牙科用种植体及其制造方法

牙科用种植体及其制造方法
【专利摘要】【问题】本发明的目的是提供牙科用种植体，在该牙科用种植体移植后，可在种植体周围形成功能性牙周组织。【解决方式】本发明的牙科用种植体的特征为：来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块配置在种植体的表面，配置细胞块的种植体的表面，是种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的表面的全部或部分。
【专利说明】牙科用种植体及其制造方法

【技术领域】
[0001] 本发明是有关牙科用种植体（implant)及其制造方法。更具体而言，是有关使得 能形成功能性牙周组织的牙科用种植体及其制造方法。

【背景技术】
[0002] 已知有各种治疗方式可使因蛀牙或牙周病而丧失的牙齿功能再度恢复。例如，已 知将金属或陶瓷等人工材料制作的假牙埋入牙根中的方法。此外，例如，在已完全丧失牙根 时，已知在健康的牙齿上架桥以放置假牙的方法。
[0003] 另外，近年来作为牙科取代医疗的尖端治疗法之一，是实施口腔种植体治疗。口腔 种植体治疗，是指将钛等人工牙根植入丧失牙齿部位的颌骨中的方式。
[0004] 不过，天然牙齿的牙根与牙科用种植体（人工牙根）存在很大的差异。因为天然 牙齿的牙根被为牙周组织的一部分的牙周膜覆盖，相对的在牙科种植体的移植部位，通常 没有牙周膜。
[0005] 在天然牙齿的周围，存在可连接牙根侧的牙骨质与外侧的牙槽骨的纤维状牙周膜 组织。牙骨质具有保护牙根面与使牙周膜附着在牙根面的功能。此外，已知牙周膜具有的 功能，可大体上划分为：1)咬合力的缓冲作用、2)牙齿的移动能力（牙科矫正治疗等使用的 力学）及3)将咬合及矫正等侵害刺激（疼痛刺激等）传送到中枢神经系统的神经传达功 能等三种。其中，尤其是牙周膜为了缓冲牙齿的咬合力，已知具有相对于牙根长轴方向的垂 直方向走行的纤维，在此牙周膜组织中的纤维走行，己知为表达牙周膜功能的不可或缺的 必要构成。
[0006] 然而，在牙科用种植体移植时，种植体移植部位并不能形成如同存在于天然牙齿 周围的功能性牙周组织。因此，牙科种植体的移植部位，将因长时间使用的咬合力，引起支 撑该种植体的牙槽骨的吸收，而有不耐使用的问题。
[0007] 因此，在移植牙科用种植体之际，长期以来期望能够形成与天然牙齿相同的牙周 组织的技术。
[0008] 迄今，为了在移植后的种植体周围形成牙周组织，已有使用来自牙周组织的培养 细胞的研究。
[0009] <非专利文献1 >
[0010] 本文献公开采自老鼠牙周膜的来自前体细胞的培养细胞的利用。本文献公开将培 养细胞与基质胶（matrigel)同时涂布在经SLA处理的种植体。此外，本文献提及将此种植 体移植到老鼠的牙齿缺损部位时，形成牙周组织。
[0011] 但是，本文献中，在种植体周围形成的牙周膜的走行，是与种植体的长轴方向平 行，而与天然牙周膜不同。由于牙周膜的走行对于牙齿的咬合力的支撑具有重要意义，因此 具有这样的牙周膜的牙周组织，不能期待其具有支撑咬合力的功能。
[0012] <非专利文献2 >
[0013] 本文献中公开，将经釉基质蛋白（Emdogain，EMD)处理的钛种植体移植到颌骨，同 时将自牙周膜采集的PDL细胞注入移植部位的方法。此方法是意图形成种植体周围的牙周 组织，以釉基质（enamel matrix)蛋白作为主成分，且并用药剂。而且，本文献也提及与未 混入上皮组织的牙槽骨结合的组织之形成。不过，在已形成的牙周组织中，未确认牙周组织 之一的牙骨质结构。同时，也未确认牙周组织中的牙周膜之走行。
[0014] 如此迄今，仍无有关使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的报告。
[0015] [先前技术文献]
[0016] [非专利文献]
[0017] [非专利文献 l]Lin Y et. al_，J Dent Res. 2011Feb ;90 (2): 251-6, Epub2010Decl3.
[0018] [非专利文献 2] Craig RG et. al.，J Oral Implantol. 2006 ;32 (5) :228-36.


【发明内容】

[0019] (发明所欲解决的问题）
[0020] 本发明的目的是提供在牙科用种植体移植后，可在种植体的周围形成功能性牙周 组织的种植体。
[0021] (解决问题的方式）
[0022] 为解决上述问题，经本发明的发明人等深入研究，结果发现在牙科用种植体的表 面配置来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块，可在种植体移植后的种植体周围形成功 能性的牙周组织。
[0023] 亦即，本发明是有关一种牙科用种植体，该牙科用种植体使得能够形成功能性牙 周组织，其特征为：在前述种植体表面配置来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块，前述 种植体移植时，配置前述细胞块的前述种植体表面是被接受者的牙槽骨围绕的表面的全部 或一部分。
[0024] 此处，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述来自牙胚组织的细胞块为来自牙胚间叶组织或来自牙囊（dental follicle)组织 的细胞块。
[0025]此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述细胞块来自牙胚组织，前述牙胚组织为处于选自帽状期、钟状前期及钟状后期所组 成的组中的任何一个发育阶段。
[0026]此外，发明的使得能形成本功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述种植体是在种植体移植后可矫正的。
[0027]此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙利用种植体的一实施方案的特征 为：前述形成的牙周组织具有（i)具有功能性牙骨质及功能性牙周膜以及（ii)具有功能性 神经纤维之中的至少一种特征。
[0028]此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述种植体在种植体的全部或部分表面，进一步含有表面涂布剂的涂布层，使前述细胞 块配置在前述涂布层的表面上。
[002=此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述表面涂布剂选自轻磷灰石（hydroxyapatite)、α_磷酸三钓、β-磷酸三|丐及胶原 蛋白所组成的组。
[0030] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述种植体可促进牙槽骨的再生。
[0031] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的一实施方案的特征 为：前述种植体可改善牙槽骨的再生能力。
[0032] 然而，将以上所述的本发明的一种或多种特征任意组合的牙科用种植体，当然也 是本发明的牙科用种植体。
[0033] 此外，本发明的另一方面是有关使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制 造方法，其特征是：其中包含在前述种植体移植时，将来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细 胞块配置在被接受者的牙槽骨围绕的种植体的表面的全部或部分的步骤。
[0034] 此处，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：前述来自牙胚组织的细胞块为来自牙胚间叶组织或来自牙囊组织的细胞 块。
[0035] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：前述细胞块来自牙胚组织，前述牙胚组织为处于选自帽状期、钟状前期及钟 状后期所组成的组中的任何一个发育阶段。
