对转运治疗性分子穿过血脑屏障的增强的制作方法

对转运治疗性分子穿过血脑屏障的增强的制作方法
【专利摘要】本发明是至少部分地基于以下研究结果：发现二聚体形式的BBB转迁移抗体(例如，TMEM30A(CDC-50A)结合抗体FC5)与单价FC5VHH相比极大地增强转运穿过BBB。本发明尤其提供增强药理学活性剂转运穿过血脑屏障的分子，增强转运穿过血脑屏障的方法，以及治疗具有神经成分的病症或疾病的方法。
【专利说明】对转运治疗性分子穿过血脑屏障的增强
[0001] 发明背景
[0002] 大分子在整个身体内的分布一般是由血液中的大分子介导的扩散，其穿过毛细血 管脉管结构的高度窗孔内皮细胞衬里扩散至组织中。在高度血管化的大脑中不存在大分子 的自由扩散。大脑毛细血管内皮细胞缺乏在循环系统其余部分中可见的窗孔并具有高度 专业化的内皮细胞紧密细胞内接合。这些紧密接合用于防止大于400kDa的分子从毛细血 管的管腔自由扩散至近腔侧。另外，毛细血管包含各种转运体系统，例如有机阴离子转运体 (OATS)和多药耐药（MDR)系统，其积极建立可能以其他方式扩散穿过内皮细胞的分子的转 运梯度。限制性屏障的组合防止了外来试剂（例如包括毒素和病毒）的进入，以及限制了 治疗性实体的扩散。另外，这些限制性血脑屏障（BBB)有效阻断潜在治疗性蛋白、肽和小分 子以药理学治疗剂量被动递送到脑实质中。
[0003] -种成功实现转运治疗性分子穿过BBB内皮细胞的策略已经利用了受体介导的 转胞吞作用（RMT)。这个策略使用特异性结合于BBB内皮细胞上的蛋白质的抗体或分子， 其典型地涉及于分子穿过BBB内皮细胞的转运中。此类抗体在经历穿过BBB内皮细胞的转 胞吞作用的同时被用作穿梭分子以递送所连接的有效负载。这种技术的应用实例包括使用 转铁蛋白受体和膜岛素受体的抗体（Yu等，2011. Science Translational Medicine.第3 卷）。在这两种情况下，RMT抗体在C端融合至治疗性蛋白结构域并且已显示可转运分子穿 过BBB。不幸的是，常用的RMT靶标转铁蛋白和胰岛素受体在众多组织中高度且广泛地表 达。这种广泛的靶标表达导致短的循环半衰期，其转而又限制了 BBB内皮细胞暴露时间以 及从而限制了分子在大脑中的给药。另外，这些抗体靶向代谢上关键的细胞功能，从而产生 潜在的安全性风险。
[0004] 利用活性BBB转运分子来穿过BBB的改进型靶向部分，例如源自转迁移穿过BBB 的抗体分子的结合位点，对于治疗剂向大脑中的递送将具有很大益处。


【发明内容】

[0005] 本发明是至少部分地基于以下研究结果：发现包含血脑屏障（BBB)转迁移 抗体（例如TMEM30A (CDC-50A)结合抗体（例如，单结构域抗体FC5))的融合蛋白与 单价VHH相比极大地增强转运穿过BBB。初始结合和BBB内皮转运实验显示，FC5( - 种美洲驼单结构域VHH抗体（sdAb))可促进转运穿过BBB内皮细胞层（参见例如美 国专利7, 943, 129)。已知由于低分子量和缺乏Fc结构域，Vhh的循环半衰期较短 (Jain，M.，Kamal，N.和 Batra，S.K. (2007) Trends in biotechnology25 (7) ,307-316; Batra, S. K. , Jain, M. , ffittel, U. A. , Chauhan, S. C.和 Colcher, D. (2002) Current opinion in biotechnologyl3 (6)，603-608)。令人惊讶的是，通过将BBB转迁移单结构域抗体与人 Fc的N端融合产生二价抗体样构建体，使这种构建体的循环半衰期得到极大增强。此种结 合位点并入Fc构建体中产生二价分子，有可能产生二价结合，每个结合部分结合于在细胞 表面上表达的假定靶标（例如，TMEM30A)。由于亲合力影响，二价结合可以驱动表观结合亲 和力的显著变化（Reynolds, J.A. (1979)Biochemistryl8(2)，264-269 ;Hubble，J. (1999) Molecular immunology36(l), 13-18)。如本文所示，相互作用的亲和力增加。鉴于这种亲 和力增加，未预测到如下研究结果：添加 Fc以形成二价分子可显著增强转运穿过BBB。未 预测到所述转运增强是由于，虽然Fc结构域的添加由于质量增加而可延长β相药物动力 学，从而通过结合于FcRn而防止分子的肾滤过和促进体内抗体再循环，但由于在结合于高 表达靶标时消除了循环结合分子，增强的表观亲和力增加还可具有相反的作用。然而，最令 人惊讶的是，如本文所示，发现呈结合位点-Fc构象（从氨基至羧基端，S卩，结合位点融合于 Fc的N端）的融合蛋白相比于呈Fc-结合位点构象（结合位点融合于Fc的C端）的融合 蛋白具有更高的活性。尽管在体外进行的初始实验中显示Fc-结合位点融合蛋白（结合位 点融合于Fc的C端）与内皮细胞的结合增加，但上述是事实。还提供了单价形式的结合位 点-Fc构建体。
[0006] 因此，在一个方面，本发明涉及包含至少一个药理学活性剂和至少一个结合位点 (例如，BBB转迁移结合位点，其结合于TMEM30A)的结合分子，其中结合于TMEM30A的所述 至少一个结合位点是i)直接地或ii)通过插入氨基酸序列融合至Fc部分的N端。
[0007] 在一个实施方案中，所述结合分子包含至少两个结合位点。
