10%的FBS、1%的链霉素青霉素双抗RPMI1640培养基培养。
[0031]分子试剂:单核细胞分离液(TBD，LDS1075)、全血及组织稀释液(TBD，2010X1119)、MLV 反转录试剂盒(MBI，K1621)、Taq 酶(sangon, SC0010) )、Trizol (sangon, SK1312)、Annexin V-eGFP、碘化丙旋(PI)、放线菌素(ActD, sigma,A14105mg), PARP antibody(Oncogene, AM30-100ug) >caspase3antibody (CST, #8610)、caspase8antibody(CST, # I C I 2)、caspase9antibody(CST, #5902)> FLIP L ant ibody (santa cruz，H-1 50)、FLIP s/L antibody ( santa cruz, H-202)、BCL_2antibody (CST, #2876)、BCL-xLantibody (CST, #2762)、BAX antibody (BD, 556467)、DR4antibody (IMGENEX, IMG-141A),DR5antibody (IMGENEX, IMG-120A)、Alexa Fluor488Goat Ant1-Mouse IgG (invitrogen,A11029)> Goat Ant1-Mouse IgG(santa cruz, SC-2005)、Goat Ant1-rabbit IgG(santacruz, SC-2004) > normal IgG (santa cruz,SC-2025)
[0032]2、PCR 引物
[0033]用于半定量检测DR4mRNA表达水平的引物为
[0034]RT DR4F:5’ -CTGTGCTGATTGTCTGTTGTTGC-3’ (SEQ ID N0.1);
[0035]RT DR4R:5’-GCCTCCTCCTCTGAGACCCTT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0036]内参引物为 RT GAPDH F:5’ -CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’ (SEQ ID N0.3);
[0037]RT GAPDH R:5’ -GCAGGAGGCATTGCTGAT-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0038]3实验方法:[0039]3.1PBMC 分离
[0040]取新鲜的抗凝血10mL，与全血及组织稀释液1:1混匀，将混合液小心叠加于分离液的液面上(混合液:分离液=2:1),可以分成3个15mL离心管，500g, RT离心15min,小心取出离心管，此时离心管分为4层，最上层为血浆层，其次是乳白色的淋巴细胞层，第三层是透明分离液层，最下面是红细胞层，吸掉第一层，小心将第二层取出，加入IOmL的RPMI1640培养基(含有10%的FBS和1%的链霉素青霉素双抗)重新悬浮细胞，2000rpm离心lOmin，再重复一次。用少量RPMI1640培养基悬起，按照实验需求进行相应稀释，并转移入细胞培养板中进行培养。
[0041]3.2.流式细胞仪检测细胞凋亡
[0042]3.2.1样品制备
[0043](I)细胞培养和刺激诱导凋亡，对于贴壁细胞，则更换掉原培养基，换成加药培养基；对于悬浮细胞则不用换液，直接将按比例稀释的加药培养基加到原细胞培养基中；
[0044](2)贴壁细胞收集:先去培液，用预冷的PBS洗涤一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培液终止胰酶作用，收集细胞，每样本细胞数控制在(I~10) X 106/mL, 2000rpm/min, 4°C离心5min,弃去培养液；
[0045](3)用预冷的PBS洗漆细胞I次，4°C 2000rpm/min离心5min,弃上清；
[0046](4)用结合缓冲液洗漆细胞I次，4°C 2000rpm/min离心5min,弃上清；
[0047](5)配制标记溶液:用结合缓冲液稀释至终浓度为I μ g/mL的Annexin V_eGFP,用400 μ I的标记溶液重悬细胞，冰上避光孵育15min。
[0048](6)每管再加入碘 化丙碇(PI)终浓度为I μ g/mL，将细胞转移到流式试管。细胞在I小时内用流式细胞仪分析。
[0049]3.2.2流式细胞仪分析
[0050](I)先打开电源开关启动仪器本体，再打开计算机。流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm的氩离子雷射，eGFP绿色荧光用FLlchannel检测，FLlPMT荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545nm)，PI红色荧光用FL3channel检测，FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>650nm)；
