用于调节toso活性的方法和组合物的制作方法

用于调节toso活性的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明进一步涉及用于调节Toso蛋白的活性的方法和组合物。本发明进一步涵盖使用包括可溶性Toso蛋白的组合物治疗与炎症、自身免疫性病症和癌症相关的病症。
【专利说明】用于调节TOSO活性的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月16提交的美国临时申请号61/612, 183、2012年5月 11日提交的美国临时申请号61/646, 143和2012年11月29日提交的美国临时申请号 61/731，428的优先权的权益，所述临时申请的内容出于所有目的以引用的方式整体明确地 并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] Toso或Faim3 (Fas细胞凋亡诱导分子3)是最初通过Jurkat细胞（一种T细 胞白血病家系）中的逆转录病毒过量表达筛选而表征的单个跨膜细胞表面受体，其作为 Fas-诱导的细胞凋亡性细胞死亡的介体（Hitoshi，Y.等人，Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity,1998. 8(4) :p. 461-71)。后 续研究已经表明Toso是IgM的难以捉摸的受体。Toso的表达还似乎与慢性淋巴细胞性白 血病或CLL的特别侵袭性的形式相关。
[0005] 需要表征Toso的体内作用以便鉴别其作为治疗靶标和用于包含能够结合Toso和 /或调节其活性的药剂的组合物的用途。
[0006] 发明概述
[0007] 因此，本发明提供用于调节Toso活性和治疗与Toso有关的疾病和病症的方法和 组合物。
[0008] -方面，本发明提供一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，所述方法包括 用含有治疗有效量的可溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受试者的步骤。在示例性实施方 案中，自身免疫性病症是但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症、狼疮或I型糖尿病。
[0009] 另一方面，本发明提供一种治疗受试者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括用 包含治疗有效量的可溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受试者的步骤。
[0010] 一方面，本发明提供一种治疗受试者中的哮喘的方法，所述方法包括用包含治疗 有效量的可溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受试者的步骤。
[0011] 另一方面，本发明提供通过向受试者施用具有SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列或 其片段或缺失变体的可溶性多肽来治疗所述受试者中的糖尿病、哮喘、多发性硬化症或类 风湿性关节炎的方法。在其它实施方案中，受试者中的Toso活性在受试者中被降低。在仍 然其它实施方案中，本发明提供通过施用包含SEQ ID N0. 1-25中的任何一个或多个的氨基 酸序列的可溶性多肽来治疗受试者中的糖尿病、哮喘、多发性硬化症或类风湿性关节炎的 方法。
[0012] 另一方面，本发明提供治疗受:试者中的癌症、过敏症、C0PD、_ IgM综合征、狼疮或 中性白细胞增多症相关的病症的方法，所述方法包括用包含治疗有效量的可溶性Toso蛋 白的组合物治疗所述受试者的步骤。
[0013] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包括 NP_005440. 1 (人Toso同种型a)的氨基酸残基氨基酸P21至G251 (参见Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特别是出于涉及Toso的胞外结构域的所有教导 的目的而整体并入）。
[0014] 在仍然其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包 括人Toso蛋白的胞外结构域。在其它实施方案中，本发明中使用的可溶性Toso蛋白包括 SEQ ID N0 :7的氨基酸残基18-253。
[0015] 在仍然其它实施方案中并且根据上述中的任一项，用于本发明的方法中的可溶性 Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列。在又其它实施方案中，可溶性Toso蛋 白包含与SEQ ID N0 :5或6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在又其它实施方案 中，本发明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID N0:5或6的缺失变体。在仍然其它实施方案中 并且根据上述中的任一项，用于本发明的方法中的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1-25 中的任何一个或多个的氨基酸序列。
[0016] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白是多聚 体。在仍然其它实施方案中，所述多聚体由6个单体组成。在仍然其它实施方案中，多聚体 Toso蛋白的每个单体包含根据SEQ ID N0 :6的序列。
[0017] 另一方面，本发明提供用于抑制Toso活性的方法，所述方法包括将可溶性Toso多 肽应用至包含膜结合Toso受体的细胞。
[0018] 在仍然另一方面，本发明提供一种包括SEQ ID N0 :5或SEQ ID N0 :6的多肽的组 合物。在一个实施方案中，所述组合物抑制Toso活性。在另一实施方案中，所述多肽是多 聚体。在仍然另一实施方案中，所述多聚体包括6个单体，其中每个单体包含根据SEQ ID NO :6的序列。
[0019] 在另一实施方案中，本发明提供一种编码根据本文所描述的任何蛋白质的可溶性 Toso蛋白的分离的核酸。在仍然另一实施方案中，本发明提供一种表达编码根据本文所描 述的任何蛋白质的可溶性Toso蛋白的分离的核酸的宿主细胞。
[0020] 另一方面，本发明提供一种包含人Toso蛋白的胞外结构域、Fc区和多聚化标签的 融合蛋白。在另一实施方案中，所述胞外结构域包含人Toso蛋白的氨基酸21-251。在仍然 另一实施方案中，所述多聚化标签包含SEQ ID N0 :4。在又另一实施方案中，Fc区包含SEQ ID N0 :3。
[0021] 在另一实施方案中，本发明提供一种编码上述融合蛋白的分离的核酸。在仍然另 一实施方案中，本发明提供一种包含编码上述融合蛋白的核酸的宿主细胞。
[0022] 另一方面，本发明提供一种分离的可溶性多肽，所述多肽包含与SEQ ID N0. 8-24 或与包含SEQ ID NO :7的氨基酸残基18-251的多肽区具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列。
[0023] 另一方面，本发明提供用于产生编码本文所描述的任何可溶性Toso蛋白的多肽 的方法，所述方法包括提供包含编码所述多肽的核酸的细胞，将所述细胞在适于表达所述 多肽的条件下进行培养。在其它实施方案中，本发明提供一种编码本文所描述的任何可溶 性Toso蛋白的核酸。
[0024] 附图简述
[0025] 图1示出与T〇S〇+小鼠中的炎症有关的数据。图1A示出使用数字测径器如通过 踝关节厚度的变化测量的关节炎症的量度。图1B示出基于可见肿胀和活动性的每个关节 的疾病严重程度得分。图1C示出引流淋巴结中的淋巴细胞群体的流式细胞术分析。
[0026] 图2示出来自关于T〇S〇f小鼠和野生型小鼠的OVA诱导的哮喘模型的数据。图 2A示出哮喘模型的诱导的示意性图解。图2B示出如通过DifQuik染色评定的关于嗜酸性 粒细胞迁移至支气管肺泡空间中的数据。图2C示出通过对每个载玻片至少200个白细胞 进行计数量化的关于嗜酸性粒细胞的数据。
[0027] 图3A-C示出如通过ELISA评定的关于BALF中0VA诱导的TH2细胞因子IL-4、IL-5 和IL-13的数据。图3D示出关于BALF中的嗜酸性细胞活化趋化因子（Eotaxin)( -种嗜 酸性粒细胞虏获C-C趋化因子）的数据。图3E示出响应于平滑肌细胞中的TNF a治疗产 生的嗜酸性细胞活化趋化因子的水平。
[0028] 图4示出关于Toso+小鼠中的IgE的数据。图4A和B示出Toso+小鼠中的总 IgE水平和特异性IgE水平，并且图4C示出野生型小鼠与TOSO+小鼠之间的IgGl水平。
[0029] 图5示出与野生型对照相比T〇S〇+小鼠的Penh值。
[0030] 图6示出野生型小鼠和Toso+小鼠中的M0G诱导的模型中的EAE得分。