[0008] 在一个实施方案中，所述至少一个结合位点包含FC5氨基酸序列。在一个实施方 案中，所述结合分子包含结合于TMEM30A的至少两个或至少三个（例如，两个或三个）结合 位点。在一个实施方案中，所述结合分子包含结合于TMEM30A的至少三个或至少四个（例 如，三个或四个）结合位点。
[0009] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点（例如，源自转迁移穿过BBB的抗体 分子的结合位点）是直接基因融合至Fc部分。
[0010] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点（例如，源自转迁移穿过BBB的抗体 分子的结合位点）是通过包含肽接头的插入氨基酸序列基因融合至Fc部分。
[0011] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点（例如，源自转迁移穿过BBB的抗体 分子的结合位点）是通过由肽接头组成的插入氨基酸序列基因融合至Fc部分。
[0012] 在一个实施方案中，两个BBB转迁移位点（例如，源自转迁移穿过BBB的抗体分子 的结合位点）是通过包含肽接头的氨基酸序列融合至完全Fc区的两个不同的Fc部分的N 端。
[0013] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点（例如，源自转迁移穿过BBB的抗体 分子的结合位点）是融合至scFc分子的N端。
[0014] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂是融合至Fc区的C端。
[0015] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂是小的化学实体。
[0016] 在一个实施方案中，所述小的化学实体在半胱氨酸残基处融合至结合分子。在一 个实施方案中，所述半胱氨酸残基是工程改造的半胱氨酸残基。
[0017] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂是多肽。
[0018] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂包含抗原结合位点（例如，源自非BBB 转迁移抗体的抗原结合位点）。
[0019] 在一个实施方案中，所述药理学活性剂选自由scFv分子、Fab分子和单结构域抗 体组成的组。
[0020] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂是基因融合至结合分子。
[0021] 在一个实施方案中，至少一个药理学活性剂是共价连接至结合分子。
[0022] 在一个实施方案中，BBB转迁移位点是通过包含抗体分子的VH结构域的插入氨基 酸序列基因融合。
[0023] 在一个实施方案中，BBB转迁移位点是通过包含抗体分子的VL结构域的插入氨基 酸序列基因融合。
[0024] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点是基因融合至完整抗体分子的VH结 构域的N端。
[0025] 在一个实施方案中，至少一个BBB转迁移位点是基因融合至完整抗体分子的VL结 构域的N端。
[0026] 在一个实施方案中，两个BBB转迁移位点是基因融合至完整抗体分子的VH结构域 和VL结构域的N端。
[0027] 在一个实施方案中，插入氨基酸序列进一步包含肽接头。
[0028] 在一个实施方案中，药学活性剂选自由以下组成的组：神经活性肽、小的化学实 体，和结合于中枢神经系统中的靶标的抗体的可变区。
[0029] 在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗神经病症的方法，其包括向受试者施用 本发明的结合分子。
[0030] 在一个实施方案中，所述神经病症为贮积病症。在一个实施方案中，所述神经病症 为慢性疼痛。在一个实施方案中，所述神经病症为癫痫症。在一个实施方案中，所述神经病 症为多发性硬化症。在一个实施方案中，所述神经病症为蛋白质病。在一个实施方案中，所 述病症为脱髓鞘病症。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的结合分子用于制造供治疗神经病症的 药物的用途。
[0032] 附图简述
[0033] 图1示出了（a)单独的FC5重链单结构域抗体、（b)与人IgGl agly Fc结构域N 端融合（FC5-Fc)或（c)与人IgGlagly Fc结构域C端融合（Fc-FC5)以及并有非BBB转迁 移结构域作为药学活性部分的可能的抗体样构建体（d、e)的图解表示。分子（f)和（g)说 明了 FC5重链单结构域抗体向完全抗体分子的添加；所述重链单结构域抗体可以例如融合 至VL或VH结构域，或两者。
[0034] 图2。示出了 2. 5ug的每种纯化蛋白在4-12% Bis-Tris SDS PAGE上的电泳。在 每种凝胶上标示10-220kD的SDS PAGE分子量标准。图A示出了（1)非还原性泳道FC5和 (2)还原性泳道FC5,图B示出了（1)非还原性泳道FC5-Fc和⑵还原性泳道FC5-Fc，以及 图C示出了（1)非还原性泳道Fc-FC5和（2)还原性泳道Fc-FC5。
[0035] 图 3。示出 了与对照抗体 12F6A(hIgGl)、CRL2434(mIgGl)和 C37H(仅 Vhh)相比， FC5Fc、FcFC5和FC5穿过体外SV40大鼠 BBB转化内皮细胞系的转运率增加。
