林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，提供了林蛙提取液新的医用用途，利用林蛙提取液对的抑制和消炎抗菌作用，对由SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌进行治疗及预防；本发明还可改变细菌细胞膜的通透性，且其不易产生耐药性；选用纯生物制剂，毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。
【专利说明】林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，以及一种治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，属于医学生物制药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。每年大约有47万左右宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，并有23万人死于该病，其中80%的病例发生在发展中国家。目前研究己确认高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是宫颈癌形成最重要的危险因子,在99.7%的浸润性宫颈癌中可以检测到它的存在。现已确认有超过200种HPV，其中大约有30种型别在子宫颈癌中被发现，根据HPV亚型与宫颈癌的相关性可将HPV分为高危型和低危型。公认的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 型等，其中 HPV16 是子宫颈癌患者最常见的感染型别(58.9%)，其次分别依次为HPV18 (15.0 %)，HPV45 (5.9 %)，HPV31 (4.3%)
，HPV33 (3.0%)，HPV52 (2.3%)，HPV58 (1.2%)，HPV35 (0.3%)等等。
[0003]目前的治疗方法主要有物理治疗及药物治疗。物理治疗主要是采用激光、微波、冷冻、电灼、手术切除(妇科的LEEP刀等)、光动力疗法等，缺点是治疗深度需要熟练的操作者控制，伤口深愈合慢，尤其在外生殖器部位，伤口易出血、易感染、易复发，有时还会在病灶周围形成自体种植。药物治疗采用的药物大部分具有一定腐蚀性，需要保护好周围正常组织，否则易形成周围正常组织的种植。不太适合粘膜疣的应用；腐蚀性不大的药物用药时间长，有一定的刺激性，也可以出现皮肤的浅糜烂面。目前治疗HPV感染的药物无确切疗效，疫苗大规模投入临床使用尚需时日，研制开发抗HPV药物对于宫颈癌的防治具有重大意义。
[0004]本发明治疗及预防由宫颈癌SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌。经检索未见林蛙提取液治疗及预防宫颈癌的药物中的应用。
【发明内容】
[0005]本发明公开了林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途。
[0006]本发明的技术解决方案如下:
本发明所述林蛙提取液是按照下述方法制备的:
将林蛙干粉碎后，加入到1-10%醋酸中，醋酸与林蛙干的体积重量比(ml/g)为1:1-30:1 (即Ig林蛙干加入l_30ml醋酸)，超声提取，过滤，离心，得到林蛙提取液。
[0007]优选的，超声时间为:10-80min，超声温度为-4-30°C，离心温度为-4_30°C，离心时间为5-60min，离心转速为2000_15000rpm。
[0008]本发明中由林蛙提取液制备成的治疗或预防宫颈癌的药物的用法为外用阴道给药。
·[0009]所述林蛙提取液可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂或湿巾等。
[0010]本发明提供一种治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，其特征在于有以下原料按重量份数比制成的:
林娃干10-75份,石腊6-35份,液体石腊5-45份，白凡士林5_40份,单硬脂酸甘油酯5-80份，司盘40 1-35份，乳化剂OP 2-15份，对羟基苯甲酸乙酯1-8份，冰片5-20份。
[0011]本发明所提供所述治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂的制备方法，其包括如下步骤:
(1)林蛙提取液的制备:称取林蛙干粉碎后，加入1-30倍体积(ml:g)的1-10%醋酸超声提取10-80min，超声温度为-4_30°C ;过滤，离心，离心温度为-4_30°C，离心时间为5-60min，离心转速为2000-15000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制备:取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂0P、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；
(3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤(2)制得的油相与林蛙提取液分别加热至70-100°C，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115°C灭菌lOmin，冰片加热到70-100°C过膜，无菌条件下混合均匀，分装。
[0012]本发明的积极效果在于:提供了林蛙提取液新的医用用途，利用林蛙提取液对的抑制和消炎抗菌作用，对由SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌进行治疗及预防；本发明还可改变细菌细胞膜的通透性，且其不易产生耐药性；选用纯生物制剂，毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区长白山麓。中国林娃(Rana temporaria chensinensis)俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等,在动物分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两用的珍贵蛙种，并且资源丰富。