[0031] 图7A示出关于响应于雾化的0VA，野生型动物的支气管肺泡灌洗液（BALF)中的细 胞因子产生的数据，所述野生型动物之前已气管内安装有Tosc^树突细胞和野生型树突细 胞。图7B示出源自用负载M0G 35_55的Tosof树突细胞培养的2d2小鼠的T细胞的增殖。图 7C示出静脉内注射负载GP的T 〇S〇f树突细胞和野生型树突细胞的RIP-GP动物中的血糖 水平，和注射负载GP肽的野生型树突细胞和TOSO+树突细胞的RIP-GP小鼠的卡普兰-迈 耶曲线（Kaplan-Meier plot)。RIP-GP小鼠是在大鼠胰岛素启动子（RIP)的控制下表达来 自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠-这种小鼠发展糖尿 病，如通过增加的血清葡萄糖水平所评定。
[0032] 图8A是Toso可溶性受体的示意性图解。图8B示出关于所述可溶性受体的ELISA 数据。图8C示出通过蛋白质印迹（图8Ci)和通过考马斯蓝染色（图8Cii)获得的Toso 可溶性受体分泌的数据确认。图8D示出Toso可溶性受体与脾细胞的结合数据。图8E示 出指示Toso-Fc最显著地结合脾中的⑶llc+MHChi成熟树突细胞、⑶4+T细胞和B220+B细 胞的进一步数据。图8F示出与板结合的人IgM结合的Toso-Fc的ELISA结果。图8G示出 用每日50iig Toso-Fc治疗的小鼠的正常重量增加。
[0033] 图9A是用于0VA诱导的哮喘的鼠类模型的治疗方案的示意性图解。图9B示出关 于BALF中的Th2细胞因子的数据，并且图9C示出BALF中的细胞结构数据，其均为疾病严 重程度的量度。
[0034] 图10提供本发明的实施方案的序列，包括可溶性Toso蛋白（图10A)、IL-2信号 序列（图l〇B)、Fc结构域（图10C)以及六聚化（hexamerization)标签（图10D)的序列。
[0035] 图11A提供包含六聚体标签、允许表达所述可溶性受体的多聚体形式的可溶性 Toso蛋白的实施方案的序列。图11B提供人Toso蛋白NP_005440. 1 (SEQ ID N0 :7)的序 列。
[0036] 图12示出粒细胞上的T0S0表达。a :RNA是从野生型（WT)小鼠和Toso+小鼠的 脾和肝分离的。使用RT-PCR对Toso RNA进行分析并且将其表示为每18S RNA的表达（n = 4)。b :将来自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾细胞针对CD19 (B细胞）和CD3 (T细胞）进 行染色并且用大鼠抗小鼠Toso抗体或同种型对照进行共染色。灰色区域指示同种型对照， 粗线指示用抗Toso抗体染色。示出CD19阳性细胞（B细胞）和CD3阳性细胞（T细胞）的 一个代表性条带图。c :将来自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾细胞和血液白细胞针对Grl 连同大鼠抗小鼠Toso抗体或同种型对照进行染色。灰色区域指示同种型对照，粗线指示用 Toso染色。示出Grl阳性细胞的一个代表性条带图。d :将来自野生型小鼠和TOSO+小鼠 的血液白细胞通过前向和侧向散射针对粒细胞和淋巴细胞进行分析。示出每yl淋巴细胞 数目（n = 4)。e :将淋巴细胞针对⑶4T细胞（⑶3+CD8-细胞）、⑶8T细胞（⑶3+⑶8+细胞） 和B细胞（B220+细胞，n = 4)进行分析。f :对来自野生型小鼠和TOSO+小鼠的脾重量进 行分析（n = 4)。g :将脾淋巴细胞针对⑶4T细胞（⑶3+⑶8_细胞）、⑶8T细胞（⑶3+CD8+细 胞）和B细胞（B220+细胞，n = 4)进行分析。
[0037] 图13示出活化阈值在T0S0缺陷小鼠的粒细胞中被降低。13a :将来自野生型小鼠 或TOSO+小鼠的血液与不同浓度的fMLP在37°C下孵育30分钟。如方法中所描述通过R0S 产生（二氢罗丹明染色）和脱粒（侧向散射）来测量粒细胞的活化。示出在粒细胞上门控 的细胞的一个代表性点阵图。门设置在活化的粒细胞上。给出活化的粒细胞的百分比（n =6)。13b :将来自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液与不同浓度的TNF-a -起孵育。给出活 化的粒细胞的百分比（n = 6)。13c :将来自WT小鼠和T〇S〇f小鼠的血液与不同浓度的脂 多糖一起孵育。给出活化的粒细胞的百分比（n = 6)。13d :将来自WT小鼠和T〇S〇+小鼠 的血液与不同浓度的GM-CSF(作为来自X630细胞的上清液的百分比给出）一起孵育。给 出活化的粒细胞的百分比（n = 6)。13e:将来自野生型小鼠和T〇S〇+小鼠的血液用10% GM-CSF上清液或500ng/ml LPS引发。在30分钟之后，将细胞用2 ii M fMLP刺激15分钟。 给出活化的粒细胞的百分比（n = 6)。13f :将来自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液在不同温 度下孵育30分钟。使用侧向散射来测量脱粒。给出脱粒的细胞的百分比（n = 6)。
[0038] 图14示出粒细胞中的活化阈值被内在地调控。将C57BL/6野生型小鼠进行辐射 处理并且如方法中所描述用来自携带CD45基因中的点突变的野生型小鼠（CD45. 1，组1)、 Tosof小鼠（CD45. 2,组2)或野生型（CD45. 1)骨髓与TOSO+骨髓细胞的1 : 1混合物 (⑶45.2,组3)的骨髓进行重构。在骨髓移植之后30天，将外周血用fMLP进行刺激并且针 对活化的粒细胞进行分析。14a :示出针对Grl门控的并且针对⑶45. 1、⑶45. 2和二氢罗丹 明（R0S)染色的细胞的代表性FACS图。14b:量化三组不同的骨髓嵌合体的粒细胞百分比 (n = 8)。14c :对根据图3a中的门通过侧向散射和R0S产生测量的活化的粒细胞的百分比 进行分析（n = 8)。14d :针对总粒细胞和活化的粒细胞分析侧向散射和二氢罗丹明（R0S) 的平均荧光强度（n = 8)。
[0039] 图15示出Toso缺陷小鼠中李斯特氏菌的控制受损。15a :将Tosof小鼠和相应 野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。监测存活率（n = 8-15)。15b :将TOSO+小鼠 和相应野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第0天和第2天测量血液粒细 胞中的粒细胞活化（R0S形成）（n = 4-5)。15c :将WT和TOSO+小鼠用1x106CFU的李斯特 氏菌感染。对天然WT小鼠和感染后六小时的李斯特氏菌感染的WT小鼠和Toso^小鼠的 血浆中的髓过氧化物酶进行分析（n = 4)。15d :将Tosof小鼠和相应WT小鼠用1x106CFU 的单核细胞增生李斯特菌感染。在20小时之后分析肝组织学。示出一个代表性载玻片（n =4)。比例尺=50 ii m。15e :将T0S0+小鼠和相应WT小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感 染。在一天之后，测量脾和肝的粒细胞中的R0S产生（n = 3)。f :将TOSO+小鼠和相应WT 小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第3和第4天，分析脾、肝和脑中的李斯特 氏菌滴度（n = 6)。
[0040] 图16示出CDllb和CD18的表达受Toso影响。16a :将来自Toso+小鼠和相应WT 小鼠的血液粒细胞进行福尔马林固定并且然后针对CDlla、CDllb和CD18进行染色。示出平 均突光表达（n = 6)。p值源自配对的学生t检验。16b :将来自野生型小鼠和Tos〇f小鼠 的血液用不同浓度的GM-CSF和LPS进行刺激。示出粒细胞上的CDllb的平均荧光表达（n =6)。16c :将来自Cdllb+小鼠和相应野生型小鼠的血液粒细胞用2 ii M fMLP或用40% GM-CSF上清液还有2 ii M fMLP进行刺激。给出⑶lib和⑶18的平均荧光强度（n = 4)。 16d :将来自Cdllb+小鼠和相应野生型小鼠的血液粒细胞用2iiM fMLP或用40% GM-CSF 上清液还有2 yM fMLP进行刺激。给出活化的粒细胞的百分比（n = 4)。给出总粒细胞以 及活化的粒细胞的R0S染色的平均荧光强度（n = 4)。
[0041] 图17示出Toso+粒细胞中的细胞凋亡。将来自TOSO+-的血液在37°C下在有或 没有GM-CSF(10%)的情况下孵育。在一小时和七小时之后用Annexin V和7AAD测量细胞 凋亡（n = 4)。
[0042] 图18示出在TOSO+小鼠感染之后的李斯特氏菌菌血症。将TOSO+-小鼠和相应 野生型小鼠用1x106CFU的单核细胞增生李斯特菌感染。在感染后一小时和20小时评定血 液李斯特氏菌滴度（n = 4)。
[0043] 图19示出来自在开始高脂肪饮食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的数据。图19A 示出野生型和T 〇S〇+雄性小鼠的体重，自开始于5周大的高脂肪饮食开始监测体重。图19B 示出在高脂肪饮食后14周时两组小鼠中的食物摄取的测量值。