[0036] 图 4a_c。图 4 (a)不出了 FC5_Fc (〇）、Fc_FC5 ( )或融合至 huFc agly 结构域 的N端的不相关对照骆驼科动物Vhh(Vhh-FC) (Λ)与SV40大鼠 BBB转化内皮细胞系的结合。 图（4b)示出了 FC5-Fc(〇）和Fc-FC5( )与初级大鼠 BBB内皮细胞系的结合。图4c示 出了 FC5-Fc与在EBNA293细胞中瞬时表达的大鼠（□)或人（? )TMEM30A以及Fc-FC5 与在EBNA293细胞中瞬时表达的大鼠(▲)或人（·）TMEM30A的结合。
[0037] 图5a_c。图5a示出了在Hargreaves动物模型中FC5与达拉根（Dalargin)共价 交联（FC5-Dal)以抑制疼痛的能力。缩爪速率以基于20秒时间框架的最大可能作用的百 分比MPE)表示。阴性对照显示对侧非发炎对照爪的缩爪速率（·）并且阳性对照显 示当向大鼠 IV注射单独的PBS时发炎爪的快速缩爪速率（〇）。在Hargreaves动物中比 较单一 IV 剂量的 21mg/Kg(mpk)的 FC5-Dal ( )与三个 IV 剂量的 7mpk 的 FC5-Dal ( □) 抑制缩爪速率的功效。图5b示出了每个所评价的爪的％ MPE反应相对于时间的平均曲线 下面积。图5c示出了在时间0、1小时和2小时向大鼠 IV注射三次剂量的7mpk的不相关 Vaa-Dal (灰色方块）或单独的FC5(空心方块）的其他阴性对照实验。还示出了对侧对照 爪（实心圆）。在Hargreaves动物中测定关于缩爪速率的抑制的％ MPE。
[0038] 图6a_d。在Hargreaves模型中评价Fc_FC5_Dal的功效。在图6a中在时间0时 以2mpkat向大鼠 IV给药以及在图6B中在时间0和2小时时以2mpkat向大鼠 IV给药。在 图6C和图6D中，在时间0时以6. 5mpk向每只大鼠 IV给药。
[0039] 图7a_d。比较FC5_Fc_Dal与阴性对照Fc-Dal在Hargreaves模型中的功效。在 时间0时以0. 5、2. 5或6. Ompk的单一浓度的FC5-Fc-Dal或Fc-Dal向大鼠 IV给药。数据 以给定时间下的最大可能作用（MPE)的百分比形式呈现于图7a和图7b中或以曲线下面积 百分比形式呈现于图7c和图7d中。
[0040] 发明详述
[0041] 发现包含至少一个BBB转迁移单结构域抗体（例如，其结合于TMEM30A (⑶C-50A) (例如，FC5单结构域））的融合蛋白相比于单价VHH极大地增强转运穿过BBB。特别地，结 合位点-Fc构象（从氨基至羧基端）显示增强的活性。至少部分地基于这种显著增加的转 运，本文描述了具有增加的转运穿过血脑屏障的分子、用于增强转运穿过血脑屏障的方法， 以及使用所述分子的治疗方法。
[0042] 在进一步描述本发明之前，为方便起见，某些术语描述于下：
[0043] I.定义
[0044] 如本文所用，术语"蛋白质"或"多肽"是指两个或更多个天然氨基酸或非天然氨 基酸的聚合物。
[0045] 术语"氨基酸"包括丙氨酸（Ala或A);精氨酸（Arg或R);天冬酰胺（Asn或N); 天冬氨酸（Asp或D);半胱氨酸（Cys或C);谷氨酰胺（Gin或Q);谷氨酸（Glu或E);甘氨 酸（Gly或G);组氨酸（His或H);异亮氨酸（lie或I);亮氨酸（Leu或L);赖氨酸（Lys或 K);甲硫氨酸（Met或M);苯丙氨酸（Phe或F);脯氨酸（Pro或P);丝氨酸（Ser或S);苏 氨酸（Thr或T);色氨酸（Trp或W);酪氨酸（Tyr或Y);以及缬氨酸（Val或V)。非传统 氨基酸也在本发明的范围内并包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸以及例如Ellman 等，Meth.Enzym. 202:301-336(1991)中所述的其他氨基酸残基类似物。为了产生此类非天 然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等，Science244:182(1989)和Ellman等，同上的程 序。简要地说，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基来化学活化抑制型tRNA，接着进 行RNA的体外转录和翻译。还可使用本领域中已知的肽化学来实现非传统氨基酸的引入。 如本文所用，术语"极性氨基酸"包括具有净电荷为零、但在其侧链的不同部分中具有非零 部分电荷的氨基酸（例如1?、1、5、￥、队0、〇。这些氨基酸可参与疏水性相互作用和静电 相互作用。如本文所用，术语"带电荷氨基酸"包括在其侧链上可具有非零净电荷的氨基酸 (例如R、Κ、Η、E、D)。这些氨基酸可参与疏水性相互作用和静电相互作用。
[0046] 如本文所用，术语"接头肽"是指联接或连接两个多肽序列、例如连接两个多肽结 构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列本质上并不天然联接或连接所述两个多肽结构域。在 一个实施方案中，接头肽为合成的。如本文所用，术语"合成"是指并不天然存在的氨基酸 序列。