[0014]实施例1林蛙提取液的制备
取林娃干15g (中国林娃长白山亚种,购自吉林大药房)粉碎后,加入20倍体积(ml:g)的9%醋酸300ml ;超声提取，超声时间为lOmin，超声温度为18°C ;超声后进行过滤，离心，离心温度为4°C,离心时间为16min,离心转速为5500rpm,得林娃提取液。
[0015]实施例2林蛙提取液软膏剂的制备
处方组成(按重量份):林蛙干24份、石蜡17份，液体石蜡45份，白凡士林18份，单硬脂酸甘油酯34份，司盘40 29份，乳化剂OP 6份，对羟基苯甲酸乙酯3份，冰片7份。
[0016]制备方法:
(1)林蛙提取液的制备:称取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)粉碎后，加入25倍体积(ml:g)的7%醋酸超声500ml ;超声提取，超声时间为60min，超声温度为40C ;超声后进行过滤，离心，离心温度为4°C，离心时间为5min，离心转速为4000rpm，得林娃提取液；
(2)油相的制备:取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂0P、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；(3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤(2)制得的油相与林蛙提取液分别加热至90°C，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115°C灭菌lOmin，冰片加热到90°C过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。
[0017]实施例3林蛙提取液软膏剂的制备
处方组成(按重量份):林蛙干36份、石蜡14份，液体石蜡39份，白凡士林22份，单硬脂酸甘油酯37份，司盘40 29份，乳化剂OP 3份，对羟基苯甲酸乙酯4份，冰片8份。
[0018]制备方法:
(1)林蛙提取液的制备:取林蛙干26g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)粉碎后，加入15倍体积(ml:g)的6%醋酸390ml ;超声提取，超声时间为16min，超声温度为28°C ；超声后进行过滤，离心，离心温度为28°C，离心时间为40min，离心转速为8000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制备:取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂0P、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；
(3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤(2)制得的油相与林蛙提取液分别加热至90°C，将林蛙提取液加入到油相中，边加边搅拌至冷凝，115°C灭菌lOmin，冰片加热到90°C过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。
[0019]实施例4林蛙提取液软膏剂的制备
处方组成(按重量份):林蛙干62份、石蜡15份，液体石蜡43份，白凡士林29份，单硬脂酸甘油酯19份，司盘40 21份，乳化剂OP 8份，对羟基苯甲酸乙酯1份，冰片3份。
[0020]制备方法:
(1)林蛙提取液的制备:取林蛙干20g(中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)粉碎后，加入13倍体积(ml:g)的4%醋酸260ml，超声提取，超声时间为20min，超声温度为17°C ；超声后进行过滤，离心，离心温度为4°C，离心时间为35min，离心转速为4000rpm，得林蛙提取液；
(2)油相的制备:取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂0P、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；
(3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤(2)得到的油相与林蛙提取液分别加热至60°C，将林蛙提取液加入到油相中，边加边搅拌至冷凝，115°C灭菌lOmin，冰片加热到60°C过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。
[0021]实施例5林蛙提取液喷雾剂的制备
处方组成(按重量份):林蛙干67份、氯化钠18份PEG.29份，苯扎溴铵4份。
[0022]制备方法:
(I)林蛙提取液制备:取林蛙干30g (中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)粉碎后，加入16倍体积(ml:g)的2%醋酸480ml，超声提取，超声时间为48min，超声温度为16°C ；超声后进行过滤，离心，离心温度为10°C，离心时间为5min，离心转速为4000rpm，得林蛙提取液；
(2)林蛙提取液喷雾剂的制备:加入PEG4_、氯化钠、苯扎溴铵，混匀，115 °C灭菌IOmin0冷却，分装入气雾剂瓶，即得。
[0023]实施例6林蛙提取液栓剂的制备处方组成(按重量份):林蛙干37份、3 -⑶包合物10份、半合成脂肪酸甘油酯21份，酒精1份，甘油1份。
[0024]制备方法:
第一步:林蛙提取液制备，取林蛙干40g (中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房)粉碎后，加入14倍体积(ml:g)的6%醋酸560ml，超声提取，超声时间为19min，超声温度为10°C;超声后进行过滤，离心，离心温度为15°C，离心时间为17min，离心转速为4600rpm，得林蛙提取液；