[0036] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：在种植体移植后，前述种植体是可矫正的。
[0037] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：前述形成的牙周组织具有（i)具有功能性牙骨质及功能性牙周膜以及（ii) 具有功能性的神经纤维之中的至少一种特征。
[0038] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：在配置前述细胞块的步骤前，进一步包含在种植体的全部或部分表面形成 表面涂布剂的涂布层的步骤，其中前述表面是在种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的表 面，且前述细胞块配置在前述涂布层的表面上。
[0039] 此外，本发明的使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法的一实施 方案的特征为：前述表面涂布剂选自羟磷灰石、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙及胶原蛋白所 组成的组。
[0040] 然而，将以上所述的本发明的一种或多种特征任意组合的方法，当然也是本发明 的牙科用种植体的制造方法。
[0041] 此外，本发明的另一方面是有关对牙齿缺损的哺乳动物移植种植体的方法，其特 征是：包含将上述种植体移植到前述牙齿缺损部位的步骤。
[0042] 此外，本发明的对牙齿缺损的哺乳动物移植种植体的方法的一实施方案的特征 为：前述动物为非人类哺乳动物。
[0043] [发明的效果]
[0044]根据本发明的牙科用种植体，可在种植体移植后，于种植体周围形成功能性牙周 组织。
[0045] 然而，根据本发明的牙科用种植体，不仅可在种植体移植后在种植体周围形成功 能性牙周组织，也可促进种植体移植部位周边牙槽骨的再生。此外，根据本发明的牙科用种 植体，可改善种植体移植部位周边牙槽骨的再生能力。

【专利附图】

【附图说明】
[0046]图1A (上段）表示摘取自胎龄18天的C57/BL/6老鼠的牙胚、来自成年老鼠的天 然牙齿的影像。图1B(下段）表示自胎龄18天的C57/BL/6老鼠的牙胚分离的牙囊组织、 从来自成年老鼠的天然牙齿分离的牙周膜组织的影像。
[0047]图2表示对于牙周膜去除模型（model)移植牙囊组织之际，在移植后第21天的牙 周组织的HE染色像。HE染色像，是将颌骨的额断面（frontal section)切片染色的影像， 是自切牙方向朝后头部方向见到的影像。图2A表示未移植牙囊组织的对照区的HE染色 像，图 2B表示已移植牙囊组织区域的HE染色像。然而，图中的小星号（* )表示骨性愈着 (ankylosis)形成部位，D表示象牙质，AB表示牙槽骨，C表示牙骨质，PDL表示牙周膜。 [00 48]图3是本发明的一实施方案，表示在具有羟磷灰石（也称为HA)涂布层的种植体 的该涂布层上，已贴附牙囊组织的种植体（牙囊贴附（attched)HA种植体）的移植模型的 概略图。图3A表示天然齿列，图3B表示第一臼齿的拔牙及牙龈治疗，图 3C表示移植窝的 制作，图3D表示牙囊贴附HA种植体的移植。
[0049]图4表示本发明的一实施方案的已卷附牙囊组织的HA种植体（牙囊贴附HA种植 体）的立体像（左中图），及其GFP荧光像（右中图表示自侧面摄影的影像，右图表示自底 面摄影的影像）。此外，也表示了在卷附牙囊组织前的具有羟磷灰石涂布层的种植体（HA种 植体）的立体像（左图）。图4B表示HA种植体及牙囊组织贴附HA种植体移植后当下（左 图）与移植后第21天的CT影像（左中图、右中图、右图）。箭形记号表示牙周膜腔的形成。 [00 50]图5表示本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植后的牙周组织（下段）、 天然牙齿的牙周组织（上段），以及HA种植体移植后的周围组织（中段）的册染色像。 imp 表示种植体。
[0051 ]图6表示将本发明的一实施方案的贴附来自GFP老鼠的牙囊组织的HA种植体移 植到口腔内，移植后第21天的种植体周围的立体像、GFP荧光像及立体像与GFP荧光像重 合的图（上段的影像表示自舌侧的侧面摄影的影像、下段的影像表示自上颚侧（上方）摄 影的影像）。箭形记号表不种植体。
[0052]图7表示本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植之际形成的牙周膜的偶 氮卡红染色（azan stain)像（右图），及天然牙齿牙周膜的偶氮卡红染色像（左图）。 [0053]图8图表示将本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植之际形成的牙周组 织（下段），及天然牙齿的牙周组织（上段），利用扫描电子显微镜摄影的影像。
[0054]图9表示将本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植之际形成的牙周组织， 利用透射式电子显微镜摄影的影像。
[0055]图10表示本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植之际形成的牙周组织 中，利用X射线显微分析仪解析钛（Ti)、钙（Ca)及磷（P)的元素分布的影像（图1〇中的 上段的影像）。图10中下段的影像表示对应于已解析的各元素分布的影像（上段的影像） 的立体像的影像。
[0056]图11表示本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体移植之际形成的牙周组织 中，利用X射线显微分析仪解析钛（Ti)、钙（Ca)及磷（p)的元素分布的影像，及将该三元素 的分布影像重合的影像。
[0057]图I2表示在种植体移植后形成的牙周膜组织中的神经纤维解析所使用的种植体 移植模型中，切牙、臼齿与种植体的位置关系的模式图。
[0058]图13A表示在本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体、天然牙齿、HA种植体上 施加矫正力的试验中，将矫正前及矫正后的影像重合的图像。图13B表示施加矫正力之际 的天然牙齿、移植后的HA种植体及移植后的牙囊贴附HA种植体的移动距离的图形。
[0059]图14表示在本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体、天然牙齿、HA种植体上 施加矫正力之后，第6天的压迫侧的骨吸收标记（marker) (CSF-1)及牵引侧的骨形成标记 (Ocn)的表达，以原位杂交（in situ hybridization)进行解析的切片影像。图中，箭形记 号表示CSF-1的表达部位，箭头表示〇cn的表达部位。
[0060] 图I5表示在本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体、天然牙齿及HA种植体的 周围的牙周膜区域中，观察末梢神经标记的神经丝（Neuro Filament)的表达时的影像（相 位差像、荧光像及相位差像与荧光像的重合影像）。
[0061] 图16表示对于本发明的一实施方案的牙囊贴附ha种植体、天然牙齿及HA 种植体的周围的牙周膜，以矫正力施加侵害刺激，2小时后通过原位杂交（in situ hybridization)对在三叉神经脊束核（nucleus tractus spinalis trigemini)表达的 c-Fos蛋白质进行解析的切片影像。图中，箭形记号表示c-F〇S蛋白质的表达部位，T表示 三叉神经脊束核。
[0062] 图17上段表示三壁性骨缺损模型的制作步骤的模式图。此外，图17下段表示三 壁性骨缺损模型的立体照片、三维结构的微CT影像（三维CT影像）及微CT影像（额断面 及水平断面（horizontal section))。图17Α表示第一臼齿的拔牙以及骨治疗，图17Β表示 三壁性骨缺损的制作，图17C表示种植体的移植。
