一种细胞孵化器的制造方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种细胞孵化器，它包括外管、设于外管内且与外管等长的若干根中空滤管；中空滤管两端外缘通过密封膜与外管两端内缘密封固定；外管上设有细胞培养基进口和细胞培养基出口；所述细胞培养基进口和细胞培养基出口均与中空滤管、密封膜及外管围成的腔室连通；所述外管上端设有密封上盖，密封上盖顶端设有动脉端口；所述外管下端设有密封下盖，密封下盖下端设有静脉端口；所述中空滤管内壁上设有细胞抗体层。由于孵化器本身不带有细胞，而是在植入体内后才捕获并培养自体细胞，因此，血液相容性显著提高，不会引发免疫反应，不会激活凝血，满足长时间连续性在体细胞培养需要。生理环境中获得的细胞层面，具备成熟、稳定、可自行更新等优点。
【专利说明】一种细胞孵化器
【技术领域】
[0001]本实用新型属再生医学【技术领域】，具体涉及一种细胞孵化器。
【背景技术】
[0002]据报道，全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因在疾病康复过程中重要器官发生纤维化而导致功能丧失，有数十万人迫切希望进行各种器官移植。但令人遗憾的是，一方面，目前的组织器官修复无论是体表还是内脏，仍然停留在瘢痕愈合的解剖修复层面上，离人们所希望的“再生出一个完整的受损器官”差距甚远；另一方面，器官移植作为一种替代治疗方法尽管有其巨大的治疗作用，但它仍然是一种“拆东墙补西墙”的有损伤和有代价的治疗方法。由于移植器官来源受限及伦理学等方面的限制，人们更加迫切需要复制所需要的组织或器官来进行替代性治疗。随着细胞生物学、分子生物学、免疫学及遗传学等基础学科的迅猛发展，以及干细胞和组织工程技术在现代医学基础和临床的应用，使得现代再生医学在临床应用方面显示出良好的发展前景。如在再生肾领域，有学者提出通过3D打印技术，“打印”一个具备肾脏轮廓及微细结构的器官，并以此为支撑材料，进行体外细胞培养，在支撑材料上培育出肾脏细胞，以实现肾脏的再造。也有在支架材料表面种植肝细胞，通过体外培养获得生物人工肝，替代受损肝脏，发挥生物合成及解毒作用。但是，该些技术建立在体外细胞培养技术基础之上，体外培养细胞无法获取机体相同的生长环境，因而，培育出来的细胞在植入机体后，不能适应机体的生理环境。因而，目前在复制组织器官方面，仍然缺少一个理想的细胞培育方法。市面上有中空滤管外套、外管的装置，但其主要用于水处理或血液过滤，目前有学者尝试采用该装置研制人工肾脏，即在体外培养肾脏细胞，然后将肾脏细胞注入中空管中。然而，该研制方法仍然建立在体外细胞培养技术之上。体外细胞培养需时长，存在较高的污染风险。而且，即使细胞培育成功，在移植体内后，也不能承受血流冲刷而脱落。实验证明:体外培养获得的人工肾脏接体循环I个小时即开始有细胞脱落，24小时几乎脱落完全，离实现移植物的长期存活目标相去甚远。另外，体外培养的细胞在植入体内后可能会产生排异反应，效果并不理想。与此同时，现有的人造肝脏、心脏等研究也存在同样的技术问题。
实用新型内容
[0003]本实用新型旨在克服现有技术的不足，提供一种在体细胞孵化器。
[0004]为了达到上述目的，本实用新型提供的技术方案为:
[0005]所述细胞孵化器，它包括外管、设于外管内且与外管等长的若干根中空滤管；中空滤管两端外缘通过密封膜与外管两端内缘密封固定；外管上设有细胞培养基进口和细胞培养基出口；所述细胞培养基进口和细胞培养基出口均与中空滤管、密封膜及外管围成的腔室连通；所述外管上端设有密封上盖，密封上盖顶端设有动脉端口 ；所述外管下端设有密封下盖，密封下盖下端设有静脉端口 ；所述中空滤管内壁上设有细胞抗体层。
[0006]其中，所述细胞抗体层通过层粘连蛋白与中空滤管内壁结合；所述腔室内填充含有细胞生长因子及抗凝剂的半固态或液态细胞培养基；所述细胞培养基的PH值为7.2~