[0047] 本发明的接头肽通过肽键联接两个氨基酸序列。在一个实施方案中，接头肽将BBB 转迁移部分联接至第二部分，例如，Fc部分结构域或区域。在一个实施方案中，本发明的接 头肽将药理学活性部分联接至线性序列中的第二部分，例如，作为BBB转迁移部分或Fc部 分结构域或区域的第二部分。在另一个实施方案中，接头肽联接两个药理学活性部分。在 一个实施方案中，接头肽将一个或多个Fc部分结构域或区域联接或基因融合至非Fc部分。
[0048] 在多肽的上下文中，"线性序列"或"序列"是多肽中在氨基至羧基端方向上的氨基 酸顺序，其中在所述序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
[0049] 如本文所用，术语"连接的"、"融合的"或"融合"可互换使用。这些术语是指通过 包括化学缀合或重组方式在内的任何方式将两个以上元件或成分接合在一起。如本文所 用，术语"共价融合"或"共价偶联"意指指定部分是彼此直接共价键合，或者通过一个或多 个插入部分如连接肽或部分彼此间接共价接合。在一个优选的实施方案中，部分是共价融 合的。一种共价键是肽键。本领域中已知化学缀合的方法（例如，使用异双官能交联剂）。 融合部分也可为基因融合的。如本文所用，术语"基因融合的"、"基因连接的"或"基因融 合"是指两个或更多个蛋白质、多肽或其片段通过编码所述蛋白质、多肽或片段的单一多核 苷酸分子的基因表达经由其单独的肽主链的共线性、共价键联或连接。所述基因融合导致 单一连续基因序列的表达。优选的基因融合是框内的，即，两个或更多个开放阅读框（0RF) 以维持原始0RF的正确阅读框的方式融合以形成更长的连续0RF。因此，所得重组融合蛋白 是包含两个或更多个对应于由原始0RF编码的多肽的蛋白质区段（所述区段本质上并不通 常如此接合）的单一多肽。在这种情况下，所述单一多肽在加工期间裂解以得到包含两个 多肽链的二聚分子。
[0050] 主题多肽包含至少一个药理学活性部分。药理学活性部分是指能够在生物学情形 下执行作用或反应的部分。例如，术语"药理学活性部分"是指结合于生物系统的成分（例 如，生物流体中或细胞表面上或细胞基质中的蛋白质）并且所述结合产生生物作用（例如， 如通过活性部分和/或其所结合的成分的变化（例如，活性部分和/或其所结合的成分的 裂解、信号的传输、或细胞中或受试者中的生物反应的增强或抑制）所测量）的药理学活性 分子或其部分。优选的药学活性部分是治疗性部分。
[0051] 示例性药理学活性部分可包含例如药物、抗体分子或其部分（例如，F(ab)、scFv、 VH结构域或VL结构域）的抗原结合片段（例如，为赋予、诱导或阻断生物反应）、受体的配 体结合部分或配体的受体结合部分、酶等。在一个实施方案中，药理学活性部分包含成熟形 式的蛋白质。在另一个实施方案中，药理学活性部分包含保留生物活性的全长蛋白的一部 分。其他示例性药理学活性部分包括治疗上有用的氨基酸、肽、蛋白质、核酸（包括但不限 于多核苷酸、寡核苷酸）、碳水化合物以及脂质。本发明的示例性药理学活性部分包括神经 营养因子、生长因子、酶、抗体、神经传递素、神经调节剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、成像 或可检测剂、同位素以及化学治疗剂等。本发明的药理学活性部分还包括当治疗剂被递送 至靶组织时可以被活化的药物、前药和前体。术语"药理学活性部分"不欲包括BBB转迁移 部分。药理学活性剂为非BBB转迁移部分。
[0052] 本发明的结合分子为"嵌合"或"融合"蛋白。所述蛋白包含连接至其本质上并不 天然连接的第二氨基酸序列的第一氨基酸序列。所述氨基酸序列可正常存在于集合在融合 多肽中的单独的蛋白质中，或者它们可正常存在于相同蛋白质中但以新的排列置于融合多 肽中。可使用本领域中众所周知的方法产生嵌合蛋白，例如，通过化学合成，或通过产生和 翻译以所需关系编码肽区域的多核苷酸。
[0053] 本发明的多肽为结合分子，S卩，其包含源自BBB转迁移抗体的结合域或结合位点。 BBB转迁移抗体促进与其连接的部分转迁移穿过BBB。示例性BBB转迁移抗体结合位点描 述于美国专利7, 943, 129中。在一个实施方案中，BBB转迁移抗体结合于TMEM30A。如本文 所用的术语"结合结构域"或"结合位点"是指介导与靶标分子的特异性结合的多肽的部分、 区域或位点（例如TMEM30A结合位点或促进BBB转迁移的其他位点）。示例性结合结构域 包括抗原结合位点（例如，VH和/或VL结构域）或包含这种结合位点的分子（例如，抗体 或单结构域抗体）。
[0054] 本发明的多肽关于BBB转迁移部分是单价或多价的，例如，包含至少1个、2个、3 个、4个、5个或更多个BBB转迁移部分。
[0055] 如本文所述的药理学活性部分还可包括例如源自抗体分子的结合结构域或结合 位点（例如，来自不会转迁移穿过BBB的抗体的VH和/或VL结构域）、包含这种结合位点 的分子（例如，抗体或单结构域抗体）、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或 催化结构域。如本文所用的术语"配体结合结构域"是指天然受体（例如，细胞表面受体） 或至少保留定性配体结合能力并且优选相应的天然受体的生物活性的其区域或衍生物。如 本文所用的术语"受体结合结构域"是指天然配体或至少保留定性受体结合能力并且优选 相应的天然配体的生物活性的其区域或衍生物。