[0063] 图18表示对三壁性骨缺损模型移植本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体 (下段）或HA种植体（中段）之际，移植日（第0天）以及自移植日起第14天、第28天及 第50天的三壁性骨缺损模型的牙槽骨的三维CT影像。此外，图18上段表示未对三壁性骨 缺损模型移植种植体等时的三壁性骨缺损模型的牙槽骨的三维CT影像。图中的箭形符号 表示牙槽骨已再生至原来的高度。
[0064] 图I9表示对三壁性骨缺损模型移植本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体之 际，移植日（第〇天）以及自移植日的第14天、第28天及第50天的牙槽骨的微CT影像 (上段：矢状断面、中段：水平断面、下段：额断面）。图中的箭头表示牙周膜腔状的间隙。
[0065] 图20表示对三壁性骨缺损模型移植本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体或 HA种植体之际，自移植日起第50天的牙槽骨的再生量的比例图。此外，作为对照，还表示了 未移植种植体的三壁性骨缺损模型中的牙槽骨的再生量的比例。图形中1〇〇%表示牙槽骨 缺损前的状态的牙槽骨的量。
[0066] 图21表示对三壁性骨缺损模型移植本发明的一实施方案的牙囊贴附HA种植体 (下段）或HA种植体（中段）之际，移植日（第0天）及第 5〇天的牙槽骨之矢状断面的截 断面（cross-sectional)影像。此外，作为对照，还表示了将HA种植体移植至牙槽骨侧面 未缺损的一般牙槽骨（上段）之际，移植日（第〇天）及第 5〇天的牙槽骨的矢状断面的截 断面影像。
[0067]图22表示对三壁性骨缺损模型移植本发明的一实施方案的牙囊贴附Μ种植体或 ΗΑ种植体之际，自移植日起第50天时，种植体埋入牙槽骨内的量的图形。此外，作为对照， 表示将ΗΑ种植体移植至牙槽骨侧面未缺损的一般牙槽骨之际，自移植日起第 50天时种植 体埋入牙槽骨的量的图形。

【具体实施方式】
[0068]与本发明相关的牙科用种植体，其特征是：是使得能形成功能性牙周组织的牙科 用种植体，其中使来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块配置在种植体的表面，配置细 胞块的种植体的表面是在种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的表面的全部或一部分。 [0069] 「种植体」，是指一般对人类或动物以医疗为目的而使用的埋入活体内的器具。本 说明书中，「种植体」尤其是指取代缺失的牙齿而埋入颌骨中的牙科用人工牙齿。
[0070] 本发明中使用的种植体的材料，只要是对活体无害、具有生物亲和性、可耐咬合的 高强度材料即可，可使用常规作为种植体材料使用的任意材料。种植体的材料，可列举：例 如金属制、金属合金制、塑料（plastic)材料制、陶瓷制、复合材料、骨替代材料等。
[0071] 本发明中可使用作为种植体的金属及金属合金，可列举：例如钛、钢铁、铁、合金 钢、铁合金、钛合金、CoCr合金、银、铜、钙、镁、锌等。
[0072]本发明中可使用作为种植体的塑料材料，可列举：例如聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙 稀、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺类、聚氨酯类、聚硅氧烷类、聚硅氧烷弹性体类、聚醚醚 酮类、聚砜类、多糖类及聚乳酸类等聚合物。
[0073]可使用作为本发明中的种植体的陶瓷材料，可列举：例如氧化铝、氧化锆、氧化钛、 氧化桂等氧化物或氮化物，例如，如羟磷灰石的磷酸钙、玻璃及玻璃陶瓷，并优选为可在生 理的条件下溶解或分解的玻璃及玻璃陶瓷等。
[0074]本发明的种植体中使用的材料，就生物适合性或力学的适合性而言，更优选为钛 或钛合金。此外，骨替代材料，可列举：例如自体牙齿、可自同种个体获得的牙齿，或可自异 种个体获得的牙齿等。
[0075]本发明中使用的种植体的形状或大小，可配合将要移植的牙齿缺损部位，由本领 域技术人员适宜设计。
[0076]此外，本发明的一实施方案中的牙科用种植体，可在其表面上形成表面涂布剂的 涂布层。
[0077]本说明书中的「表面涂布剂」，是指在细胞块附着在种植体时形成支架 (scaffold)所使用的那些。在种植体表面形成的表面涂布剂的涂布层，可提高细胞块对种 植体的附着。
[_]本发明中侧的麵涂布剂，可卿：例娠織石、a -TCP (麵三0 )、β -TCP 或胶原蛋白等凝胶材料。 尤其经憐灰石具有促进骨形成的生物活性，可促进种植体移植后的种植体周围的 牙月质的形成，或促进种植体对骨的着生（engraftment)。就此而言，羟磷灰石优选使 为表面涂布剂。 本发明的种植体的材料,可使用例如轻磷灰石等与表面涂布剂相同效果的 材料作为种植体的材料。此时，种植体整体具有与麵涂布剂的涂布层相同的层，可在种植 体表面上直接配置来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块。或者，可将与种植体材料不 同的表面涂布剂涂布在种植体表面上，再将细胞块配置在其表面上。
[0081] 表面涂布剂可以以覆盖种植体的全部或部分的表面方式进行涂布，其中所述表面 在种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕。此外，表面涂布剂的涂布层，是以介于种植体与配 置在种植体的细胞块之间的方式形成。
[0082] 种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的表面上，是指种植体的表面上，在移植种 植体后被埋入接受者的牙齿缺损部位内的部分。此部分将来可与接受者的牙周组织连结。
[0083] 表面涂布剂的涂布方法，可应用本领域技术人员已知的方法进行。
[0084] 例如，在将轻磷灰石涂布在种植体之际，可应用蒸镀（vapor deposition)、等离子 喷涂（plasma spraying)法等进行。表面涂布剂的层厚度或表面涂布剂的涂布范围，本领 域技术人员可视作为涂布对象的种植体或移植者的缺损部位而适宜设计。本发明的一实施 方案中，例如可使涂布层的厚度为lum至2μιη。
[0085] 此外，除了如上述的使表面涂布剂在种植体表面形成涂布层之外，也可使用市售 的已涂布羟磷灰石等表面涂布剂的种植体。
[0086] 「牙周组织」，是指主要在牙齿的外层形成的牙骨质、牙周膜、牙槽骨及牙龈所构成 的组织。因本发明的种植体移植而形成的牙周组织，特别地是牙骨质、牙周膜及牙槽骨。在 本发明的种植体移植后形成的牙骨质及牙周膜，可通过与接受者的牙槽骨或牙龈连结而形 成牙周组织。
[0087] 牙骨质、牙周膜及牙槽骨，可以通过组织染色而容易鉴定形态。染色方法，可使用 例如通常的苏木精-伊红染色（HE，hematoxylin-eosin staining)。在进行组织染色时， 本领域技术人员例如经过以4%多聚甲醛（paraformaldehyde :PFA)将试样品固定、以10% 乙二胺四乙酸（ETDA)脱|丐（decalcifying)、石蜡包埋、然后制作厚度1〇 μ m的连续切片等 步骤后，即可进行HE染色。此外，本领域技术人员除了上述例示以外，也可依照一般的方法 进行组织染色，进行组织学的评估。
[0088] 本说明书中的「牙胚」，是指已确定将来会长成牙齿的牙齿的初期胚，是指牙齿的 发育阶段中一般使用的蕾状期（bud stage)、帽状期（cap stage)至钟状期（bell stage) 的阶段的那些组织，尤其是指作为牙齿的硬组织的特征的象牙质、釉质的蓄积尚未能确认 的组织。
[0089] 本发明的一方面中，作为本发明中可使用的牙胚组织，可使用帽状期、钟状期前 期、钟状期后期的牙胚。这些帽状期、钟状期前期、钟状期后期的牙胚，在与种植体同时移植 时是优选的，因为它们对于功能性的牙周组织具有高分化能力。尤其以使用钟状期前期的 牙胚为更优选的。优选的是来自钟状期前期牙胚的细胞块，因为它可进一步促进随着功能 性牙周组织的形成的牙骨质的形成。
[0090] 此外，例如为老鼠时，胎龄13至15天相当于帽状期，胎龄16至18天相当于钟状 前期，胎龄19天至出生后相当于钟状后期。
