用于敲低err表达的小分子干扰rna、重组载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于沉默ERR的表达的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和药物组合物及其应用，所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。所述编码shRNA的DNA克隆到pDSL-hpUGIP载体得到重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体连同慢病毒包装质粒侵染细胞，得到有活性的能够转录ERR-shRNA的重组慢病毒；所述ERR-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默ERR表达的小分子干扰RNA；本发明提供的小分子干扰RNA能靶向ERR的mRNA，并导致ERR的mRNA降解，从而降低ERR的表达水平。
【专利说明】用于敲低ERR表达的小分子干扰RNA、重组载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种用于敲低ERR表达的小分子干扰RNA、重组载体及其应用。
【背景技术】
[0002]雌激素相关受体(ERR)不与雌激素结合，研究表明其与骨质疏松症和乳腺癌的发生有关，同时还在糖脂代谢途径中起重要作用。
[0003]RNA干扰(RNA interference, RNAi)可诱发的基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。目前，应用RNA干扰技术对ERR (雌激素相关受体的信使RNA)进行基因沉默的方法主要有真核表达载体构建法和腺病毒载体构建法。但是，真核表达载体构建法转染效率极低，而且只能转染极少数的细胞种类，应用范围受到很大限制。利用腺病毒载体构建的载体虽然宿主广泛、感染效率高，但其不能有效整合、目的基因表达时问短等缺点限制了其在ERR转基因研究中的应用。
[0004]因此，有必要提供一种采用RNA干扰技术对ERR进行基因沉默的方法。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种用于沉默ERR的表达的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒及应用。
[0006]本发明提供的小分子干扰RNA能直接特异性靶向ERR的mRNA，并导致ERR的mRNA降解，产生基因沉默效应；本发明提供的shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒或药物组合物能间接地沉默ERR的表达。
[0007]本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下:
[0008]ERR:雌激素相关受体；
[0009]ERR-shRNA:具有靶向雌激素相关受体信使RNA的短发夹RNA ；
[0010]mRNA:信使 RNA ;siRNA:小分子干扰 RNA ；shRNA:短发夹 RNA ；
[0011]第一方面，本发明提供了一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~29bp。
[0012]优选地，本发明第一方面提供了的一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~29bp。
[0013]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0014]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0015]优选地，所述雌激素相关受体蛋白基因为小鼠雌激素相关受体α基因。
[0016]第二方面，本发明提供了一种shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0017]优选地，本发明第二方面提供了的一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列,长度为19~27bp。
[0018]优选地，所述雌激素相关受体蛋白基因为小鼠雌激素相关受体α基因，所述小鼠雌激素相关受体α基因的Genebank登录号为26379 ；。
[0019]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0020]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0021]第三方面，本发明提供了一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0022]优选地，本发明第三方面提供了的一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0023]优选地，所述雌激素相关受体蛋白基因为小鼠雌激素相关受体α基因。
[0024]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0025]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0026]优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示的核苷
酸序列。
[0027]具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)为:
[0028]CCGCTAGTGCTCAGCTCTCTACCCAATTC AAGAGATTGGGTAGAGAGCTGAGCACTAGCTTTTTT ；
[0029]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)为:
[0030]AAAAAAGCTAGTGCTCAGCTCTCTACCCAATCTCTTGAATTGGGTAGAGAGCTGAGCACTAGCGG
[0031]进一步优选地,所述SEQ ID N0:3或4所示的核苷酸序列的5’端具有酶切位点。
[0032]更进一步优选地,所述SEQ ID N0:3或4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为 BamH I 和 Xho I。
[0033]在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0034]具体地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)为:
[0035]
【权利要求】
1.一种小分子干扰RNA，其特征在于:所述小分子干扰RNA具有与翻译雌激素相关受体蛋白的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~29bp。
2.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
3.一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
4.一种编码shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA含有如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
7.—种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在 a)pEN-hHlc质粒的多克隆位点或 b)pDSL-hpUGIP质粒的重组位点 插入如权利要求4~6任一所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。
8.—种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求7的b)所述重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种。
10 .如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种在制备抑制雌激素相关受体蛋白基因表达的药物中的应用。
【文档编号】A61P19/10GK103725682SQ201310746591
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】刘庆礼, 雷杨, 管敏, 潘浩波 申请人:深圳先进技术研究院