[0056] 在一个实施方案中，本发明的多肽是修饰抗体。如本文所用，术语"修饰抗体"包 括合成形式的抗体，其被改变以使得其并非天然存在的，例如，包含至少两个重链部分但非 两个完全重链的抗体（例如，结构域缺失抗体或微型抗体（minibody));多特异性形式的抗 体（例如，双特异性、三特异性等），其被改变以结合于两种或更多种不同的抗原，例如，结 合于TMEM30A和接合于Fc部分、结构域、区域或scFc区域的治疗上相关的靶结合位点。
[0057] 如本文所用，术语"Fc区域"应定义为对应于天然免疫球蛋白的Fc区域的多肽部 分，即，如通过其两个重链的各自Fc结构域（或Fc部分）的二聚缔合而形成。天然Fc区 域为同型二聚的并包含两个多肽链。相比之下，如本文所用，术语"基因融合的Fc区域"或 "单链Fc区域"（scFc区域）是指如例如美国申请20110243966中所述的在单一多肽链内 基因连接（即，编码于单一连续基因序列中）的由Fc结构域（或Fc部分）构成的合成二 聚Fc区域。在一个实施方案中，当使用scFc区域时，结合分子关于BBB转迁移部分为单价 的。
[0058] 如本文所用，术语"Fc结构域"是指开始于铰链区中木瓜蛋白酶裂解位点正上游 (即IgG中的残基216,将重链恒定区的第一个残基定为114)并且结束于抗体的C端的单 一免疫球蛋白重链部分。因此，完全Fc结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构 域。如本文所用，术语"Fc区域"是指类似于天然抗体的Fc区域的二聚Fc结构域（例如， 无论是形成传统的两个多肽链形式或呈单链Fc区域形式）。
[0059] 如本文所用，术语"Fc结构域部分"或"Fc部分"包括Fc结构域或源自Fc结构 域的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc部分包含以下至少一者：铰链（例如，上部、中部 和/或下部铰链区）结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、或其变体、部分或片段。 在其他实施方案中，Fc部分包含完全Fc结构域（即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构 域）。在一个实施方案中，Fc部分包含与CH3结构域（或其部分）融合的铰链结构域（或 其部分）。在另一个实施方案中，Fc部分包含与CH3结构域（或其部分）融合的CH2结构 域（或其部分）。在另一个实施方案中，Fc部分由CH3结构域或其部分组成。在另一个实 施方案中，Fc部分由铰链结构域（或其部分）和CH3结构域（或其部分）组成。在另一个 实施方案中，Fc部分由CH2结构域（或其部分）和CH3结构域组成。在另一个实施方案中， Fc部分由铰链结构域（或其部分）和CH2结构域（或其部分）组成。在一个实施方案中， Fc部分缺乏CH2结构域的至少一部分（例如，CH2结构域的全部或一部分）。
[0060] 在一个实施方案中，本发明的结合分子包含完全Fc区域，无论是以一条多肽链 (scFc分子）形式存在或在野生型形式中以两条多肽链存在。
[0061] 特异性结合是指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特 征在于高亲和力和低至中等能力，与通常具有低亲和力与中等至高能力的非特异性结合相 区别。典型地，当亲和常数KA高于ΚΛΓ 1或更优选高于108Μ4时，结合被视为具特异性。必 要时，可通过改变结合条件在基本上不影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。本领 域技术人员可使用常规技术对适当结合条件进行优化，例如分子的浓度、溶液的离子强度、 温度、允许结合的时间、阻断剂（例如血清白蛋白、乳酪蛋白）的浓度等。
[0062] 在一个实施方案中，本发明的Fc部分包含本领域中已知为FcRn结合所需的Fc分 子的至少部分，本文称为新生儿受体（FcRn)结合伴侣。FcRn结合伴侣为可被FcRn受体特 异性结合的分子或其部分，随后FcRn受体活性转运所述FcRn结合伴侣。
[0063] 本发明的FcRn结合伴侣涵盖可被FcRn受体特异性结合的分子，包括全IgG、IgG 的Fc片段和包括FcRn受体的完全结合区域的其他片段。在另一个实施方案中，本发明的 结合分子的Fc部分结构域或区域被修饰以使得其展现与FcRn的结合减少、最小或无结 合。已经基于X射线结晶学描述了结合于FcRn受体的IgG的Fc部分的区域（Burmeister 等，1994, Nature372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2结构域和CH3结构域的交 界。Fc-FcRn接触点都在单一 Ig重链内。FcRn结合伴侣包括全IgG、IgG的Fc片段和包括 FcRn的完全结合区域的其他IgG片段。主要的接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、 250-257、272、285、288、290-291、308-311 和 314 以及 CH3 结构域的氨基酸残基 385-387、 428和433-436。对于免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的提及都是基于 Kabat 等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda, Md〇