[0091]此外，作为本发明中可使用的牙胚，也可使用通过细胞培养技术人工形成的「再生 牙胚」。在使用再生牙胚时，可采集优选的发育阶段的细胞块。本发明中使用的再生牙胚，可 以疋任何方法制作的牙胚，例如可通过包含使头质上以间充质细胞（mesenchymal cell)构 成的第1细胞集合体与实质上以上皮细胞构成的第2细胞集合体紧密接触的配置的步骤、 以及以支撑载体的内部培养第1及第2细胞集合体的步骤的方法制作。
[0092] 再生牙胚的制造方法，已记载于例如国际公开第2006/129672号公开小册、日本 特开20〇8_29756号公报、日本特开2008-206500号公报、日本特开20〇 8_2〇0033号公报、日 本特开2〇〇8_ 29757号公报、国际公开第2011/056007号公开小册、国际公开第2011/056008 号公开小册中说明，通过引用已将这些文献的公开的全部并入在本说明书中。
[0093] 牙胚及其他的组织，除了哺乳动物的灵长类（例如人类、猴等）、有蹄类（例如猪、 牛、马等）、小型哺乳类的啮齿类（例如小鼠、老鼠、兔等）之外，也可采自狗、猫等各种动物 的颌骨或牙周组织等。牙胚及组织的采集，以及自牙胚的组织的分离，通常所用的采集组织 的条件可以直接适用于以无菌状态取出，并保存在适当的保存液中即可。然而，人类的牙 胚，虽然除了所谓第3大臼齿的智齿的牙胚以外，也可举出胎儿牙胚，但就自体组织的利用 而言，优选使用智齿的牙胚。
[0094] 本说明书中的「细胞块」，是指可配置在种植体表面的来自牙胚组织或牙周膜组织 的细胞块。同时，细胞块是其来源组织的全部或一部分，至少可部分性维持形成组织的细胞 之间的功能性结合。
[0095] 可使用于本发明中的来自牙胚组织的细胞块中，含有牙胚间叶组织、牙囊组织等。 牙胚间叶组织存在于蕾状期、帽状期或钟状期前期的牙胚中。此外，牙囊组织存在于钟状期 前期和钟状期后期的牙胚中。此外，本发明中使用的牙周膜组织，可取自完整的牙齿。自牙 胚组织分离牙胚间叶组织、牙囊组织，及自完整的牙齿分离牙周膜组织，通常采集组织所用 的条件可以直接适用于以无菌状态取出它们，并保存在适当的保存液中即可。此时，也可使 用酶，以容易进行分离。酶，例如有分散酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等。
[0096] 同时，细胞块，也可将自活体摘出的组织经物理性切断成数块细胞块后使用。此 时，细胞块优选切断成为可部分性保持形成组织之际的细胞间的功能性结合的样态。尤其 优选地是切断后的细胞块保持可区别组织外侧及组织内侧的形状。如此则本发明中使用的 细胞块，因部分具有组织形成之际的细胞之间的功能性结合，在与种植体同时移植之际，可 形成具有正常功能的牙周组织。此外，切离的细胞块的形状，只要具有容易配置在种植体表 面的形状，即无特别的限制，例如，可切离成短笺状（strips)的细长条。通常被用来采集组 织的条件可以直接适用于这样的细胞块的切离。
[0097] 在种植体的表面上配置细胞块的方法，并无特别的限制。例如，可将切离成短笺状 的细胞块以不使细胞块相互重叠（overlap)的方式贴附在种植体的表面上。或是，以不使 细胞块相互重叠的方式卷附在种植体的表面上而配置。此时，使已贴附细胞块的种植体在 大气中稍微干燥，即可提高粘附性。此外，在种植体的表面上具有表面涂布剂的涂布层时， 可将细胞块配置在表面涂布剂的涂布层的进一步的表面上。
[0098] 本发明的一方面中，将细胞块配置在种植体表面上的位置，可配置在种植体移植 后被接受者的牙槽骨围绕的表面上的全部或部分。此外，优选地配置在种植体移入接受者 的牙槽骨的范围。此外，优选地配置成使细胞块中形成组织内侧的侧面接触种植体表面的 样态。通过如此配置，使形成组织外侧的侧面，面向接受者的牙槽骨。
[0099] 此外，本说明书中，例如将己配置牙囊细胞的种植体称为牙囊贴附种植体。
[0100] 此外，本发明的另一方面是提供一种种植体的移植方法，其中包含将以本发明相 关的种植体的制造方法制造的种植体，移植到牙齿的缺损部位的步骤。
[0101] 通过本发明相关的种植体，在种植体移植后，即可在种植体周围形成功能性的牙 周组织。
[0102] 本发明相关的将种植体移植到口腔内牙齿缺损部位的方法，优选地配置在种植体 的来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块中，使形成组织内侧的侧面与种植体的表面接 触。藉此，使形成组织外侧的侧面，面向接受者的牙周组织配置。如此，因使来自牙胚组织 或来自牙周膜组织的细胞块近似于存在于实际的天然牙齿的牙周组织的状态，而可促进功 能性牙周组织的形成。
[0103] 此外，缺损部位，是指因拔牙等而设置在牙龈中的部分，其形状并无特别限制。只 要可埋设本发明的种植体，对于缺损处、目标牙齿的种类则无特别限定。
[0104] 缺损部位通常位于颌骨、口腔的牙槽骨等。此外，如因随着牙齿的丧失而使牙槽 骨量降低时，也可由针对缺损部位以GTR法（guided tissue regeneration;组织再生诱导 法）等，为埋设种植体而通过临床使用的己知方法进行骨的再生，而使骨的量增加。在配置 到作为种植体对象的缺损部位之后，优选地依照通常的处理进行缝合等。
[0105] 此外，在将种植体移植到缺损部位之际，为防止贴附在种植体表面上的细胞块自 表面剥离，也可以外科手段使缺损部位形成具有比种植体直径稍大的直径。在将种植体移 植到具有这样大直径的缺损部位时，可使移植后的种植体与接受者的牙槽骨之间的空间充 满来自周围组织的血液。
[0106] 在与本发明相关的种植体的移植方法中，优选使移植对象与自其中摘出用于制造 种植体的牙胚组织或牙周膜组织的动物同种，进一步优选地，使移植对象与摘出牙胚组织 或牙周膜组织的个体为同一个体。动物可举出包含人类、牛、马、猪、狗、猫、老鼠等哺乳动 物。优选的是非人类哺乳动物。
[0107] 种植体的移植部位，本领域技术人员可容易地由目视或CT影像等观察形态。CT影 像或CT断面像，可通过使用本领域技术人员已知仪器而容易地进行摄影。在CT摄影中，可 使用例如用于实验动物的3D微)(射线CT R_mCT(Rigaku)等，例如可于90kV、150mA、断层厚 10mm的条件下进行。此外，本领域技术人员可在CT摄影后使用适当的影像解析软件，进行 影像构筑及解析等。影像解析软件，可使用：例如小动物用影像归档软件(filing software) i-VIEW型R及高分辨率3D/4D影像解析软件Imaris(Bitplane)。此外，除了上述例示之 夕卜，本领域技术人员也可使用类似的仪器设定适当的条件，利用相似的影像解析软件，进行 CT摄影及解析。
[0108] 根据本发明的种植体，在移植到接受者后，可于种植体周围形成功能性牙周组织。 本发明中的功能性牙周组织，是指（i)具有功能性牙骨质及功能性牙周膜，或（ii)具有功 能性神经纤维的牙周组织，并优选地是指兼具（i)及（ii)的两项特征的牙周组织。
[0109] 亦即，功能性牙周组织，例如，可以通过是否具有功能性牙骨质及功能性牙周膜进 行评估。功能性牙骨质及功能性牙周膜，可以通过例如在以HE染色、偶氮卡红染色等进行 组织学的分析之际，确认是否具有与天然牙齿的牙周组织同等的层结构进行评估。此处，天 然牙齿的牙周膜，通常具有相对于牙根的长轴方向的垂直方向伸展的牙周膜纤维。此牙周 膜，尤其是担当支撑牙齿的咬合力的重要角色。所以，通过解析是否与天然牙齿同样地形成 相对于种植体的长轴方向垂直伸展的牙周膜纤维，尤其可评估牙周膜的功能。牙周组织形 态的解析或牙周膜的伸展的解析，除了上述方法之外，也可应用例如扫描电子显微镜或透 射式电子显微镜观察其形态。此外，为了确认牙周组织中的硬组织-纤维性组织-硬组织 的三层结构，例如通过使用X射线显微分析仪解析元素的分布，可确认牙周组织的层结构。
[0110] 另外的方法，可如下述实施例4中所述，进行相对于矫正力的负荷的骨再构筑 (bone remodeling)的功能。或是,可通过解析移植后的种植体可否因矫正力的负荷而移动 以进行评估。在评估骨再构筑时，可以例如解析矫正力负荷后的骨形成标记及/或骨吸收 标记的表达而进行评估。本发明的种植体移植之际形成的牙周组织，在施加与天然牙齿相 同的矫正力时，与天然牙齿比较，具有68%以上的移动量，并优选具有80%以上的移动量。
