多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用。本发明提供的多臂PEG修饰剂可用于加强多亚基蛋白的亚基间作用力，使多亚基蛋白保持聚合的形式，从而增加多聚体蛋白的稳定性，增强或保持多亚基蛋白的生物活性，同时减少各亚基解聚后抗原位点暴露的几率，降低免疫原性。此外，本发明中制备的PEG修饰后的门冬酰胺酶和市售的PEG化门冬酰胺酶产品“培门冬酶”相比，具有低免疫原性，高活性、高稳定性，PEG不会脱落等优点，更适用于抗肿瘤药物的制备。
【专利说明】多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用。
【背景技术】
[0002]聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自 1977 年 Abuchowski，Davis(J.B1l.Chem.1977, 252:3578-3581.)等人首次报道用 PEG修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物【技术领域】得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。
[0003]在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30%-40%，甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-1ntron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8%。此外，一般随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素(EPO)后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jue Wang, journal of controlled release, 2010 (145): 306-313)。Bailon 等米用分支型40kDa PEG修饰Interferon- a -2a,所得单修饰物获得较长的循环半衰期，但是仅仅保留了 7% 的体外活性(Bailon P, B1conjugate Chem.，2001，12:195-202.)。
[0004]聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，目前虽然已经比较成熟。但并不能找出一种通用的聚乙二醇修饰剂以及修饰方法来对所有的蛋白药物进行修饰。蛋白的结构以及所用PEG的分子量、形状以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性以及药效有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。因此，修饰剂的选择(修饰剂种类、分子量大小)以及修饰反应的控制在聚乙二醇修饰技术中占有重要地位。蛋白质结构的解析并不能准确预测天然蛋白质的药代动力学行为，而在蛋白偶联上PEG以后由于引入了许多新的变量如分子量、修饰剂种类等，对于PEG偶联物的药代动力学行为预测变得更加不可能。为此，针对不同的蛋白质药物，需要通过选择不同种类以及不同分子量的修饰剂，并通过理化性质检测、动物实验评价等确定最佳方案。
[0005] 多亚基蛋白质(寡聚或多聚亚基蛋白质)指的是由两个以上彼此独立的亚基通过分子之间相互作用结合在一起的聚合体。其中，每个亚基一般由一条肽链组成，但也有两条以上肽链经二硫键相连组成。每个亚基自身折叠成一定的空间构型，不同亚基之间依靠疏水作用、氢键、离子键与作用力聚集在一起，形成蛋白质的四级结构，亚基之间相互作用构成有生物化学活性的整体。在自然界中，这种多亚基蛋白质在整个蛋白质家族中为数不少。例如，碱性磷酸酶由二个亚基构成，每个亚基分子量约为28KDa,整个分子的分子量约为56KDa ;人肿瘤坏死因子就是三个亚基构成，每个亚基分子量约为17KDa，整个分子的分子量约为51KDa;L-门冬酰胺酶的活性形式为4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成，整个蛋白分子的分子量约为140KDa ；Hp尿素酶单体由A、B两个亚单位组成，呈六聚体，A、B两个亚单体的分子量分别为30KDa和64KDa左右，其比例为1:1。多亚基蛋白质的生物学活性常常与其聚集体的结构有关。人肿瘤坏死因子TNF-α三聚体的生物学活性最高，是每个亚基单独存在时活性的8倍。而L-门冬酰胺酶只有在4个亚基组成的同源四聚体结构才能具有相应的生物学活性。另一方面，多亚基类蛋白解聚后不仅其活性一般会有显著降低，且作为药物在体内降解后，容易暴露出更多抗原表位，引起免疫反应，从而降低药效，引起副反应。因此，保持多亚基蛋白的生物学活性的重点在于如何防止亚基的解聚。
[0006]具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被称为L-天冬酰胺酶，L-门冬酰胺酶，或门冬酰胺酶)可以有效的治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。最近几年，含有L-天冬酰胺酶的药物已经用于联合化疗方案来治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得了较好的治疗效果。NK/T细胞淋巴瘤是中特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，多见于亚洲和拉丁美洲，我国发病率相对较高。根据肿瘤发生部门，NK/T细胞淋巴瘤可分为鼻型NK/T细胞淋巴瘤和非鼻型NK/T细胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and labrou, J.B1technol.127 (2007) 657-669)。L-门冬酰胺酶的活性形式为 4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成。L-天冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(E.coli)和软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cav1idea超科)和某些阔鼻猴(New World monkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶。但是，由于它来源于外源生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。(张丽娜，宫道华.江苏医药.左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴细胞性白血病的毒副反应.2005，31 (5):392;王宁玲，刘芝璋等.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的毒副作用及防治.中国小儿血液，2005，10 (3):133)。