第二步:取8g@ -⑶包合物加入240ml水中混合，于60°C水浴中研成糊状，加入林蛙提取液，充分研磨，于恒温干燥器中干燥，得到林蛙提取液包合物；
第三步:取20g半合成脂肪酸甘油酯置蒸发皿中，于水浴上加热，使其充分融熔制得均匀的基质溶液；
第四步:将第二步所得林蛙提取液包合物及适量双蒸水混合均匀，然后在搅拌下将其加入到第三步的基质溶液中，加入石蜡，搅匀，趁热注入已涂有酒精、甘油等润滑剂的栓模中，冷却，削去模口溢出部分，脱模，即得栓剂。
[0025]试验例I
林蛙提取液治疗宫颈癌体外实验 1.实验原理
MTT法生物活性测试又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。本实验根据光密度值的变化观察样品对宫颈癌细胞的抑制作用。
[0026]2.实验材料 (I)细胞系
Caski细胞，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由吉林大学基础医学院提供。细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基中，于37°C，5%C02的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，细胞接种密度均为:100ml培养瓶，10.0X104/10ml ;6孔培养板，3.0 X 104/10ml ;24孔培养板，1.0X 104/lml ； 96 孔培养板，0.2X 104/0.2ml。
[0027]SiHa细胞株为人宫颈癌细胞，香港大学馈赠。悬浮生长于RPM1-1640培养液中，内含10%小牛血清，lmmol/L谷胺酞胺及100U/ml青霉素、100 u g/ml链霉素。于37°C，5%C02的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，每2-3天换液传代一次。
[0028](2)主要试剂及仪器
RPM1-1640培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，小牛血清、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝(美国Sigma公司)；超净工作台·(上海智城有限公司，ZHJH-Cl 109C)，二氧化碳培养箱(日本SANYO, MC0-18AIC)，倒置相差显微镜(德国Olympus，CKX41)，全自动酶联免疫检测仪(美国BioTek，Gen5)，细胞培养板及血球计数板。[0029](3)林蛙提取液
林蛙提取液为实施例1制备得到的林蛙提取液。
[0030]3.试验方法及结果
以培养液作为对照，取对数生长期的细胞，将Cask1、SiHa细胞接种于6板96孔细胞培养板，每孔加100 ill细胞悬液(细胞数量控制在2飞X IO3个细胞/孔)，第二天更换为含林蛙提取液的培养基，培养基所含林蛙提取液的浓度分别为5 mg/1 UO mg/1,20 mg/1，每孔加入药液100 U 1，并设正常对照，每个浓度平行12孔。培养板置于二氧化碳培养箱中，37°C5%C02培养24h，每孔加入20 u I MTT溶液(5mg/ml，生理盐水配制)，继续培养4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150u 1,37°C放置20min，缓慢震荡，待蓝紫色结晶完全溶解后用酶标仪于波长570nm下测定OD值，并计算抑制率；连续6天测点做生长曲线。结果见表1。
[0031]细胞抑制率(％)=(正常OD值一加药组OD值/正常OD值)X 100%
表1本发明对于Cask1、SiHa细胞抑制率统计表:
【权利要求】
1.林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，其特征在于，宫颈癌为SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌。
3.根据权利要求1所述的林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，其特征在于:所述的药物为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或湿巾制剂。
4.一种治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，是由以下原料按重量分数比制成的: 林娃干10-75份,石腊6-35份,液体石腊5-45份，白凡士林5_40份,单硬脂酸甘油酯5-80份，司盘40 1-35份，乳化剂OP 2-15份，对羟基苯甲酸乙酯1_8份，冰片5_20份。
5.根据权利要求1所述的治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)林蛙提取液的制备:称取林蛙干粉碎后，加入1-30倍体积(ml:g)的1-10%醋酸超声提取，过滤，离心，得林蛙提取液； 2)油相的制备:取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂0P、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相； 3)林蛙提取液软膏剂的制备:将步骤2)制得的油相与林蛙提取液分别加热至70-100°C，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115°C灭菌lOmin，冰片加热到70-100°C过膜，无菌条件`下混合均匀，分装。
【文档编号】A61K9/06GK103655625SQ201310745157
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月29日 优先权日:2013年12月29日
【发明者】不公告发明人 申请人:吉林省力荣生物科技有限公司