[0111] 此外，功能性牙周组织，可以通过是否具有功能性神经纤维进行评估。功能性神经 纤维，是指对于牙周组织有刺激等时，可将刺激传达到中枢神经系统的神经纤维。神经纤维 是否具有功能性，可通过例如下述实施例6中所述的方法，对评估对象的牙周组织以矫正 力负荷施加刺激后，解析三叉神经脊束核（trigeminal tract nucleus)中的c-fos的表达 以进行评估。
[0112] 此外，根据本发明的牙科用种植体，不仅可形成功能性牙骨质或牙周膜，也可促进 牙槽骨的再生，并改善牙槽骨的再生能力。本说明书中的「改善牙槽骨的再生能力」，是指在 如部分牙槽骨缺损的移植部位中，通过移植与本发明相关的牙科用种植体，与常规的种植 体移植的情形或未移植种植体的情形比较，可使牙槽骨再生成近似于牙槽骨的原来形状之 意。由此，与本发明相关的牙科用种植体，可防止种植体移植后因牙槽骨的部分缺损而逐渐 落入牙槽骨内的状况，而可维持移植后的种植体的位置（例如，高度）或方向等。
[0113] 此外，本说明书中使用的用语，是为说明特定的实施方案而使用，并无限定发明的 意图。
[0114] 此外，本说明书中使用的「包含」的用语，除根据文中前后逻辑应做明显不同的理 解的情况以外，意指存在所述的事项（构件、步骤（阶段）、要素、数字等），并不排除存在除 此之外的事项（构件、步骤（阶段）、要素、数字等）。
[0115] 只要无不同的定义，此处使用的所有用语（包含技术用语及科学用语），具有与本 发明的所属技术的领域的技术人员广为理解的相同的意思。此处使用的用语，只要无明示 不同的定义，则应解释为具有与本说明书及相关【技术领域】中的含义一致的含义，不能解释 为理想化或过度形式上的含义。
[0116] 本发明的实施方案可以是参照模式图进行说明的情形，如为模式图时，为能明确 说明也有夸张表达的情形。
[0117] 第一、第二等的用语是为表达各种的要素而使用，但可理解这些要素并不受限于 这些用语。这些用语是仅为区别一个要素与其他的要素而使用，例如，可将第一要素记为第 二要素，同样的，将第二要素记为第一要素，并不脱离本发明的范围。
[0118] 本说明书中，为表示数值范围等而使用的数值，如无特别的明示，可解释为包含用 语「大约」之意。例如，「10倍」，如无特别的明示，可理解为「大约10倍」之意。
[0119] 本说明书中引用的文献，其中的所有公开均为本说明书中所援用，本领域技术人 员依照本说明书的上下文，不脱离本发明的精神及范围，援用这些先前技术文献中相关的 公开内容作为本说明书的一部分以进行理解。
[0120] 以下，参照实施例更详细说明本发明。不过，本发明可由各种方面而更具体实现， 不能解释为受限于此处所述的实施例。
[0121] [实施例]
[0122] <实施例1.由牙周膜去除模型的牙囊组织移植解析牙周组织形成能力>
[0123] (牙囊组织的制备）
[0124] 本实验中的牙囊组织，是得自钟状期的胎龄18天的C57/BL/6老鼠。具体上，牙 囊组织是由将成为下颌第一白齿的牙胚分离。牙胚的摘出，是依照Nakao等的方法（Nakao K，et al. Nat Methods. 2007 ;4(3) :227-30.)进行。
[0125] 自摘出的胎龄18天的牙胚摘出牙囊组织的方法，如下述进行。以含有Ca2+及Mg2+ 的PBS(-) (phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲生理盐水）清洗牙胚二次后，使用 100U/mL胶原蛋白酶I(Worthington，Lakewood，NJ)以室温进行2分钟的酶处理。然后，在 含有20U/mL脱氧核糖核酸酶I(DNase I) (Takarabio,滋贺，日本）的胎牛血清（Fetal calf serum) (FCS ;Hyclone, Logan，UT)及已添加 100U/mL 盘尼西林（penicillin)、100mg/mL 链 霉素（streptomycin) (SIGMA，St.Louis，M0)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium) (DHVIEM，WAK0,大阪，日本）中，以 25G 针（NN-2516R，Terumo,东京， 日本）物理性地将组织分离。自老鼠胎龄18天的牙胚分离的牙囊组织，具有囊状的形态 (参照图1)。
[0126] (牙周膜去除模型的制作及牙囊组织的移植）
[0127]为解析牙周膜去除部位中的牙周组织形成能力，以Saito等的方法（Saito M，et al. J Biol Chem.2〇ll ;286(44)，38602-13·)，去除 4 周龄的 C57/BL/6 老鼠的第二臼齿的 牙周膜（牙周膜去除模型）。更具体言之，是在深度麻醉下的老鼠中，通过程序上的问题 (procedural issue)而方便地将下颌第一臼齿拔牙。然后，自邻接在第一臼齿的第二臼齿 的齿槽间隔（alveolar s印turn),使用25G针（NN-2516R，Terumo,东京，日本）将第二臼齿 的颊侧侧面的牙周膜物理性地去除。
[0128] 将自胎龄1S天的老鼠牙胚分离的牙囊组织，物理性地切离形成短笺状的多个细 胞块。接着，通过以使形成牙囊组织的内侧的细胞块的侧面朝向已去除牙周膜的第二臼齿 牙根侧的方式贴附在牙周膜去除部位而进行移植。此时，使各别细胞块不重叠地贴附在牙 周膜除去部位。移植后第21天将颌骨摘除，以HE染色进行牙囊组织移植部位的组织解析。 [0129]在未移植牙囊组织的对照区上，发生骨性愈着（ankylosis)，在该骨性愈着中，除 去牙周膜部位的牙周膜组织的大部分充满了骨状组织（第2图A的小星号）。相对于此，己 移植牙囊组织的区域，则形成正常的牙骨质与牙周膜。此外，在已移植牙囊组织的组中，确 认具有相对于牙根的长轴方向垂直伸展的牙周膜组织，已形成与天然牙齿同等的牙周组织 结构（图2A及图2B)。由此可显示，牙囊组织可形成由牙骨质、牙周膜组织、及牙槽骨构成 的牙周组织的全部组织，在牙周膜损伤部位中也可形成牙周组织。
[0130] <实施例2·通过已贴附牙囊组织的种植体的移植评估牙周组织形成能力>
[0131](种植体的制备）
[0132]移植用的种植体形体（form)，是将直径0.6mm的钛线（株式会社Nilaco,东京，日 本）切出1.7_的长度，在离根尖方向侧大约〇.5mm成形为圆锥形即制成。种植体形体的 表面以真空蒸镀进行羟磷灰石的涂布，通过覆盖厚度2 μ m的羟磷灰石层，制成涂布羟磷灰 石的种植体形体（以下，称为HA种植体）（山八齿材工业株式会社，爱知县，日本）
[0133]以与实施例1相同的方法，在HA种植体周围，卷附自胎龄18天的C57BL/6老鼠摘 出的牙囊组织（以下称为牙囊贴附HA种植体；图4A)。此外，牙囊组织是使用以外科切离的 多个短笺状的细胞块。对HA种植体的细胞块配置，是以不使细胞块之间重叠的方式卷附。 此外，使形成牙囊组织内侧的细胞块的侧面，与HA种植体的表面接触（adhered to)。
[0134](移植牙囊贴附HA种植体至颂骨及着生评估）
[0135] 将4周CWBL/e老鼠的下颌第一臼齿拔下，设置牙齿缺损部位，设计4至5天间的 牙龈治愈期。然后，进行下颌第一臼齿的拔牙部位的牙龈切开、剥离。利用牙科用微马达 (Viva-Mate Plus，Nakanishi，东京，日本）及牙科用铰刀（MANI，栃木，日本）切削牙齿缺 损部位的牙槽骨，形成直径0. 9mm、深度1. 2mm的移植窝。将上述制作的牙囊贴附HA种植 体移植在移植窝中。也制作移植未卷附牙囊组织的HA种植体的对照区。以8-0尼龙缝合 线（Bear Medic，千叶，日本）缝合种植体移植部位的牙龈（图3)。各移植种植体形体的老 鼠，在移植后当下及移植后第21天进行微CT摄影（In vivo Micro X-ray CT System ；R_ mCT，株式会社Rigaku，东京，日本）。影像数据是使用集成影像处理软件（i-VIEW-3DX，株式 会社Morita，大阪，日本）随着时间的变化评估种植体与接受者的牙槽骨的结合。此外，在 移植后第21天，自接受者老鼠摘出含有种植体的颌骨，以HE染色进行组织学评估。