7.4 ;所述细胞培养基为MEM、DMEM、RPM1-1640、199细胞培养基系列或天然培养基等；所述细胞生长因子为血管内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等；所述抗凝剂为:肝素、阿加曲班、水蛭素等。所述细胞抗体层为干细胞抗体层。所述干细胞抗体为MSC抗体。
[0007]下面以肾小球细胞孵化器为例，结合原理、制备方法及使用方法对本实用新型作进一步说明:
[0008]本实用新型的细胞孵化器(以下简称“孵化器”)外形可采用现有的血滤器，或用聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚氨酯等可降解材料制作。首先通过浸溃法在中空滤管内壁涂覆细胞外基质成分(层黏连蛋白、胶原蛋白溶液等):将细胞外基质成分溶液注入中空滤管，将孵化器置于37°C孵箱中孵育一段时间，之后抽去溶液，再将孵化器置于37°C恒温干燥箱中干燥。用电镜扫描中空滤管，可见中空滤管内表面附着有细胞外基质成分。然后通过浸溃法将骨髓间充质干细胞(MSC)抗体固定于中空滤管内壁:将MSC抗体溶液注入中空滤管后,将孵化器置于37°C孵箱中孵育一段时间，然后将溶液抽出，再将孵化器置于37°C恒温干燥箱中干燥，备用。从细胞培养基进口或细胞培养基出口向腔室注入包含血管内皮细胞生长因子及抗凝剂的细胞培养基(培养基PH在7.2~?.4，PH<7.2时更换培养基)，密封、消毒后于2-8 0C保存，该孵化器保存期为I月。或者将中空滤管被固定MSC抗体后的孵化器植入体内后，再从细胞培养基进口向腔室注入包含血管内皮细胞生长因子及抗凝剂的细胞培养基(培养基PH在7.2~7.4，PH<7.2时更换培养基)。
[0009]使用孵化器时需要将孵化器植入体内，将孵化器动脉端口与股动脉(颈动脉)连接，将静脉端口与股静脉(颈静脉)连接，形成动脉一孵化器一静脉的血液循环通路。血流中干细胞和中空滤管内的干细胞抗体结合，在腔室细胞培养基作用下，增殖分化形成血管内皮细胞层，从而获得完美血液相容性界面，维持血液循环顺利进行，同时保留中空滤管的滤过性能。成束的中空滤管类似肾小球的小动脉丛,并且同样具备小动脉的内皮细胞层,故而符合肾小球的基本生理结构特点，实现了肾小球的再生；另外，通过改变细胞培养基的配方，还可实现肝脏、心脏等多种组织细胞的再生。使用时，定期更换包含细胞生长因子及抗凝剂的细胞培养基即可。
[0010]本实用新型另辟蹊径，在体外构建肾小球细胞“孵化器”，该孵化器具备肾小球的大体结构特点，由类似肾小球动脉的多根中空滤管组成，中空滤管内表面固定有MSC抗体，能捕获血流中的MSC。所捕获的MSC在中空滤管内壁能增殖分化成内皮细胞表层。中空滤管浸泡于细胞培养基中，细胞培养基可定期更换，诱导所捕获的MSC细胞定向有序分化。植入机体后，将血流引入中空滤管内表面，通过表面MSC抗体特异性结合血流中的MSC，从而将MSC固定在中空滤管内表面，中空滤管内壁内皮细胞层形成后，能避免管材料和血流直接接触，防止免疫反应和促发凝血，实现连续性的血液循环和溶质滤过。采用在体细胞培养技术，可将固定的干细胞培育为血管内皮细胞。获得的血管内皮细胞层可将中空滤管和血流隔开，从而避免免疫反应，并保留中空滤管的滤过功能，实现肾小球的再生。MSC是机体多种组织细胞的祖始细胞，通过 改变“孵化器”中空滤管内培养基配方，还可将MSC培养培养成肝脏、心脏、胰腺等多种组织细胞。本实用新型中应用到的细胞捕获技术，是近些年在细胞工程领域兴起的一项技术，其原理是:将细胞抗体固定在材料表面，利用该抗体能特异性结合相应细胞的能力,捕获血流中的目标细胞。该技术在构建自体内皮祖细胞捕获血管支架研究中，已经取得了成功并日趋成熟。