[0064] 可以根据诸如定点诱变等公认程序来修饰IgG的Fc区域以得到将被FcRn结合的 修饰IgG或Fc片段或其部分。所述修饰包括与FcRn接触位点相距较远的修饰以及保持或 甚至增强与FcRn结合的接触位点内的修饰。例如，人IgGlFc(Fc γ 1)中的下列单个氨基酸 残基可以在Fc对于FcRn的结合亲和力无显著损失的情况下被取代：P238A、S239A、K246A、 K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、 L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、 E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、 D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、 E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、 M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、 N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、 R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A 和K447A，其中例如P238A表示在位置编号238处野生型脯氨酸被丙氨酸取代。
[0065] 某些上述突变可在Fc部分上赋予新的功能性。例如，一个实施方案包括N297A，从 而除去高度保守的N-糖基化位点。这种突变的作用在于减少糖基化，从而降低效应子功能 和/或免疫原性。作为由上述突变产生的新功能性的另一个实例，在一些情况下对于FcRn 的亲和力可能增加超过野生型。这种增加的亲和力可反映为增加的"开通"速率、降低的"关 闭"速率或增加的"开通"速率与降低的"关闭"速率。认为赋予FcRn增加的亲和力的突变 包括 T256A、T307A、E380A 和 N434A (Shields 等，2001，J. Biol. Chem. 276:6591)。
[0066] 在一个实施方案中，FcRn结合伴侣为包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID N0:)并且 任选地进一步包括选自 HQSLGTQ(SEQ ID NO:)、HQNLSDGK(SEQ ID NO:)、HQNISDGK(SEQ ID N0:)或VISSHLGQ(SEQIDN0:)的序列的多肽（美国专利No·5,739,277)。
[0067] 本领域技术人员应熟知展现改变的效应子功能和/或FcRn结合的许多其他Fc突 变体或其类似物。另外，对免疫球蛋白恒定区（例如聚乙二醇化）或其片段进行化学修饰的 方法（参见例如 Aslam 和 Dentl998，Bioconjugation:Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London)是本领域中众所周知的，例如在 美国申请20120003210中。
[0068] 在一个实施方案中，使用本领域中已知的方法，例如通过使通常糖基化的残基突 变或通过改变多肽的表达以便不发生糖基化，将BBB转迁移部分所连接的Fc部分、结构域 或区域无糖基化。作为实例，一个具体实施方案包括N297A突变，从而除去高度保守的N-糖 基化位点。在另一个实施方案中，Fc部分包括在位置299处的突变，例如，T299突变为另一 种氨基酸，如美国专利7, 863, 419中所述。除了丙氨酸之外，可在上文指定或本领域中已知 的位置用其他氨基酸取代野生型氨基酸以降低Fc功能。
[0069] 在另一个实施方案中，可将 Armour, K. L.，Clark, M. R.，Hadley, A. G.和 Williamson L.M. (1999)，Eur J Immunol29:2613-2624中所公开的突变引入主题结合分子 中。
[0070] 可将突变单独引入Fc中，产生一百种以上不同于天然Fc的Fc部分。另外，可一起 引入两种、三种或三种以上的这些单独的突变的组合，产生数百种以上潜在的Fc区域。此 夕卜，本发明构建体的一个Fc部分可进行突变，而另一个Fc部分完全未进行突变，或者它们 都可进行突变但具有不同的突变。
[0071] 本发明嵌合蛋白中还涵盖使用免疫球蛋白恒定区的至少一部分的肽模拟物，例 如，Fc片段的肽模拟物或FcRn结合伴侣的肽模拟物。在一个实施方案中，使用噬菌体展 示或通过化学文库筛选来鉴定肽模拟物（参见例如McCafferty等，1990, Nature348:552 ; Kang 等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:4363 ;ΕΡ0 589 877B1)。
[0072] 在另一个实施方案中，本发明的Fc区域（例如，scFc区域）包含本领域中已知为 Fc γ R结合所需的Fc分子的至少部分。
[0073] 在一个实施方案中，本发明的Fc区域（例如，scFc区域）包含本领域中已知为蛋 白质A结合所需的Fc分子的至少部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区域（例如，scFc 区域）包含本领域中已知为蛋白质G结合所需的Fc分子的至少部分。在一个实施方案中， 此种分子不结合于FcRn。