[0136]移植后第21日，在已移植HA种植体的对照区中，呈现出牙槽骨直接结合在种植 体表层的骨整合（osseointegration)(图4B及图5)。相对于此，在贴附牙囊组织的HA种 植体中，在种植体表层与周围牙槽骨之间确认有牙周膜腔（图4B下段、右中图中的箭形记 号）。此外，在贴附牙囊组织的HA种植体中，在HE染色图像中，由种植体表层可确认诸如牙 骨质、牙周膜、牙槽骨等与天然牙齿的牙周组织同等的组织结构（图 5)。
[013 7 ]并且，为确认形成的牙周组织是来自与种植体同时移植的牙周组织，而同样制作 并移植已贴附来自GFP老鼠（C57BL/6_Tg(CAG-EGFP)老鼠（日本LSC株式会社，日本）的 牙囊组织的HA种植体形体，观察移植部位。移植部位，是利用荧光立体显微镜 （Axi〇Lumer， Carl ZeiSS，Jene，德国），对GFP发色进行摄影。其结果是，第 21天在种植体周围的牙周 膜、牙槽骨区域观察到来自GFP老鼠的组织的形成（图6)。由此可显示，通过贴附牙囊组织 的种植体的移植，具有伴随牙周组织形成而着生于接受者颌骨的可能性。
[0138] <实施例3.种植体移植后形成的牙周组织的解析>
[0139]如实施例2中所示，牙囊贴附HA种植体的移植，形成着生于颌骨的牙周组织。此 处，为解析牙囊贴附HA种植体移植后形成的牙周膜的伸展，将天然牙齿的牙周组织、牙囊 贴附HA#植体移植后第21天的种植体周围的牙周组织、以及未卷附牙囊组织的ha种植体 移植后第 21天的种植体周围的牙周组织，以偶氮卡红染色后，解析牙周膜的伸展。
[01^0]此外，为解析牙囊贴附Μ种植体移植后形成的牙周组织的形态，通过扫描电子显 微镜及透射式电子显微镜观察牙囊贴附ΗΑ种植体移植后第28天的种植体周围的牙周组 织，以解析种植体移植后形成的牙周组织的形态。
[0141]并且，为确认牙囊贴附ΗΑ种植体移植后形成的牙周组织中，是否形成硬组织-纤 维性组织-硬组织的三层结构，对于牙囊贴附從种植体移植后第28天的种植体周围的牙 周组织，进行使用X射线显微分析伩的钛 （Ti)、钙（Ca)及磷（ρ)的元素分布的解析。
[0142](由偶氮卡红染色解析牙周膜的伸展）
[0143]以与实施例2相同的方法，将牙囊贴附HA种植体移植到4周龄C57BL/6老鼠的下 颌第一曰齿缺损部位。移植后第2丨天将颂骨摘出，将颌骨在4%多聚甲醛溶液中进行固定 24小时。然后，使用10%甲酸柠檬酸钠及22· 5%甲酸脱钙液进行72小时的脱钙操作。脱钙 操作之后，进行颌骨的石蜡包埋。包埋后，利用冰冻切片机（CM3050S ;LeiCa microsystems) 将颌骨制作成6ym厚的切片。
[0144] 接着，将制作成6 μ m厚的石蜡切片，浸渍在二甲苯中6分钟。然后，在100%、90%、 70%乙醇中分别浸渍3分钟去除石蜡。对已去除石蜡的切片，以流水冲洗5分钟使其与水 平衡（accustomed to)之后，浸溃在10%三氯醋酸·10%重铬酸钾中15分钟。再以流水冲 洗切片之后，浸溃在偶氮胭脂红G(azocarinin e G)液中30分钟，使核以及细胞质染色。以流 水将偶氮胭脂红清洗之后，在苯胺?乙醇中进行10秒的浸渍分离，在醋酸乙醇中浸渍1分 钟后停止分离。分离停止后以流水清洗切片，浸渍在5%磷钨酸（phosphotungstic acid) 中1小时。浸渍后，再度以流水清洗之后，浸渍在苯胺蓝?金橙G混合液中10分钟，使牙周 膜纤维染色。最后以100%乙醇进行分离，在二甲苯中浸渍6分钟使澄清。然后，利用四氢 大麻酸（marinol)封入以实施组织解析。
[0145] 移植牙囊贴附HA种植体后，第21天在种植体周围形成的牙周膜组织，有如同天然 牙齿的牙周膜的伸展，具有相对于种植体的长轴方向的垂直方向的伸展（图7)。
[0146] (应用电子显微镜的形态解析）
[0147] 以与实施例2相同的方法，将牙囊贴附HA种植体移植到4周龄C57BL/6老鼠的下 颌第一臼齿缺损部位。在种植体移植后第28天，于老鼠深度麻醉下使用Karnovasky固定 液进行经心的（transcardial)灌流固定。经心的灌流固定之后，摘出老鼠的颌骨，然后，在 4°C的条件下以 31%四氯化锇进行颌骨的后固定。接着，以乙醇使颂骨脱水后，在临界点干 燥器（HCP-2,日立，东京，日本）中使其干燥，在环氧树脂中进行取代·包埋。
[0148] 以环氧树脂包埋的试料的一部分，利用金刚石磨盘（diamond disc)以使移植的种 植体的中央部分成为切断面的方式切出矢状断面。应用离子溉射装置（E-1030,日立）进 行所切出试料的导电处理，进行Au-Pd蒸镀处理。然后，将已蒸镀Au-Pd的试料，应用扫描 电子显微镜（S-4700,日立），以5kV加速电压进行观察。同时，与上述方法相同，也由别的 C57BL/6老鼠制作天然牙齿试料，应用扫描电子显微镜观察天然牙齿的牙周组织的形态。 [0149]此外，对于由已移植牙囊贴附HA种植体的老鼠制作的环氧树脂包埋后的试料的 一部分，应用超薄切片机（Ultramicrome) (ULTRA CUT-UCT;Leica microsystems)制作 lOOnm的超薄切片。制作的切片，应用透射式电子显微镜（H-7600,日立），以加速电压75kV 进行观察。
[0150] 如同上述，取得牙囊贴附HA种植体移植第28天的种植体周围的牙周组织的扫描 电子显微镜（SEM)影像，进行观察。其结果是，在SEM影像中，可观察到由种植体表层朝牙 槽骨走行的致密牙周膜的纤维束与层板状的牙骨质的形成，确认与天然牙齿是几乎相同的 组织形态（图 8)。此外，在观察种植体移植后的种植体周围的牙周组织的SEM影像中，观察 到种植体表层与牙周膜纤维的结合（图8下段）。此外，在观察种植体移植后的种植体周围 的牙周组织的透射式电子显微镜（TEM)影像中，也观察到牙骨质与牙周膜纤维的结合（图 9中箭形记号）。
[0151] (应用X射线显微分析仪的元素分析）
[0152]为更明确地解析牙囊贴附HA种植体移植后的种植体周围的牙周组织中的硬组 织-纤维性组织-硬组织的三层结构，应用X射线显微分析仪进行元素分布的解析。选择 作为种植体的构成元素的钛（Ti)、作为骨组织与牙骨质的构成元素的钙（Ca)及磷（P)作为 解析对象元素，解析各元素的分布。此外，元素分布的解析，是针对与上述扫描电子显微镜 的解析中使用的相同的来自老鼠的试料（包埋在环氧树脂中，以金刚石磨盘切出矢断状的 试料），应用电子束微分析仪（EPMA-1610,岛津制作所，京都，日本）进行上述三元素的分布 的解析。
[0153] 由解析结果发现，钛制的种植体表层有Ca及P的分布（图10)。由于种植体表面 的羟磷灰石涂布层的厚度是非常薄的，为2 μ tn以下，故认为种植体表层的Ca及P的分布， 是来自含有Ca及P作为构成元素的牙骨质。所以，可知种植体表层有由牙骨质构成的硬组 织的形成。此外，种植体移植后的种植体周围的牙周组织的SEM影像中，在纤维走行的部分 中，未能确认Ca与P的分布。由于牙周膜不含有Ca及P作为构成元素，故可明确的是牙周 膜区域保留在未能确认Ca与P的分布的部分。
[0154] 此外，使各构成元素的分布影像重合，再更明确的观察三元素的分布时，在种植体 表面上（Ti表面上），可确认Ca及P累积的斑点（ sp〇t)(图11)。
[0155] <实施例4.种植体移植后形成的牙周膜的功能解析>
[0156] 为解析牙囊贴附HA种植体移植后形成的牙周膜的功能，对天然牙齿、移植后第21 天的牙囊贴附HA种植体、移植后第21天的未卷附牙囊组织的HA种植体，进行实验性矫正， 测量牙齿及种植体的随着时间变化的移动量。此外，解析在矫正力负荷后的牙周组织中的 骨吸收标记与骨形成标记的表达，作为实验性矫正的骨再构筑的解析。
[0157] (种植体的实验性矫正）
[0158] 天然牙齿及种植体的实验性矫正，及因矫正力负荷而造成天然牙齿及种植体的移 动量的解析方法，如下述进行。以与实施例2相同的方法，将牙囊贴附HA种植体或HA种植 体分别移植到C57/BL/6老鼠中。移植后第21天将老鼠于深度麻醉下固定。将直径0. 010英 寸的镍钛线（VM-NT，Oralcare Co.，Ltd.东京，日本）在下颌切牙与作为矫正对象的天然 牙齿或种植体进行树脂固定。利用表盘式张力测量仪（dial tension gauge) (Mitutoyo)， 在水平方向使负荷l〇g至15g的荷重。矫正力是针对天然牙齿、HA种植体、牙囊贴附HA种 植体，自舌侧朝颊侧方向（垂直于齿列侧面、朝向口腔的外侧的方向）施加14天。