[0011]与现有技术相比，本实用新型的有益效果包括:
[0012]由于细胞孵化器本身不带有细胞，而是在植入体内后才培育细胞，因此，血液相容性显著提高，不会引发免疫反应，不会激活凝血。生理环境中获得的自体细胞层面，具备成熟、稳定、可自行更新等优点。另外，本实用新型的细胞孵化器可批量生产，有较高的经济效益，同时作为再造人体器官研究的一部分，为再造人体器官的研发提供新思路，具备较高的社会价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本实用新型细胞孵化器结构示意图；
[0014]图2为图1A处的放大图。
[0015]图中:1、外管；2、中空滤管；3、密封膜；4、细胞培养基进口 ；5、细胞培养基出口 ；
6、腔室；7、密封上盖；8、动脉端口 ；9、密封下盖；10、静脉端口 ；11、细胞抗体层。
【具体实施方式】
[0016]实施例1肾小球细胞孵化器
[0017]参见图1，所述细胞孵化器包括外管1、设于外管I内且与外管I等长的若干根中空滤管2 ;中空滤管2两端外缘通过密封膜3与外管I两端内缘密封固定；外管I上设有细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5 ;所述细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5均与中空滤管2、密封膜3及外管I围成的腔室6连通；所述外管2上端设有密封上盖7，密封上盖7顶端设有动脉端口 8 ;所述外管2下端设有密封下盖9，密封下盖9下端设有静脉端口 10 ；其特征在于，所述中空滤管2内壁上设有MSC抗体层11。所述MSC抗体层11通过胶原蛋白与中空滤管2内壁结合。所述腔室6内填充含有血管内皮细胞生长因子及抗凝剂的细胞培养基。所述MSC抗体层11通过层粘连蛋白与中空滤管2内壁结合。
[0018]其中，所述细胞培养基的PH值为7.2?7.4。所述细胞培养基为MEM细胞培养基。所述细胞生长因子为血管内皮细胞生长因子；所述抗凝剂为阿加曲班。
[0019]上述孵化器的制备及效果检测如下:
[0020](I)孵化器外形制备。备血滤器(AV400，0.7m2，费森尤斯)，用作孵化器外形。先用无血清的MEM培养基冲洗，再把无血清MEM配制的层黏连蛋白10ug/ml注入中空滤管中，置于37°C孵箱中孵育I h，之后将溶液抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用。修饰后中空滤管经扫描电镜检测，可见中空滤管内表面全部被修饰物覆盖，并附着均匀；
[0021](2)中空滤管内壁MSC抗体固定。将MSC抗体溶液注入中空滤管，37°C孵箱中孵育过夜，之后将溶液抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用；
[0022](3)腔室充填细胞培养基及抗凝成分。孵化器外腔注满含5%(质量百分比含量)胎牛血清的MEM培养基，内含血管内皮细胞生长因子(20ug/L)以及抗凝成分阿加曲班(IOmg/L)。
[0023](4)MSC在体培养。通过动脉端、静脉端对接将孵化器植入机体。维持动脉-中
空滤管一静脉的有效血流循环。PH〈7.2时更换培养基。注意循环管路凝血情况，及时调整抗凝成分用量；
[0024]( 5)内皮细胞形态及功能检测。6个月后，扫描电镜检测见中空滤管内壁完全被覆内皮细胞，形态正常，沿长轴密集排列，成单层生长于中空滤管内腔内。6个月后，收集培养基，进行内皮素水平测定(32.3±7.9pg/ml)证明内皮细胞存活并保持正常的分泌功能。
[0025](6)进行连续的血液净化实验。抽出孵化器腔室培养基及抗凝成分，进行连续的血液净化。动物实验中观察到该再生肾小球在不应用任何抗凝剂的情况下，连续顺利进行血液净化最长时间达I个月，且中空滤管内表面内皮细胞可自行更新。理论上，该再生肾小球可望实现永久的血液净化。