[0074] 如本文所述，本领域普通技术人员应了解，还可通过包括一个或多个氨基酸变化 (取代、添加或缺失）来修饰Fc结构域以使得其氨基酸序列相比于野生型Fc部分有所改 变。本领域中已知许多此类变化或改变。在某些示例性实施方案中，Fc部分保留效应子功 能（例如，Fc γ R结合），并且在某些实施方案中，Fc部分缺乏效应子功能或具有降低的效 应子功能。
[0075] 本发明的多肽的Fc结构域或部分可来自任何同种型（A、E、G或M)并且可源自不 同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域或部分可包含源自IgGl分子的CH2和/或 CH3结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，Fc结构域或部分可包含部分源自 IgGl分子并且部分源自IgG3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中，Fc结构域或部分可包 含部分源自IgGl分子并且部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
[0076] 可使用本领域中已知的技术制备包含本发明的接头肽的多肽。在一个实施方案 中，本发明的多肽为"重组产生的"，即使用重组DNA技术产生。用于制备本发明的多肽的示 例性技术更详细阐述于本文中。
[0077] 如本文所用，术语"药学上可接受的载体"意指可与活性成分组合并且在组合后 可用于向受试者施用所述活性成分的化学组合物或化合物。如本文所用，术语"生理学上 可接受的"酯或盐意指可与药物组合物的任何其他成分相容的酯或盐形式的活性成分， 其对待施用组合物的受试者无害。如本文所用，"药学上可接受的载体"还包括但不限于 下列一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润 滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解的组合物如明胶；水性媒介物和 溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂； 填充剂；乳化剂；抗氧化剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合物或疏水性材料。可包括 于本发明的药物组合物中的其他"额外成分"是本领域中已知的并例如描述于Genaro 编，1985,Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton, Pa.中， 其以引用的方式并入本文中。
[0078] 如本文所用，"有效量"为足以产生治疗反应的量。
[0079] 如本文所用，术语"蛋白质病"是指特征为错误折叠的蛋白质或聚集的蛋白质的病 症，所述病症具有遗传成分。
[0080] II.BBB转迁移抗体
[0081] 在一个实施方案中，BBB转迁移部分如美国专利7, 943, 129中所述。例如，在一个 实施方案中，BBB转迁移部分包含以选自由以下组成的组的序列所示的氨基酸序列：SEQ ID N0:58(FC5)、SEQIDN0:86(FC44)和SEQIDN0:87(FC7)，如美国专利 7,943，129中所述。 在一个实施方案中，BBB转迁移部分为FC5部分。FC5为源自骆驼科动物的重链抗体（HCA， 也称为双链、双链重链抗体、Vhh或单结构域抗体）。与也由骆驼科动物产生的常规IgG型四 链免疫球蛋白相比，这些抗体缺乏常规免疫球蛋白的轻链和CH1结构域。这些天然存在的 重链抗体的一个显著特征是Glu、Arg和Gly分别在其可变结构域（称为V。的VL界面位 置44、45和47(Kabat编号）的主要存在。常规四链抗体的重链的可变结构域（称为VH)中 的相同位置几乎无一例外地被Gly、Leu和Trp占据。与常规四链抗体的VH结构域的相对 不溶性相比，这些差异被认为是造成了骆驼科动物HCA可变结构域（V。的高溶解性和稳定 性。骆驼科动物Vhh结构域的两个更关键特征是其相对较长的CDR3和半胱氨酸对在CDR中 的高发生率。似乎半胱氨酸对介导二硫桥的形成并因此涉及调节抗体组合位点的表面拓扑 结构。在骆驼sdAb-溶菌酶复合物的晶体结构中，从sdAb突出并被CDR二硫键部分稳定的 刚性环延伸超出组合位点并深深地渗透入溶菌酶活性位点（Desmyter等，Nature Struct. Biol.,3, 803-811(1996)) 〇
[0082] 在一个实施方案中，ΒΒΒ转迁移抗体结合于TMEM30A(C6orf67、CDC50A)。结合 于TMEM30A的示例性部分是已知的或者可使用本领域中众所周知的方法制备。例如，包含 TMEM30A或其部分的氨基酸序列的氨基酸序列可用于制备特异性识别TMEM30A氨基酸序列 的抗体或者从结合位点文库中筛选特异性结合于TMEM30A的结合部分。来自所述抗体或源 自文库的结合位点可用于本发明的结合分子中。TMEM30A的氨基酸序列示于下 ：
[0083]

【权利要求】
1. 一种结合分子，其包含至少一个药理学活性剂和至少一个结合于TMEM30A的结合位 点，其中所述至少一个结合于TMEM30A的结合位点是i)直接地或ii)通过插入氨基酸序列 融合至Fc部分的N端。
2. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含至少两个结合位点。
3. 如权利要求1或2所述的结合分子，其中所述至少一个结合位点包含FC5氨基酸序 列。
4. 如权利要求1或2所述的结合分子，其中所述至少一个结合位点由FC5氨基酸序列 组成。
5. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含至少两个结合于TMEM30A的 结合位点。
6. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含至少三个结合于TMEM30A的 结合位点。
7. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含至少四个结合于TMEM30A的 结合位点。
8. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个TMEM30A结合位点是与所述Fc部 分直接基因融合。
9. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个TMEM30A结合位点是通过包含肽 接头的插入氨基酸序列与所述Fc部分基因融合。
10. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个TMEM30A结合位点是通过由肽接 头组成的插入氨基酸序列与所述Fc部分基因融合。
11. 如权利要求2所述的结合分子，其中两个TMEM30A结合位点是通过包含肽接头的氨 基酸序列与完全Fc区域的两个不同Fc部分的N端融合。
12. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个TMEM30A结合位点融合至scFc 分子的N端。
13. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂融合至所述Fc区 域的C端。
14. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂为小的化学实体。
15. 如权利要求13所述的结合分子，其中所述小的化学实体是在半胱氨酸残基处融合 至所述结合分子。
16. 如权利要求14所述的结合分子，其中所述半胱氨酸残基为工程改造的半胱氨酸残 基。
17. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂为多肽。
18. 如权利要求17所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂包含抗原结合位 点。
19. 如权利要求18所述的结合分子，其中所述抗原结合位点是源自非TMEM30结合抗 体。
20. 如权利要求19所述的结合分子，其中所述药理学活性剂选自由scFv分子、Fab分 子和单结构域抗体组成的组。
21. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂是基因融合至所 述结合分子。
22. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述至少一个药理学活性剂是共价连接至所 述结合分子。
23. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合位点是通过包含抗体分子的VH结构 域的插入氨基酸序列基因融合的。
24. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合位点是通过包含抗体分子的VL结构 域的插入氨基酸序列基因融合的。
25. 如权利要求23所述的结合分子，其中至少一个TMEM30A结合位点与完整抗体分子 的VH结构域的N端基因融合。
26. 如权利要求24所述的结合分子，其中至少一个TMEM30A结合位点与完整抗体分子 的VL结构域的N端基因融合。
27. 如权利要求1所述的结合分子，其中两个结合位点与完整抗体分子的VH结构域和 VL结构域的N端基因融合。
28. 如权利要求23或24所述的结合分子，其中所述插入氨基酸序列进一步包含肽接 头。
29. 如权利要求1所述的结合分子，其中所述药学活性剂选自由神经活性肽、小的化学 实体和结合于中枢神经系统中的靶标的抗体的可变区组成的组。
30. -种治疗神经病症的方法，其包括向受试者施用如权利要求1-29中任一项所述的 结合分子。
31. 如权利要求30所述的方法，其中所述神经病症为贮积病症。
32. 如权利要求30所述的方法，其中所述神经病症为慢性疼痛。
33. 如权利要求30所述的方法，其中所述神经病症为癫痫症。
34. 如权利要求30所述的方法，其中所述神经病症为多发性硬化症。
35. 如权利要求30所述的方法，其中所述神经病症为蛋白质病。
36. 如权利要求30所述的方法，其中所述病症为脱髓鞘病症。
37. -种如权利要求1-29中任一项所述的结合分子的用途，其用于制造供治疗神经病 症的药物。
【文档编号】A61P25/00GK104159922SQ201380004989
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2012年1月10日
【发明者】G.K.法林顿, W.西斯克 申请人:比奥根艾迪克Ma公司