[0044] 图20A示出来自在开始高脂肪饮食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的葡萄糖耐 量试验的数据。图20B示出来自同一组小鼠的胰岛素耐量试验的数据。
[0045] 图21示出说明用常规食物（非高脂肪）饮食饲养的野生型小鼠和TOSO+小鼠展 示出类似水平的葡萄糖耐量（图21A)和胰岛素耐量（图21B)的数据。
[0046] 图22示出关于在用可溶性Toso蛋白治疗之前（图22A)和治疗之后（图22B)的 葡萄糖耐量的数据。
[0047] 图23示出与用可溶性Toso蛋白治疗的小鼠（Toso-Fc-实心正方形）相比，用PBS 治疗的小鼠（实心圆）中的EAE临床得分。
[0048] 图24A示出比较用对照媒介物治疗的小鼠（实现圆）和用可溶性Toso蛋白治疗的 小鼠（Toso-Fc-空心正方形）治疗的小鼠中的累加关节炎得分的关节炎小鼠模型。图24B 示出如与对照（媒介物-实心圆）相比，来自比较Toso-Fc治疗的小鼠（Toso-Fc-空心正 方形）中的关节炎发病率百分比的关节炎小鼠模型的数据。
[0049] 图25示出对用Toso-Fc治疗的脾细胞中的胶原减少的增殖应答。
[0050] 图26示出如与对照（媒介物-实心圆）相比，可溶性Toso蛋白（Toso-Fc-空心 正方形）在关节炎小鼠模型中的治疗作用。
[0051] 图27A-C提供本发明的可溶性Toso蛋白的不同实施方案的序列。
[0052] 发明详述
[0053] 除非另外指示，否则本发明的实践可以采用本领域的技术之内的有机化学、聚 合物技术、分子生物学（包括重组技术）、细胞生物学、生物化学以及免疫学的常规技术 和描述。这类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、噬菌体展示和使用标记检测杂 交。适合的技术的具体说明可以参考本文以下实施例。然而，当然还可以使用其它等 效常规程序。这类常规技术和描述可在标准实验室手册中找到，如Genome Analysis :A Laboratory Manual Series (第 I-IV 卷），Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cells ：A Laboratory Manual, PCR Primer ：A Laboratory Manual 和 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (全部来自冷泉港实验室出版社），Stryer, L. (1995) Biochemistry(第 4 版)Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis ： A Practical Approach，'1984, IRL Press, London, Nelson 和 Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 第 3 版，W.H. Freeman Pub.，New York, N.Y?和 Berg 等人 (2002)Biochemistry，第 5 版，W.H.Freeman Pub.，New York，N. Y?，所述文献全部出于所有 目的以引用的方式整体并入本文。
[0054] 应注意，除非上下文另外明确地规定，否则如在本文和所附权利要求书中所使用， 单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数指示物。因此，例如，提及"一种聚合酶"是指 一种试剂或这类试剂的混合物，并且提及"所述方法"包括提及本领域技术人员已知的等效 步骤和方法等等。
[0055] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领 域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于描述和公开描述于本公布中并且可能 与目前所描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂以及方法学的目的，本文所提及的所有 公布均以引用的方式并入本文。
[0056] 如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内 包涵所述范围的上限与下限之间的各插入值（至下限单位的十分之一）和在所陈述的范围 中的任何其它陈述值或插入值。本发明内还包涵可以独立地包括于这些较小范围中的所述 较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。如果所陈述的范 围包括一个或两个限值，那么排除任一个或两个所包括的限值的范围也包括于本发明中。
[0057] 在以下描述中，阐述大量具体细节以便提供本发明的更详尽的理解。然而，对于本 领域技术人员将是清楚的：可以在无一种或多种这些具体细节的情况下实践本发明。在其 它情况下，并未描述本领域技术人员所熟知的熟知特征和程序，以便避免混淆本发明。
[0058] 如本文所用，术语"包含"意图意味组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要 素。"基本上由……组成"在用于定义组合物和方法时将意味排除具有为组合物或方法所必 需的任何意义的其它要素。"由……组成"将意味排除超过所要求保护的组合物的其它成 分的痕量元素和实质性方法步骤。由这些过渡术语的各者定义的实施方案在本发明的范围 内。因此，意图所述方法和组合物可包括另外步骤和组分（包含）或可替代地包括不具有 意义的步骤和组合物（基本上由……组成）或可替代地，意图仅包括所陈述的方法步骤或 组合物（由......组成）。
[0059] 所有数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量（包括范围）是以0.1的增量 (+)或（_)变化的近似值。应理解，虽然并非总是明确地说明，但是所有数字标识都应在前 面加上术语"约"。术语"约"除"X"的较小增量如"X+0. 1"或"X-0. 1"之外还包括精确值 "X"。还应理解，虽然并非总是明确地说明，但是本文所描述的试剂仅是示例性的并且所述 试剂的等效物是本领域已知的。
[0060] "组合物"可包括包含药剂或化合物的任何物质，并且还意图涵盖药剂或化合物与 其它物质（包括载体）（例如，惰性（例如，可检测药剂或标记）或活性的化合物或组合物） 的任何组合，所述载体如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐 剂等。载体还包括药物赋形剂和添加剂、蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如，糖， 包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖）；衍生的糖，如糖醇、醛糖酸、酯化的糖等；以及多糖或 糖聚合物），所述载体可单独地或组合存在，独自或组合占1-99. 99重量％或体积％。示例 性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白如人血清白蛋白（HSA)、重组人白蛋白（rHA)，明胶，酪蛋 白等。还可在缓冲能力中起作用的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、 甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、 苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也意图在本发明的范围内，其实例包括但不限于 单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤 维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露醇、木糖 醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0061] 可与术语生物相容的载体或介质互换使用的术语药学上可接受的载体（或介质） 是指不仅与有待治疗性使用的细胞和其它药剂相容，而且在合理医学判断的范围内适合用 于与人和动物组织相接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它并发症、与合理的益处/ 风险比相称的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型。适合用于本发明的药学上可接 受的载体包括液体、半固体（例如，凝胶）和固体材料（例如，细胞支架和基质、管材片材和 如本领域已知和本文更详细地描述的任何这类材料）。这些半固体和固体材料可被设计成 抵抗身体内的降解（不可降解的）或它们可被设计成在身体内降解（生物可降解的、生物 可侵蚀的）。生物可降解的材料可进一步是可生物再吸收的或生物可吸收的，即，它可以被 溶解并且吸收至体液（水可溶性移植物是一个实例）中或通过转化成其它材料或通过天然 途径分解并且消除来降解并且最终从身体消除。