[0026](7)再生肾小球溶质转运功能测定。经检测，尿素氮清除率210.7±55.3(ml/min)、肌酐清除率192.6±34.5(ml/min)，提示其小分子物质转运功能和血滤器无统计学差别。维生素B12清除率68.l±15.7(ml/min)，提示其较大分子物质转运能力较血滤器有轻度下降，但通过连续的血液净化，该溶质转运能力完全可以得到补偿。
[0027]实施例2肾小球细胞孵化器
[0028]参见图1，所述细胞孵化器包括外管1、设于外管I内且与外管I等长的若干根中空滤管2 ;中空滤管2两端外缘通过密封膜3与外管I两端内缘密封固定；外管I上设有细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5 ;所述细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5均与中空滤管2、密封膜3及外管I围成的腔室6连通；所述外管2上端设有密封上盖7，密封上盖7顶端设有动脉端口 8 ;所述外管2下端设有密封下盖9，密封下盖9下端设有静脉端口 10 ；其特征在于，所述中空滤管2内壁上设有MSC抗体层11。所述MSC抗体层11通过胶原蛋白与中空滤管2内壁结合。所述MSCs抗体层11通过胶原蛋白与中空滤管2内壁结合。
[0029]上述孵化器的制备及效果检测如下:
[0030](I)孵化器外形制备。以聚羟基丁酸酯为原料，采用静电纺丝技术制备中空滤管。将中空滤管成束放入成形的外管内，外管与中空滤管之间采用聚氨脂(密封膜)进行密封，外管两端用端盖密封。外管留有细胞培养基进出口，端盖留有动、静脉端口。外管和端盖材料为聚碳酸酯，封口胶材料为聚氨酯胶，在外管和端盖之间设一密封圈，密封圈材料为硅胶；
[0031](2)中空滤管内壁修饰。取胶原蛋白溶液3mg/ml，将PH调至7.2?7.4，加入交联剂EDAC (0.lmg/mg胶原)，配制胶原蛋白交联溶液。将该溶液注入中空滤管内，置于37°C孵箱中孵育I h，之后将溶液抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用。反复多次获得胶原蛋白多层膜；
[0032](3)中空滤管内壁MSC抗体固定。将MSC抗体溶液注入中空滤管内，37°C孵箱中孵育过夜，之后将其抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用；
[0033](4) MSC在体培养。通过动脉端、静脉端对接将前述方法制备的孵化器植入机体。维持动脉一中空管一静脉的有效血流循环。注意循环管路凝血情况，及时调整抗凝成分用量。在腔室中注入内皮细胞培养基(含5% (质量百分比含量)胎牛血清的DMEM培养基，含血管内皮细胞生长因子浓度为20ug/L、肝素抗凝剂浓度12500IU/L)，定期更换，保持培养基PH值>7.2 ;
[0034](5)内皮细胞形态及功能检测。6个月后，扫描电镜检测见中空滤管内表面完全被覆内皮细胞，形态正常，沿长轴密集排列。留取细胞培养基进行内皮素水平测定(52.7±11.6pg/ml)证明内皮细胞存活并保持正常的分泌功能。
[0035](6)进行连续的血液净化实验。动物实验血液净化中观察到所获得的再生肾小球在不应用任何抗凝剂的情况下，连续顺利进行血液净化最长时间达30天。
[0036](7)再生肾小球溶质转运功能测定。经检测，尿素氮清除率230±61.7(ml/min)、肌酐清除率203.3±74.5(ml/min)，维生素B12清除率93.2±21.9 (ml/min)，尿素氮、肌酐、维生素B12转运能力和血滤器无统计学差别。
[0037]实施例3肝细胞孵化器