[0159] 此外，老鼠下颌切牙是朝颌骨的前方向生长，曰齿是朝上部方向萌生。移植后的种 植体是移植到臼齿侧（图I2)。以微CT进行矫正前、矫正后第3天、第7天、矫正后第14天 的摄影。利用摄得的影像数据使用TRI/3D-Β0Ν软件（Ratoc，大阪，日本），测定矫正力造成 的随着时间变化的移动距离。
[0160] 其结果如图I3中所示。未卷附牙囊组织的HA种植体，未能确认矫正力负荷 所造成的种植体的移动。相对于此，在天然牙齿，可确认自矫正力开始负荷至第7天 有77.0 土 5·5μηι的移动。牙囊贴附HA种植体，可确认自矫正力开始负荷至第7天有 55· 6土6· 3μπι的移动。天然牙齿及牙囊贴附ΗΑ种植体，可确认第7天以后牙齿的缓慢移动 (图13Α及图13Β)。
[0161](解析矫正力负荷后骨吸收标记及骨形成标记的表达）
[0162]其次，解析实验性矫正造成的种植体移植部位的骨再构筑。骨再构筑的解析方法， 是解析为骨吸收标记的集落刺激因子1 (Colony stimulating factor 1,CSF-1)与为骨形 成标记的骨I丐素（Osteocalcin, 0CN)的表达。
[0163] 具体上，首先应用GenBank公开的mRNA序列信息，设计可使0CN以及CSF-1的遗 传基因序列特异扩增的引物（primer)。在该引物上贴附T7RNA聚合酶启动子（polymerase promoter)序列，通过PCR使目标序列扩增。利用所得的PCR产物与T7RNA聚合酶及地高辛 (digoxigenin，DIG) RNA 标记混合物（RNA Labeling Mix) (Roche，Mannheim，德国），合成经 DIG标记的RNA探针。
[0164] 接着，与前述的方法相同，进行天然牙齿及种植体的实验性矫正，矫正第6天 将颂骨摘出。将摘出的颌骨在4 %多聚甲醛溶液中固定24小时之后，使用10 %甲酸柠 檬酸钠及22. 5%甲酸脱钙液进行72小时的脱钙操作。然后将颌骨依序在12. 5 % (w/ v)及25 % (w八）的各蔗糖溶液中分别浸渍12小时，使用OCT复合物（OCT compound) (Miles Inc，Naperville，IL)进行冻结包埋。包埋后，利用冰冻切片机（CM3050S;Leica microsystems)将颌骨制作成10 U m厚的切片。
[0165] 制作厚度10 μ m的冻结切片后，以4%多聚甲醛溶液处理冻结切片1〇分钟以进行 固定，浸泡在乙酰化溶液中1分钟。经过1小时的预杂交（prehybridization)后，使先前 合成的RNA探针在70°C杂交16小时。通过使用经碱性磷酸酶（alkaline phosphatase)标 记的抗DIG Fab Fragments 与 NBT/BCIP(Roche，Mannheim，德国）的免疫学方式，在 3(TC 以 适当的时间进行酶呈色而检出mRNA的存在（localization)。
[0166] 试验中使用的引物如下述。
[0167] .老鼠骨興素（mOCN)、正向引物（forward primer)(序列编号1)
[0168] TAGCAGACACCATGAGGACC
[0169] .老鼠骨1?素（mOCN)、反向引物（reverse primer)(序列编号2)
[0170] TGACATCCATACTTGCAGGG
[0171] .老鼠 CSFl(mCSFl)、正向引物（序列编号3)
[0172] TACTGAACCTGCCTGCTGAA
[0173] .老鼠 CSFl(mCSFl)、反向引物（序列编号4)
[0174] CCAGAGCTTGTGACAGGACA
[0175] 其结果是，在压迫侧可确认表达CSF-lmRNA的破骨细胞的存在，在牵引侧则可确 认表达0CN mRNA的成骨细胞的存在（图14)。由此可显示，已卷附牙囊组织的HA种植体， 形成具有可使牙齿移动的功能的牙周组织。
[0176] <实施例5.种植体移植后形成的牙周膜组织中的神经纤维的解析>
[0177] 在天然牙齿的牙周膜组织中，有末梢神经的侵入，担负传达向心性的刺激 (afferent stimulus)的功能，以维持牙齿的功能及稳态。所以，在移植后第21天的HA种 植体及移植后第21天的牙囊贴附HA种植体周围的牙周膜组织中，也评估是否形成具有正 常功能的神经纤维。
[0178]首先，与实施例2的方法相同，将牙囊贴附HA种植体及HA种植体移植到C57/ BL/6 老鼠上。然后，在移植后第21天时，自接受者老鼠摘出含有牙囊贴附]^种植体或]^种植 体的颌骨。将摘出的颌骨在4%多聚甲醛溶液中固定 24小时之后，使用10%甲酸柠檬酸钠 及22. 5%甲酸脱钙液进行72小时的脱钙操作。然后，依序在12.5% (w/v)及25% (w/v) 的各蔗糖溶液中分别浸渍I2小时，使用0CT复合物（Miles Inc, Naperville，IL)进行冻结 包埋。包埋后，利用冰冻切片机（CM3050S ;Leica microsystems)将颌骨制作成10 μ m厚的 切片，进行这些组织切片的免疫染色。
[0179] 为检测种植体周围形成的牙周膜中的神经纤维，而进行为神经纤维标记的神经 丝（neurofilament)的免疫染色。一次抗体是使用神经丝SMI312(老鼠抗NF Ab;l:1000， Abeam, Cambridge, ΜΑ)，二次抗体是使用标记 Alexa Fluor594 的山羊抗老鼠 IgG(l :500， Molecular Probes)。这些免疫染色影像应用激光共聚焦显微镜（LSM510Meta ;Carl Zeiss， Jene，德国）检测荧光而观察神经纤维。
[0180] 在未形成牙周膜区域的HA种植体中，完全未能确认可被神经丝（NF)染色的神经 纤维的侵入。另一方面，在已形成牙周组织的牙囊贴附HA种植体的牙周膜组织内，与天然 牙齿相同地可确认NF阳性的神经纤维（图15)。由此可显示，牙囊贴附HA种植体，在移植 后可形成具有神经纤维的牙周膜组织。
[0181] <实施例6.种植体移植后形成的牙周膜组织中的神经纤维的功能解析>
[0182] 在因过度咬合力等而对牙齿组织施加侵害刺激时，排列在牙周膜内的末梢神经将 侵害刺激投射到延髓的三叉神经脊束核而感知疼痛。此机制可回避·抑制组织的损伤或功 能不全化而与生物防御有关。所以，即使在具有牙周组织的种植体中，不仅只是形成神经纤 维，重要的是使这些末梢神经进行与中枢神经的连带功能。
[0183] 所以，评估牙囊贴附HA种植体移植后，侵入种植体周围形成的牙周膜内的神经纤 维可否将侵害刺激传达到中枢。评估方法是对天然牙齿、移植第21天后的HA种植体、移植 第 21天后的牙囊贴附HA种植体施加实验性矫正力之后，通过解析在三叉神经脊束核中诱 导产生作为痛感刺激指标的c-Fos蛋白质的表达的方式进行。
[0184] 具体上，首先与实施例2的方法相同，将牙囊贴附HA种植体及HA种植体移植到 C57/BL/6老鼠上。在移植后第21天，于深度麻醉下将老鼠固定。对天然第一臼齿及着生于 颌骨的种植体，与实施例4相同，自舌侧朝向颊侧负荷10至15g的矫正力。在矫正刺激开 始的2小时后，利用剪刀将麻醉下的老鼠胸壁剪开。然后，使心脏露出，从左心室下部刺入 25G针，利用蠕动泵（peristaltic pump)使PBS(-)溶液由心脏灌流至全身。此外，将左心 房切除以确保除血通路。完全除血之后，接着使4%多聚甲醛溶液同样地在全身内回流以进 行固定。
[0185] 然后，与实施例5中所述的方法相同，自老鼠的头盖骨内摘出延髓组织，依序在 12.5% (w/v)及25% (w/v)的各蔗糖溶液中各浸渍12小时。浸渍后，使用0CT复合物 (Miles Inc, Naperville，IL)将延髓组织冻结包埋。包埋后，利用冰冻切片机（CM3050S; Leica microsystems)制作成 40 μ m 厚的切片，