[0062] 如本文所用，术语"患者"或"受试者"意指动物、哺乳动物或更进一步人患者。仅 出于说明目的，哺乳动物包括但不限于人、猿猴、鼠类、牛、马、猪或绵羊。
[0063] 如本文所用，术语"寡核苷酸"或"多核苷酸"是指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 或其任何组合组成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常为至少约10、15、20、25、30、40、50、60、 70、80、90、100或更多个核苷酸。寡核苷酸可用作引物或用作探针。
[0064] 术语"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似 的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那 些，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和邻-磷酸丝氨酸。 氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构（即，结合氢的a碳、羧 基、氨基和R基），例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有 经过修饰的R基团（例如，正亮氨酸）或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相 同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类 似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。
[0065] 如本文所用的术语"分离的"是指基本上不含其它材料的分子或生物材料或细胞 材料（例如，大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98% )。一方面，术语"分离的" 是指核酸，如分别与其它DNA或RNA、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离 的DNA或RNA、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官，其存在于天然来源中并且 允许操作所述材料以便实现在存在于其天然或自然状态的情况下不可获得的结果（例如， 重组复制或通过突变操作）。术语"分离的"还指当化学合成时在通过重组DNA技术或化学 前体或其它化学品产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽。此外，"分 离的核酸"意味包括并非以片段形式天然存在并且将不能以天然状态发现的核酸片段。术 语"分离的"在本文还用于指从其它细胞蛋白分离的多肽并且意味涵盖纯化的多肽和重组 多肽两者，例如，具有大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、98%、或99%的纯度。术 语"分离的"在本文还用于指从其它细胞或组织分离的细胞或组织并且意味涵盖培养的细 胞或组织和工程化的细胞和组织两者。
[0066] "重组"核酸是指通过组合通常不一起存在的两个或更多个序列而形成的人工核 酸。在一个实施方案中，它是通过将相关DNA引入现有生物体DNA (如细菌的质粒）中以便 编码或改变不同性状以用于具体目的（如抗生素抗性）来形成。"重组"多肽是衍生自重组 核酸的多肽。
[0067] 如本文所用，术语"启动子"是指足以指导基因转录的核酸序列。还包括于本发明 中的是足以使启动子依赖性基因表达可针对细胞类型特异性、组织特异性控制或可通过外 部信号或药剂诱导的那些启动子元件。
[0068] 在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或离散启动子。诱导型启动子可通过 化学或物理条件如温度或光开启。化学启动子的实例包括但不限于醇调控的、四环素调 控的、类固醇调控的、金属调控的和发病机制调控的启动子。离散启动子的实例可在例如 Wolfe 等人 Molecular Endocrinology 16(3) :435_49 中找到。
[0069] 如本文所用，术语"调控元件"是指足能够调节基因转录的核酸序列。调控元件的 非限制性实例包括启动子、增强子、沉默子、多腺苷酸化信号、转录终止序列。调控元件可存 在于天然基因的5'或3'区或内含子内。
[0070] 各种蛋白质也在本文公开，具有针对其人蛋白和编码序列的其GenBank登录号。 然而，蛋白质不限于源自人的具有由所公开的GenBank登录号表示的氨基酸序列的蛋白 质，但可具有源自其它动物，具体地说温血动物（例如，大鼠、豚鼠、小鼠、鸡、兔、猪、免疫、 牛、猴等）的氨基酸序列。
[0071 ] 如本文所用，术语"Toso"、"FAM3"或"Fas细胞凋亡抑制分子3"是指具有 与代表性Toso序列中的任一种基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，包括GenBank登录 号 NP_001135945(人同种型 b)、NP_001180267(人同种型 c)、NP_005440(人同种型 a)、 NP_081252 (小鼠）或NP_001014843 (大鼠）的任何和所有型式。编码Toso的合适的cDNA 在 GenBank 登录号 NM_001142473、NM_001193338、NM_005449、NM_026976 和 NM_001014843 提供。
[0072] 如本文所用，术语"Toso的生物活性"或"Toso活性"是指与全长天然Toso蛋白 相关的任何生物活性。在一些实施方案中，Toso的生物活性是指结合IgM抗体。在其它实 施方案中，Toso的生物活性是指抑制⑶lib或⑶18活性。在仍然其它实施方案中，Toso的 生物活性是指增加粒细胞的活化阈值。可通过来自骨髓的活化的粒细胞的数目测量活化阈 值。在其它实施方案中，Toso的生物活性包括树突细胞的活化和其将抗原呈递至T细胞的 能力。在其它实施方案中，Toso的生物活性包括抑制细胞凋亡或增强TNF信号传导。在一 些实施方案中，Toso生物活性等效于具有由GenBank登录号NP_001135945、NP_001180267、 NP_005440、NP_081252或NP_001014843表示的氨基酸序列（包括这些登录号的任何和所 有型式）的蛋白质的活性。
[0073] 如本文所用，术语"⑶1 lb"、" ITGAM"或" ITGAM整联蛋白，a M(补体组分3受体3 亚基）"是指具有与GenBank登录号NP_000623的代表性⑶1 lb序列基本相同的氨基酸序 列的蛋白质。编码⑶lib的合适的cDNA在GenBank登录号NP_000632提供。
[0074] 如本文所用，术语"⑶lib的生物活性"是指与全长天然⑶lib蛋白相关的任何 生物活性。在一个实施方案中，⑶lib的生物活性是指与02链（ITGB2)组合以形成白细 胞特异性整联蛋白。在合适的实施方案中，⑶lib生物活性等效于具有由GenBank登录号 NP_000623表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。转录活性的测量可使用任何已知的方法进 行，如免疫组织化学、报告基因测定或RT-PCR。
[0075] 如本文所用，术语"CD18"、"ITGB2"或"ITGB2整联蛋白，@ 2(补体组分3受体3 和4亚基）"是指具有与GenBank登录号NP_000202的代表性⑶18序列基本相同的氨基酸 序列的蛋白质。编码⑶18的合适的cDNA在GenBank登录号NP_000211提供。
[0076] 如本文所用，术语"治疗"是指出于通过减轻、缓解、逆转或预防疾病或病症的至少 一种不良作用或症状来改善患者的状况的目的而施用药物组合物。
[0077] 如本文所用，术语"预防"是指鉴别受试者（即，患者）对疾病具有增加的易感性 但尚未表现出所述疾病的症状，并且施用根据本公开的原理的疗法。预防性疗法被设计成 降低易感受试者稍后将变成症状性或所述疾病将比它在不存在所述预防性疗法的情况下 所将会的更缓慢地延迟发作或进展的可能性。受试者可通过任何适当的方法（包括例如通 过鉴别疾病的家族病史或其它退行性脑部病症）被鉴别为具有发展所述疾病的增加的可 能性，或具有指示疾病或对疾病的易感性的一种或多种诊断标志物。
[0078] 如本文所用，术语"样本"或"测试样本"是指含有核酸的任何液体或固体材料。在 合适的实施方案中，测试样本是从生物来源获得的（即，"生物样本")，如培养物中的细胞或 来自动物、更优选人的组织样本。
[0079] 如本文所用，术语"基本上相同"当提及蛋白质或多肽时意味与参考氨基酸序列具 有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的氨基酸序列。比较的长度优选是所述多 肽或蛋白质的全长，但通常是至少10、15、20、25、30、40、50、60、80或100或更多个连续氨基 酸。"基本上相同的"核酸是与参考核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98 %或99 %序列同一性的核酸序列。比较的长度优选是所述核酸的全长，但通常是至少20 个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷 酸、或更多。