[0038]参见图1，所述细胞孵化器包括外管1、设于外管I内且与外管I等长的若干根中空滤管2 ;中空滤管2两端外缘通过密封膜3与外管I两端内缘密封固定；外管I上设有细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5 ;所述细胞培养基进口 4和细胞培养基出口 5均与中空滤管2、密封膜3及外管I围成的腔室6连通；所述外管2上端设有密封上盖7，密封上盖7顶端设有动脉端口 8 ;所述外管2下端设有密封下盖9，密封下盖9下端设有静脉端口 10 ；其特征在于，所述中空滤管2内壁上设有MSC抗体层11。所述MSC抗体层11通过胶原蛋白与中空滤管2内壁结合。
[0039]上述孵化器的制备及效果检测如下:
[0040](I)孵化器外形制备。以聚羟基丁酸酯为原料，采用静电纺丝技术制备中空滤管。将中空滤管成束放入成形的外管内，外管与中空滤管之间采用聚氨脂(密封膜)进行密封，外管两端用端盖密封。外管留有细胞培养基进出口，端盖留有动、静脉端口。外管和端盖材料为聚碳酸酯，封口胶材料为聚氨酯胶，在外管和端盖之间设一密封圈，密封圈材料为硅胶；
[0041](2)中空滤管内壁修饰。取胶原蛋白溶液3mg/ml，将PH调至7.2，加入交联剂EDAC(0.lmg/mg胶原)，配制胶原蛋白交联溶液。将该溶液注入中空滤管内，置于37°C孵箱中孵育I h，之后将溶液抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用。反复多次获得胶原蛋白多层膜；
[0042](3)中空滤管内壁MSC抗体固定。将MSC抗体溶液注入中空滤管内，37°C孵箱中孵育过夜，之后将其抽去。37°C恒温干燥箱中干燥备用；
[0043](4) MSC在体培养。通过动脉端、静脉端对接将前述方法制备的孵化器植入机体。维持动脉一中空管一静脉的有效血流循环。注意循环管路凝血情况，及时调整抗凝成分用量。在腔室中注入肝细胞培养基(为含10% (质量百分比含量)胎牛血清的DMEM培养基，培养基中添加肝细胞生长因子浓度为20ug/L，抗凝剂重组水蛭素浓度为10mg/L)，定期更换，保持培养基PH值7.2?7.4 ；
[0044](5)肝细胞形态及功能检测。6个月后，扫描电镜检测见中空滤管内表面完全被覆肝细胞，形态正常，沿长轴密集排列。留取细胞培养基进行肝细胞标志物甲胎蛋白(AFP)水平测定为0.83±0.02ug/L，证明肝细胞生成并存活。经检测，培养基中白蛋白含量表达较原培养增加2.47±0.03g/L，证明肝细胞具备合成蛋白功能。
【权利要求】
1.一种细胞孵化器，它包括外管(I)、设于外管(I)内且与外管(I)等长的若干根中空滤管(2 );中空滤管(2 )两端外缘通过密封膜(3 )与外管(I)两端内缘密封固定；外管(I)上设有细胞培养基进口(4)和细胞培养基出口(5);所述细胞培养基进口(4)和细胞培养基出口(5)均与中空滤管(2)、密封膜(3)及外管(I)围成的腔室(6)连通；所述外管(2)上端设有密封上盖(7 )，密封上盖(7 )顶端设有动脉端口( 8 );所述外管(2 )下端设有密封下盖(9 )，密封下盖(9)下端设有静脉端口(10);其特征在于，所述中空滤管(2)内壁上设有细胞抗体层(11)。
2.如权利要求1所述的孵化器，其特征在于，所述细胞抗体层(11)通过层粘连蛋白或胶原蛋白与中空滤管(2)内壁结合。
3.如权利要求1或2所述的孵化器，其特征在于，所述细胞抗体层(11)为干细胞抗体层。
4.如权利要求3所述的孵化器，其特征在于，所述干细胞抗体为MSC抗体。
【文档编号】A61F2/02GK203677312SQ201320835127
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张义雄 申请人:张义雄