[0007]目前针对L-门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰研究已有很多。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar (Enzon inc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。但是Oncaspar使用的PEG是琥拍酰亚胺琥拍酸酯(SS-PEG)，这种PEG含有对酶的水解敏感的、或者在微碱性PH值时不稳定的酯键(美国专利号4670417)。这些性质显著降低了体外和体内的稳定性并且副作用也较大。而国内目前上市的PEG修饰的L-门冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培门冬酶”，它是Oncaspar的仿制药，也存在着PEG容易降解脱落的问题。
[0008]国内相关的已授权的专利主要有两个，分别是连云港新阳医药有限公司的“聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法”(申请号02149328.6)，和上海医药工业研究院的“聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶”(申请号200610027026.0)。其中连云港新阳医药有限公司的专利中所采用的修饰方法是两步反应法，首先用分子量较小的PEG修饰剂进行修饰，然后再用分子量较大的PEG修饰剂进行二次修饰。这种修饰方法步骤繁多，而且修饰产物的均一性难以控制，纯化方法复杂。而上海医药工业研究院的专利中使用的PEG修饰剂与门冬酰胺酶结合后不易水解，但修饰后活性损失较大，保留了原蛋白60%的活性。国外的阿利兹第二药物公司最近也申请了关于PEG修饰L-门冬酰胺酶的专利。这个专利中所使用的PEG修饰剂也是较常用的随机修饰氨基的修饰剂，修饰的L-门冬酰胺酶是欧文氏菌来源的。另外国内外也有多篇PEG修饰L-门冬酰胺酶的论文发表，用的都是常规的单甲氧基PEG修饰剂。所有的这些专利和文章中PEG修饰后的L-门冬酰胺酶和未修饰的原蛋白比较，免疫原性有了降低，但依然存在有免疫原性的问题。并且，这些专利和文章也都没有涉及解决多亚基蛋白质的亚基解聚的问题。
【发明内容】
[0009]为了克服现有技术中的上述技术问题，本发明的目的之一是提供多臂聚乙二醇修饰剂在修饰多亚基蛋白中的应用。
[0010]所述聚乙二醇修饰剂优选与多亚基蛋白质的氨基偶联。
[0011]优选的，本发明使用的聚乙二醇修饰剂为醛基活化的或酯活化的四至八臂聚乙二醇修饰剂。优选为四臂聚乙二醇修饰剂。
[0012]更优选的，本发明使用的多臂聚乙二醇修饰剂的结构式分别如式(I)或式(II)所示:
[0013]
【权利要求】
1.多臂PEG在修饰多亚基蛋白中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的多臂PEG选自以下任意一种结构所示的PEG:
其中n选自I到2000整数值，k为I或2，m选自2_16之间的整数，p选自1_4之间的整数，多臂PEG的分子量在I~10kDa之间。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的η选自2-500之间的整数值，优选为25-100之间的整数；所述的k为1，m为4，ρ为2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之间，优选为5~1kDa0
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的多臂PEG为醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯中的任意一种；醛基活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一种，优选4臂聚乙二醇丙醛。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于所述的多亚基蛋白选自碱性磷酸酶、门冬酰胺酶或尿素酶中的任意一种。
6.一种利用多臂PEG修饰多亚基蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤； (O需要修饰的蛋白和PEG修饰剂按比例混合后在缓冲液中进行修饰反应； (2)修饰反应结束后用离子交换层析去除掉修饰产物中未与蛋白发生反应的PEG修饰剂； (3)用凝胶过滤层析对修饰产物进行纯化，收集目的修饰产物； 其中所述的PEG修饰剂选自以下任意一种结构所示的PEG:
其中n选自I到2000整数值，k为I或2，m选自2_16之间的整数，p选自1_4之间的整数，多臂PEG的分子量在I~10kDa之间。
7.根据权利要 求6所述的方法，其特征在于所述的η选自2-500之间的整数值，优选为25-100之间的整数；所述的k为1，m为4，ρ为2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之间，优选为5~1kDa0
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的多臂PEG为醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯中的任意一种，优选4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；醛基活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一种，优选4臂聚乙二醇丙醛。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的多亚基蛋白选自碱性磷酸酶、门冬酰胺酶或尿素酶中的任意一种。
10.多臂PEG修饰的多亚基蛋白。
11.根据权利要求10所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白按照权利要求6~9中任一项所述的方法获得。
12.根据权利要求10所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白为多臂PEG修饰的门冬酰胺酶。
13.根据权利要求10所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修饰剂选自以下任意一种结构所示的PEG:
其中n选自I到2000整数值，k为I或2，m选自2_16之间的整数，p选自1_4之间的整数，多臂PEG的分子量在I~10kDa之间。
14.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有如权利要求12所述的多臂PEG修饰的门冬酰胺酶和药学上可接受的辅料；所述的药物组合物的剂型优选冻干粉针制剂。
15.权利要求12所述的多臂PEG修饰的门冬酰胺酶或权利要求14所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
16.权利要求12所述的多臂PEG修饰的门冬酰胺酶或权利要求14所述的药物组合物在制备治疗急性白血病的药物中的应用。
【文档编号】A61K47/48GK104046600SQ201310745273
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】马永, 王俊, 吴鼎龙, 邱晶, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司