[0080] 如本文所用，"氨基酸取代"或"取代"是指起始多肽序列中特定位置处的氨基酸被 另一氨基酸替换。例如，取代M23Y是指位置23处的蛋氨酸被酪氨酸替换的变异多肽。
[0081] 蛋白质或核酸的"生物等效物"是指与所述蛋白质或核酸在氨基酸或核酸序列方 面基本相同或具有等效生物活性的蛋白质或核酸。
[0082] 如本文所用，术语"有效量"是指以足以向患者提供医学益处的频率递送的化合物 (例如，Toso蛋白或其生物活性片段）的量。在一个实施方案中，蛋白质的有效量是足以治 疗或改善疾病的症状的量。
[0083] 细胞的群体意图指在表型和/或基因型方面完全相同（克隆）或不完全相同的多 于一个细胞的合集。
[0084] "基本上同质"描述其中多于约50%或可替代地多于约60%、或可替代地多于 70 %、或可替代地多于75 %、或可替代地多于80 %、或可替代地多于85 %、或可替代地多于 90%、或可替代地多于95%的细胞具有相同或相似表型的细胞群体。表型可通过预选选择 的细胞表面标志物或其它标志物来确定。
[0085] 术语自体转移、自体移植、自身移植物等是指其中细胞供体也是细胞替代疗法的 受体的治疗。术语同种异体转移、同种异体移植、同种异体移植物等是指其中细胞供体具有 与细胞替代疗法的受体相同的物种，但不是同一个体的治疗。供体的细胞已经与受体组织 相容性匹配的细胞转移有时被称为同系转移。术语异种转移、异种移植、异种移植物等是指 其中细胞供体具有与细胞替代疗法的受体不同物种的治疗。
[0086] 如本文所用，"抗体"包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。因此，术语"抗 体"包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任何蛋白质或肽。这种的实例包 括但不限于重链或轻链的互补决定区（CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链 或轻链恒定区、框架（FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。通常，术语"抗体"包 括任何多肽，所述多肽包括至少一个恒定结构域，包括但不限于CHI、CH2、CH3以及CL。适 用于本发明中的抗体可采取如本文所描述的多种形式，包括传统抗体以及抗体衍生物、片 段和模拟物
[0087] 所述抗体可以是多克隆的或单克隆的并且可分离自任何合适的生物来源，例如， 鼠类、大鼠、绵羊和犬。
[0088] 单克隆抗体是由细胞或杂交瘤的单个克隆产生的抗体，并且因此是单一纯同质类 型的抗体。
[0089] 杂交瘤是在实验室中由产生抗体的淋巴细胞与不产生抗体的癌细胞（通常是骨 髓瘤或淋巴瘤）的融合产生的细胞。杂交瘤增殖并且产生特定单克隆抗体的连续供应。 [0090] 如本文所用的术语"人抗体"意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区 和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残 基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。然而，如 本文所用的术语"人抗体"不意图包括其中源自另一种哺乳动物物种（如小鼠）的种系的 CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。因此，如本文所用，术语"人抗体"是指其中蛋白 质的基本上每一部分（例如，⑶R、框架、Q、C H结构域（例如，CH1、CH2、CH3)、铰链、（VL，VH)) 在人中基本上无免疫原性、仅具有较小序列变化或变异的抗体。类似地，指定为灵长类动物 (猴、狒狒、黑猩猩等）、啮齿类动物（小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等）和其它哺乳动物的抗体 指定这类物种、亚属、属、亚科、科特异性抗体。此外，嵌合抗议包括上述的任何组合。相对 于非修饰的抗体，这类变化或变异任选地和优选地保留或减少在人或其它物种中的免疫原 性。因此，人抗体不同于嵌合或人源化抗体。应指出人抗体可由能够表达功能性重排的人 免疫球蛋白（例如，重链和/或轻链）基因的非人动物或原核生物或真核细胞产生。此外， 当人抗体是单链抗体时，它可包含未在天然人抗体中发现的接头肽。例如，Fv可包含连接 重链的可变区与轻链的可变区的接头肽，如两个至约八个甘氨酸或其它氨基酸残基。这类 接头肽被认为具有人起源。
[0091] 如本文所用，如果人抗体是从使用人免疫球蛋白序列的系统，例如通过对携带人 免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或通过筛选人免疫球蛋白基因文库获得，那么所述 抗体是"源自"特定种系序列。"源自"人种系免疫球蛋白序列的人抗体可通过将人抗体的 氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较这样来鉴别。所选择的人抗体与 由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上通常是至少90%同一的，并且 当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，鼠类种系序列）相比时，包含鉴别所述 人抗体为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体与由所述种系免疫球蛋白基因编码的氨 基酸序列在氨基酸序列上可以是至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一的。通 常，源自具体人种系序列的人抗体将展示出与由所述人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸 序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，所述人抗体可以展示出与由所述种系免疫 球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个，或甚至不多于4个、3个、2个或1个氨基酸的差 异。
[0092] 如本文所用，术语"重组人抗体"包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所 有人抗体，如从动物（例如，小鼠）分离的抗体，所述动物对于人免疫球蛋白基因是转基因 的或转染色体的，或自所述动物制备的杂交瘤；从被转化以表达所述抗体的宿主细胞（例 如，从转染瘤）分离的抗体；从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及通过任何其它手段 制备、表达、产生或分离的抗体，所述手段涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序 列。所述重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实 施方案中，所述重组人抗体可经受体外诱变（或当使用针对人Ig序列转基因的动物时，经 受体内体细胞诱变），并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是虽然来源于并且相 关于人种系VH和VL序列，但可能不天然地存在于体内人抗体种系谱系内的序列。本文描 述了用于制备这些抗体的方法。
[0093] 如本文所用的"同种型"意指通过其恒定区的化学特征和抗原特征来定义的任何 免疫球蛋白的亚类。应了解，治疗性抗体也可包含同种型和/或亚类的杂交体。
[0094] 如本文所用的术语"多克隆抗体"或"多克隆抗体组合物"是指源自不同B细胞系 的抗体制剂。它们是针对特异性抗原分泌的免疫球蛋白分子（各自识别不同表位）的混合 物。
[0095] 如本文所用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指单一分子组成的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物针对具体表位展示出单一结合特异性和亲和性。
[0096] 如本文所用，术语"标记"意指直接或间接地缀合至待检测的组合物的直接或间接 可检测的化合物或组合物，例如，N末端组氨酸标签（N-His)、磁活性同位素（例如，115Sn、 117Sn和119Sn)、非放射性同位素（如13C和15N)、多核苷酸或蛋白质（如抗体），以便产生"标 记的"组合物。所述术语还包括缀合至多核苷酸、将在表达插入序列时提供信号的序列，如 绿色荧光蛋白（GFP)等。所述标记本身是可检测的（例如放射性同位素标记或荧光标记）， 或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。所述标记可适 合于小规模检测或更适合于高通量筛选。如此，合适的标记包括但不限于磁活性同位素、非 放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料以及蛋白质，包括酶。标记 可以被简单地检测或它可以被量化。被简单地检测的应答通常包括仅确认其存在的应答， 而被量化的应答通常包括具有可量化的（例如，可数字上报告的）值强度、极化和/或其它 特性的应答。在发光或荧光测定中，可检测的应答可使用与实际参与结合的测定组分缔合 的发光团或荧光团直接产生，或使用与另一种（例如，报告基因或指示剂）组分缔合的发光 团或荧光团间接产生。