[0186] 制作的切片，以已加入0.3% H202的甲醇封阻内源性过氧化酶，再以3%的血清进 行闭塞。然后，以抗-c-Fos Ab(l :10,000, Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA) 使其反应，以经过氧化酶标记的山羊抗兔IgG(l :300，Cappel Laboratories，Aurora，0hio) 作为一次抗体使其反应。然后，使用PAP免疫复合物（1 :3000, Cappel)进行免疫染色。
[0187] HA种植体对于矫正力负荷，并未能确认c-Fos蛋白质的表达。对于天然牙齿及牙 囊贴附HA种植体，在矫正刺激2小时后确认c-Fos的表达，显示已将对牙周膜的侵害刺激 传达至中枢神经（图16)。由此结果显示，在移植牙囊贴附HA种植体时，种植体周围的牙周 膜内形成可传达侵害刺激的神经功能。
[0188] <实施例7.三壁性骨缺损模型中移植种植体后牙槽骨再生的解析>
[0189]为了解是否可能因牙囊贴附HA种植体的移植而使牙槽骨再生，制作缺少种植体 移植部位的牙槽骨的1侧面骨的三壁性骨缺损模型，将牙囊贴附说种植体移植至该模型 后，进行牙槽骨的再生量的解析。
[0190]拔掉4周龄C5?/BL/6老鼠的下颌第一臼齿，设计2至3周的骨组织的治愈 期。然后，进行在同一部位的牙龈的切开、剥离,利用牙科用微型马达（Viva_Mate plus， Nakanishi，东京，日本）及牙科用铰刀（MANI，栃木，日本）切削牙槽骨，形成直径 深度1_ 2臟的移植窝。使用锥形费舍尔型硬质合金圆锉（tapered Fisher type carbide bur (MANI，栃木，日本），将存在移植窝之处的牙槽骨的颊侧骨削去，制成欠缺颊侧骨的三壁 性骨缺损模型（图Π )。将牙囊贴附HA种植体或HA种植体移植到移植窝内，以8-0尼龙缝 ，线（Bearmedic，千叶，日本）进行牙龈缝合。移植种植体的老鼠，移植后当下以及在移植 弟 14 天、弟 28 天及桌 50 天，利用微型 CT 装置（In vivo Micro X-ray CT System ;R_mCT， 株式会社Rigaku，东京，日本）取得微型CT影像。此外，取得的微型CT影像（各切片的影 像）数据使用集成影像处理软件（i-VIEW- 3DX，株式会社Morita，大阪，日本）进行三维构 巩，而取得二维CT影像。应用所得的微型CT影像及三维CT影像，进行移植部位的牙槽骨 中的颊侧骨再生的随着时间的变化的评估。
[0191]此外，作为此时的对照区，制作未移植种植体的三壁性骨缺损的试样品，同样的也 进行牙槽骨中的颊侧骨再生的随着时间的变化的评估。
[0192]图18中示出了未移植种植体的三壁性骨缺损模型区域、对三壁性骨缺损模型移 植HA种植体的区域、对三壁性骨缺损模型移植牙囊贴附M种植体的区域，在移植后当下以 及移植后第14天、第2 8天及第50天的三维CT影像。在移植HA种植体的区域及未移植种 植体的区域，虽然在第50天可观察到若干程度的牙槽骨的再生，但是牙槽骨并未再生至天 然牙槽骨存在的整个位置（图中的虚线）。尤其是在移植HA种植体的区域，种植体本身是 沉入牙槽骨内。另一方面，移植牙囊贴附HA种植体的区域，在移植后第50天，牙槽骨几乎 完全恢复。此外，牙囊贴附HA种植体本身在移植到的牙槽骨中，也维持在移植时的同样的 位置。
[0193]此外，图19中也示出了移植牙囊贴附HA种植体的三壁性骨缺损模型，在移植后第 14天、第28天及第50天的微型CT影像。在移植后第14天可见到牙槽骨的再生，在移植后 第50天，可观察到几乎完全恢复的牙槽骨。此时，在再生的牙槽骨与牙囊贴附种植体之间， 可确认牙周膜腔模样的间隙（图I 9中的箭头）。就这样，牙囊贴附种植体不仅可形成牙周 膜，也能够随着牙槽骨再生而使种植体着生。
[0194]另外，对于三壁性骨缺损模型移植牙囊贴附HA种植体的区域、三壁性骨缺损模型 移植HA种植体的区域、及三壁性骨缺损模型未移植种植体的三种区域，作成移植第〇天与 移植第50天的影像的重合，进行牙槽骨再生面积的定量化。其结果如图2〇中所示。如图 20中所示，在牙囊贴附HA种植体的移植区中，与另外两区域比较，可确认有显著高的牙槽 骨再生量。
[0195] 此外，为评估移植后的种植体陷入牙槽骨的情况,对于与实施例2相同地制作的 移植窝（非三壁性骨缺损）移植HA种植体的区域、对于三壁性骨缺损模型移植HA种植体 的区域、及对于三壁性骨缺损模型移植牙囊贴附HA种植体的区域，测定移植第〇天与移植 后第50天的种植体的垂直性移动量，并图示化（图21及图22)。其结果是，在对三壁性 骨缺损模型移植HA种植体的区域中，可观察到移植的种植体的沉陷，但在牙槽骨无缺损的 (将HA种植体移植到移植窝的区域及对于三壁性骨缺损模型移植牙囊贴附骱种植体的区 域中，未观察到种植体的沉陷。由此显示，牙囊贴附HA种植体的移植，可防止种植体本身的 沉陷。
【权利要求】
1. 牙科用种植体，所述牙科用种植体使得能形成功能性牙周组织，其特征为： 来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块配置在所述种植体的表面， 配置所述细胞块的所述种植体的表面，是所述种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的 表面的全部或部分。
2. 如权利要求1所述的种植体，其中，所述来自牙胚组织的细胞块为来自牙胚间叶组 织或来自牙囊组织的细胞块。
3. 如权利要求1所述的种植体，其中，所述细胞块来自牙胚组织，所述牙胚组织处于选 自由帽状期、钟状前期、及钟状后期所组成的组中的任何一个发育阶段。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的种植体，其中，所述种植体是在种植体移植后可矫 正的。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的种植体，其中，所述形成的牙周组织具有下述中的 至少一种特征： (i) 具有功能性的牙骨质及功能性的牙周膜，以及 (ii) 具有功能性的神经纤维。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的种植体，其中，所述种植体在该种植体的全部或部 分表面进一步含有表面涂布剂的涂布层，所述细胞块配置在所述涂布层的表面上。
7. 如权利要求6所述的种植体，其中，所述表面涂布剂选自由羟磷灰石、α-磷酸三钙、 β -磷酸三钙、及胶原蛋白所组成的组。
8. 使得能形成功能性牙周组织的牙科用种植体的制造方法，其特征为： 所述方法包括，在所述种植体移植时，将来自牙胚组织或来自牙周膜组织的细胞块配 置在被接受者的牙槽骨围绕的种植体表面的全部或部分的步骤。
9. 如权利要求8所述的种植体的制造方法，其中，所述来自牙胚组织的细胞块为来自 牙胚间叶组织或来自牙囊组织的细胞块。
10. 如权利要求8所述的种植体的制造方法，其中，所述细胞块来自牙胚组织，所述牙 胚组织处于选自由帽状期、钟状前期、及钟状后期所组成的组中的任何一个发育阶段。
11. 如权利要求8至10中任一项所述的种植体的制造方法，其中，在所述种植体移植 后，所述种植体是可矫正的。
12. 如权利要求8至11中任一项所述的种植体的制造方法，其中，所述形成的牙周组织 具有下述中的至少一种特征： (i) 具有功能性的牙骨质及功能性的牙周膜，以及 (ii) 具有功能性的神经纤维。
13. 如权利要求8至12中任一项所述的种植体的制造方法，其中，在配置所述细胞块的 步骤前，所述方法进一步包括，在种植体移植时被接受者的牙槽骨围绕的表面的全部或部 分上，形成表面涂布剂的涂布层的步骤， 所述细胞块配置在所述涂布层的表面上。
14. 如权利要求13所述的种植体的制造方法，其中，所述表面涂布剂选自由轻磷灰石、 α -磷酸三钙、β -磷酸三钙、及胶原蛋白所组成的组。
15. 向牙齿缺损的哺乳动物移植种植体的方法，其特征为：所述方法包括将权利要求1 至7中任一项所述的种植体移植到所述牙齿缺损部位的步骤。
16.如权利要求15所述的种植体的移植方法，其中，所述动物为非人类哺乳动物。
【文档编号】A61L27/00GK104203146SQ201380016291
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年1月28日 优先权日:2012年2月1日
【发明者】迁孝, 大岛正充 申请人:株式会社器官再生工学