[0051 ] (2)建立对数FL1-FL3散点图，收集样品细胞，并对上一步中圈出的细胞进行分析，调节参数，使绝大部分细胞处在左下象限中心区域；接着通过凋亡阳性细胞确定FLl凋亡象限的划分。
[0052](3)依次上样待检测样品并分析结果。
[0053]3.3.流式细胞仪分析检测细胞表面受体
[0054]3.3.1样品制备
[0055]( I)细胞培养和刺激诱导凋亡；
[0056](2)贴壁细胞收集:先去培液，用预冷的PBS洗涤一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培液终止胰酶作用，收集细胞，每样本细胞数控制在(I~10) X 106/mL, 2000rpm/min, 4°C离心5min,弃去培养液；
[0057](3)用预冷的PBS洗漆细胞I次，4°C 2000rpm/min离心5min,弃上清；
[0058](4)用1%(W/V)的BSA (PBS配制)稀释抗体DR4 (mouse)抗体(1:100稀释)，终浓度为5ug/mL, control为同种属(mouse)的IgG冰上标记细胞lh, PBS洗两遍,4°C 2800rpm/min离心5min,弃掉；
[0059](5)用 1% 的 BSA 稀释 Alexa Fluor488Goat Ant1-Mouse IgG (1:200 稀释)，冰上标记细胞0.5h,注意避光,标记后PBS洗两遍,4°C 2800rpm/min离心5min,准备上机。
[0060]3.3.2上机进行流式细胞仪分析
[0061](I)先打开电源开关启动仪器本体，再打开计算机。
[0062](2)启动 cell quest 程序,建立直方图 FLl-cell counter。
[0063](3)通过阳性细胞样品和阴性细胞样品设定Ml阴性值边界。
[0064](4)依次上样待检测样品并分析结果。
[0065]3.4.Western blot
[0066](I)电泳:根据《分子克隆》配制不同浓度的SDS-PAGE下层分离胶，5%的上层浓缩胶，将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；
[0067](2)转膜(湿法):在转膜塑料夹上从负极到正极依次铺转膜缓冲液浸湿的滤纸、SDS-PAGE胶、PVDF膜(使用前在甲醇中泡约lOsec)、滤纸，用玻璃棒轻轻排去气泡，在预冷的转膜液中恒流300mA转膜，转膜时间按蛋白分子量而定。；
[0068](3)封闭:用5%脱脂牛奶室温摇床包被约0.5h ；
[0069](4)包被一抗:用合适大小杂交袋封膜，加入用5%脱脂牛奶稀释的一抗，室温摇床包被约2h或4°C过夜；
[0070](5)洗一抗:用IXPBST洗PV`DF膜5minX3次(根据不同抗体选择合适的洗膜时间和次数);`
[0071](6)包被二抗:用合适大小杂交袋封膜，加入5%脱脂牛奶稀释的二抗，室温摇床包被Ih左右；
[0072](7)洗二抗:用 1\卩851'洗？￥0?膜51^1^3次；
[0073](8)底物反应:PVDF膜控干后正面向上放在保鲜膜上，滴加合适体积的化学发光液铺匀，反应约Imin后用吸水纸吸去PVDF膜多余水分，放入化学反光检测仪检测，其中曝光时间根据蛋白表达量而设定。
[0074]3.5.细胞mRNA的提取
[0075]实验用品都要提前用DEPC处理并灭菌，整个过程主要防止RNA酶的污染。铺细胞于六孔板，培养并处理细胞后，收细胞。用PBS洗涤，然后加入Iml/孔的Trizol，用枪吹打至细胞完全溶解并收集到EP管中。室温放置5min后每个样中加入0.2倍体积的氯仿，振荡15秒后放置2-3min，离心12000rpmX 15min,4°C。小心吸取上层转移到干净的EP管中，加入上清体积0.8-1倍体积的异丙醇,混匀后放置IOmin7VC离心12000rpmX IOmin,。可见RNA沉淀,弃去上清,用lml75%乙醇洗漆，8000rpm离心5min后，晾干RNA沉淀,加入30 μ I预热的DEPC水溶解。待RNA溶解后对RNA进行定量，记录提取的RNA样品的浓度以及 Α260/Α280 值。
[0076]3.6.半定量 RT PCR
[0077](I)采用MBI反转录试剂盒进行反转录。取一个干净的1.5mL EP管，依次加入下列各组分，混匀，微离心，65°C , 5min,4°C冷却5min。
[0078]
【权利要求】
1.他克莫斯FK506在制备非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体增敏剂中的应用。
2.他克莫斯FK506与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联用在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。`
【文档编号】A61P35/00GK103622957SQ201310674818
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】殷武, 马林 申请人:南京大学