[0097] 产生信号的发光标记的实例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光 应答通常包含发光信号的变化或出现。用于荧光地标记测定组分的合适的方法和荧光团 是本领域已知的并且描述于例如 Haugland，Richard P. (1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第6版）中。发光探针的实例包括但不限于水母蛋白和 萤光素。
[0098] 合适的荧光标记的实例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、藻红、 香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄、Cascade Blue?以及德克萨斯红。其它合 适的光学染料描述于 Haugland，Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第 6版）中。
[0099] 另一方面，荧光标记进行功能化以便有助于共价附接至存在于细胞或组织的表面 中或上的细胞组分，如细胞表面标志物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基团、氨 基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基酯以及磺酰基卤化物，其全部可用于将荧光标 记附接至第二分子。荧光标记的官能团的选择将取决于与接头、药剂、标志物或第二标记剂 附接的位点。
[0100] 虽然主要参照具体实施方案描述了本发明，但还预想在阅读本公开后其它实施方 案对于本领域技术人员将是清楚的，并且意图这类实施方案包含于本发明的方法内。
[0101] I.发明综沭
[0102] 本发明涉及用于调节Toso蛋白（其在本文还可互换地被称为"Toso"或"Toso受 体"或"Faim3"或"FCMR"）的活性的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明的方法和 组合物增加Toso蛋白的活性。在其它实施方案中，本发明的方法和组合物抑制Toso蛋白 的活性。在一些实施方案中，用于调节Toso蛋白的活性的组合物包括结合Toso蛋白或结 合Toso蛋白的配体的药剂。在其它实施方案中，本发明的组合物包含可溶性Toso蛋白。如 将在本文进一步详细地讨论，本发明的可溶性Toso蛋白包括Toso受体的全部或部分胞外 结构域。本发明的可溶性Toso蛋白可进一步包括信号肽和/或Fc结构域。本发明的可溶 性Toso蛋白可进一步包括Toso蛋白的变体胞外结构域，包括缺失变体（其中全胞外结构 域的一个或多个氨基酸缺失的变体）和包含一个或多个氨基酸取代的变体。
[0103] 本发明进一步涉及通过向受试者施用可溶性Toso蛋白（或其变体）来治疗病症 和疾病的方法。如将在本文进一步详细地讨论，本发明的可溶性Toso蛋白可用于治疗患有 但不限于以下各项的受试者：自身免疫性病症（包括但不限于1型或2型糖尿病、多发性硬 化症或类风湿关节炎）、哮喘、过敏症、慢性阻塞性肺病（"C0PD"）、高-IgM综合症、CLL、狼 疮或中性白细胞增多症相关的病症（包括但不限于中性粒细胞减少症、重度先天性中性粒 细胞减少症、环状中性粒细胞减少症、抗体介导的中性粒细胞减少症、网状发育不良、白细 胞粘附缺陷、常见骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、常见感冒荨麻疹和白细胞增多以 及慢性肉芽肿病）。
[0104] II.可溶件Toso蛋白
[0105] 本发明的组合物包括调节Toso活性的药剂。如将在下文进一步详细地讨论，这类 组合物包括但不限于可溶形式的Toso蛋白。
[0106] 本发明的可溶性Toso蛋白（在本文还可互换地被称为"可溶性Toso受体"、 "Toso-Fc"和"可溶性Toso多肽"）包括Toso受体的全部或部分胞外结构域。在其它实施 方案中本发明的可溶性Toso蛋白包括信号结构域和/或Fc结构域。如将在本文进一步详 细地讨论，可溶性Toso蛋白的这些组分可以任何方式在有或没有另外组分和/或修饰的情 况下组合以便提供本发明的可溶性Toso蛋白。
[0107] 一方面，本发明的可溶性Toso蛋白包含Toso的胞外结构域。在仍然另一实施方 案中，所述可溶性Toso蛋白包含人Toso同种型a的胞外结构域。人Toso的胞外结构域 预计跨越NP_005440. 1 (人Toso同种型a)的氨基酸P21至G251 (参见Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特别是出于涉及Toso的胞外结构域的所有教导 的目的而整体并入）。为清楚起见，本文的大多数讨论涉及包含人Toso蛋白的全部或部分 胞外结构域的可溶性Toso蛋白。然而，应理解来自任何物种的Toso蛋白的胞外结构域可 用于产生根据本文描述的可溶性Toso蛋白，并且鉴别对应于本文所讨论的人Toso蛋白的 区的来自另一物种的Toso蛋白的区将是在本领域技术人员的能力范围内。
[0108] 在一个实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :1的胞外结构域序 列（其在图10中示出）。在另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白与SEQ ID NO: 1具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :1中 的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14个氨基酸取代的多肽。在又另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含 具有 SEQ ID N0 :1 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸取代的多肽。
[0109] 在一个实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :8的胞外结构域序 列（其在图27中示出）。在另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白与SEQ ID N0 :8具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :8中 的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14个氨基酸取代的多肽。在又另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含 具有 SEQ ID N0 :8 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸取代的多肽。
[0110] 在另一实施方案中并且根据上述任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸18至253。在仍然另一实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸21至253。在仍然另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO: 7的氨基酸21至251。在又另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括来自SEQ ID NO :7 的任何以下范围的氨基酸：1-255、5-245、10-235、15-225、20-215、25-205、30-195、35-185、 40-175、45-165、50-155、45-145、40-135、35-125、30-115、35-105、40-95、45-85、50-75、 55-65。在仍然另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括与SEQ ID N0 :7的氨基酸18至 253 或 21 至 253 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的序列同一性的序列。
[0111] 在仍然另一实施方案中并且根据上述任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包括图 27中描绘的SEQ ID NO :8的全部或一部分。在仍然其它实施方案中，所述可溶性Toso 蛋白包括 SEQ ID NO :8 的氨基酸 1-231、6-221、11-211、16-201、21-191、26-181、31-171、 36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、76-81。在仍然其它实施方 案中，所述可溶性Toso蛋白包括与SEQ ID NO :8的氨基酸区1-231、6-221、11-211、16-201、 21-191、26-181、31-171、36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、 76-81 具有至少 70 %、75 %、80%、85 %、90 %、91 %、92 %、93%、94%、95 %、96%、97 %、 98%、99%和100%序列同一性的多肽。
[0112] 在又另一实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0:8、9、ll、13、15、 17、19、21和23中的任一个。在仍然另一实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括与SEQ ID NO :8、9、11、13、15、17、19、21 和 23 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。这些序列包括1'〇8〇受体 的胞外结构域的缺失变体。
[0113] 在仍然其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包 含Toso蛋白的全胞外结构域的缺失变体。在示例性实施方案中，为本发明的可溶性Toso 蛋白的组分的缺失变体包括以下氨基酸中的一个或多个已经从SEQ ID NO :8缺失的多肽： 1-21、1-35、1-87、区1-21和区211-231两者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。在 其它示例性实施方案中，为本发明的可溶性Toso蛋白的组分的缺失变体包括与以下氨基 酸区中的一个或多个缺失的根据SEQ ID N0:8的多肽具有约70%、75%、80%、85%、90%、 91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一'注的多肽：1_21、1-35、 1-87、区 1-21 和区 211-231 两者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。
[0114] 在其它实施方案中并且根据以上中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包括包 含与Toso受体的配体结合的区的胞外结构域组分。在示例性实施方案中，本发明的可溶 性Toso蛋白包括与IgM结合的胞外结构域组分。在仍然另一实施方案中，本发明的可溶性 Toso蛋白包括SEQ ID N0 :8的氨基酸35至87。在其它示例性实施方案中，本发明的可溶 性Toso 蛋白包括SEQ ID N0 :8 的氨基酸25-100、29-95、33-90、37-85、41-80、45-75、49-70、 53-65 或 57-60。
[0115] 在另一方面并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包括如以上所 讨论的胞外结构域组分并且进一步包括信号序列。在一个示例性实施方案中，所述信号序 列增强从宿主细胞的分泌。在又另一实施方案中，所述信号序列包括但不限于选自以下各 项的成员：IL_2信号序列、来自酿酒酵母的a-交配因子前序列、来自黑曲霉的a-淀粉酶 信号序列、来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶信号序列、来自智人的血清白蛋白信号序列、来自马 克思克鲁维酵母的菊粉酶信号序列、来自酿酒酵母的转化酶信号序列、来自酿酒酵母的杀 伤蛋白信号序列、来自原鸡的溶菌酶信号序列。在仍然另一实施方案中，所述信号序列包含 根据SEQ ID N0 :2的序列（其在图10中示出）。在仍然另一实施方案中，所述信号序列包 含与 SEQ ID N0:2 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。在具体实施方案中，本发明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵 ：1、8、9、11、13、15、17、21和23中的任一个或作为与5￡〇10勵：2或 与同 SEQ ID N0:2 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的变体。
[0116] 在另一方面并且根据以上中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包含Toso受体 的胞外结构域和Fc结构域。在一个示例性实施方案中，所述可溶性Toso蛋白是包含人Toso 蛋白的同种型A的胞外结构域和Fc结构域的融合蛋白。在另一实施方案中，所述Fc结构 域包括如与无Fc结构域的蛋白质相比增强所述蛋白质的半衰期的任何结构域。在仍然另 一实施方案中，所述Fc结构域包括如与无Fc结构域的蛋白质相比改善所述蛋白质的药物 代谢动力学曲线的任何结构域。在仍然另一实施方案中，所述Fc结构域源自C末端处的人 IgGl，在又另一实施方案中所述Fc结构域包括减弱或消除抗体依赖性和补体依赖性细胞 毒性的突变。在仍然另一实施方案中，这类突变包括单独地或以任何组合的以下突变中的 一个或多个：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ;P331S。在又另一实施方案中，所 述Fc结构域包含根据SEQ ID NO :3的序列（其在图10中示出）。在仍然另一实施方案中， 所述 Fc 结构域包含与 SEQ ID N0:3 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性的序列。
[0117] 在其它示例性实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包含含有胞外结构域组分 和Fc结构域组分两者的融合蛋白。在仍然其它示例性实施方案中，本发明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵 ：1、8、9、11、13、15、17、21和23或作为与5￡〇10勵：3或与同5￡〇10 N0 :3 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的变体。
[0118] 在一方面并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包含细胞外Toso 结构域、信号序列和Fc结构域一那些组分各自可包含以任何组合的这些组分的任何上述 型式。在仍然另一实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :5的序列 (其在图8中示出）。在仍然另一实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包含与SEQ ID N0: 5 具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和100 %的序列同一性的序列。
[0119] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白包含根 据SEQ ID N0. 10、12、14、16、18、20、22和24中的任一个的序列，其包含胞外结构域组分、信 号序列和Fc结构域。在其它实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白包含与SEQ ID NO. 10、 12、14、16、18、20、22、和24具有约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列问一性的序列。
[0120] 在其它方面并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白可进一步包括 在Toso胞外结构域组分与Fc结构域之间、在Toso胞外结构域组分与信号序列之间或在 Toso胞外结构域组分与Fc结构域之间和Toso胞外结构域组分与信号序列两者之间的接 头。在示例性实施方案中，这种接头可以是可有效于将两个氨基酸序列连接在一起的氨基 酸接头、聚合物接头或本领域已知任何其它接头。在其它示例性实施方案中，所述接头是氨 基酸接头。在仍然其它实施方案中，所述接头是氨基酸序列：ISAMVRS(SEQ ID N0:25)。在 又其它实施方案中，所述接头是含有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代的SEQ ID N0:25的变 体。
[0121] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白的变体 可通过本文所讨论的任何可溶性Toso蛋白的氨基酸序列（包括SEQ ID N0. 5、6或8-24)的 修饰来制备。可使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现这 类修饰。这类技术例如描述于 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. , 1989 和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York, N.Y.，1989 中，所述文献各自出于所 有目的并且特别是出于涉及形成蛋白质变体的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0122] 在仍然其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白可 以呈单体形式或多聚体形式，其中多聚体的每个单体包含单个胞外结构域序列。在其它实 施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白是呈2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个单体的多聚体形 式。在一个具体实施方案中，可溶性Toso蛋白是6个单体的多聚体。在另一实施方案中， 六聚Toso多聚体是由包含六聚化标签的单体形成。在另一实施方案中，六聚化标签包含来 自人IgAa重链恒定区的21氨基酸尾片段，如Hirano等人，Blood(2006)中所描述，所述 文献特此出于所有目的并且特别是出于涉及六聚化标签或其它多聚化标签的所有教导的 目的而以引用的方式并入。在又另一实施方案中，本发明的六聚化标签包括根据图10中所 不的SEQ ID N0 :4的序列。
[0123] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白进行修 饰以便改变所述蛋白的一种或多种功能特性。在示例性实施方案中，所述可溶性Toso进 行化学修饰。例如，所述可溶性Toso蛋白可用一种或多种聚合物进行修饰以便改进其体 内稳定性和/或改变其药物代谢动力学曲线。这类聚合物包括但不限于以美国专利号 4,640,835 ;4, 496, 689 ;4, 301，144 ;4, 670, 417 ;4, 791，192 ;或 4, 179,337 中列出的方式的 多种非蛋白质聚合物中的一种或多种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述专利全部 特此出于所有目的并且特别是出于涉及将蛋白质连接至聚合物的所有教导的目的而以引 用的方式整体并入。
[0124] 本发明的范围内包括的Toso可溶性蛋白质的修饰包括使根据以上所讨论的任何 序列和可溶性Toso蛋白的Toso多肽的祀向氨基酸残基与能够与Toso多肽的选定侧链或 N或C末端残基反应的有机衍生化试剂反应。常用的交联剂包括例如1，1_双（重氮乙酰 基）-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯；同质双官 能亚氨酸酯（homobifunctional imidoester)，包括二琥拍酰亚氨基酯，如3, 3'-二硫代 双（琥珀酰亚氨基丙酸酯）；双官能马来酰亚胺，如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷；以及 剂如甲基 -3-[(p-叠氮基苯基）二硫代]丙亚氨酸酯。
[0125] 其它修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺成相应谷氨酰基和 天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化， 赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化[T.E. Creighton, Proteins :Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco,第 79-86 页（1983)]，N-末 端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
[0126] 本发明的范围内包括的可溶性Toso蛋白的另一种类型的修饰包括改变多肽的天 然糖基化模式。"改变天然糖基化模式"在本文为此意图意指缺失在天然序列Toso多肽中 发现的一个或多个碳水化合物部分和/或添加未存在于所述天然序列Toso多肽中的一个 或多个糖基化位点。
[0127] 添加糖基化位点至Toso可溶性蛋白质可通过改变其氨基酸序列来完成。改变可 例如通过向所述可溶性Toso蛋白的天然序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或取 代所述可溶性Toso蛋白的天然序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（针对0-连 接糖基化位点）。可溶性Toso蛋白氨基酸序列可任选地通过DNA层次上的变化来改变，尤 其通过使编码所述Toso可溶性蛋白质的DNA在预选的碱基处突变以使得产生将翻译成所 需氨基酸的密码子。
[0128] 增加Toso可溶性蛋白质上的碳水化合物部分的数目的另一手段是通过使糖苷化 学或酶偶联于多肽。这类方法在本领域中进行描述，例如描述于1987年9月11日公布的 W0 87/05330 中以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 页（1981)中， 所述文献特此出于所有目的并且特别是出于涉及改变蛋白质上的碳水化合物部分的所有 教示的目的而以引用的方式整体并入。
[0129] 去除存在于可溶性Toso蛋白上的碳水化合物部分可化学地或酶促地完成或通过 编码充当糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。化学去糖基化技术是本领 域已知的并且例如由 Hakimuddin 等人，Arch. Biochem. Biophys.，259 :52 (1987)和由 Edge 等人，Anal. Biochem.，118 :131 (1981)描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过 使用如由Thotakura等人，Meth. Enzymol.，138 :350(1987)所描述的多种内糖苷酶和外糖 苷酶来实现，所述文献特此出于所有目的并且特别是出于涉及改变蛋白质上的碳水化合物 部分的所有教示的目的而以引用的方式整体并入。
[0130] 本发明的可溶性Toso蛋白还可以形成包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合 的蛋白质的嵌合分子的方式进行修饰。在一个实施方案中，这种嵌合分子包含可溶性Toso 多肽与提供抗标签抗体可选择性地结合的表位的标签多肽的融合。表位标签通常位于Toso 多肽的氨基或羧基末端处。可使用针对标签多肽的抗体来检测Toso多肽的这类表位标记 形式的存在。此外，提供表位标签使能够使用抗标签抗体或与所述表位标签结合的另一种 类型的亲和力基质通过亲和纯化来容易地纯化所述Toso多肽。在一个替代实施方案中，嵌 合分子可包含Toso多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合。对于所述嵌合分子 的二价形式来说，这种融合可以是与IgG分子的Fc区的融合或GST融合。
[0131] 各种标签多肽及其对应抗体是本领域中熟知的。实例包括聚_组氨酸（聚-his) 或聚-组氨酸-甘氨酸（聚-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5[Field 等人，Mol. Cell Biol.，8 :2159-2165(1988)] ;c-myc 标签及其上的 8F9、3C7、6E10、G4、 B7 和 9E10 抗体[Evan 等人，Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985)]; 以及单纯疱疫病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等人，Protein Engineering, 3 (6) :547-553 (1990)]。其它标签多肽包括 Flag-肽[Hopp 等人，BioTechnology，6 : 1204-1210(1988)] ;KT3 表位肽[Martin 等人，Science，255:192-194 (1992)];微管蛋白表 位肽[Skinner 等人，J. Biol. Chem.，266 :15163-15166(1991)];以及 17 基因 10 蛋白质肽 标签[Lutz-Freyermuth 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87 ;6393_6397 (1990)]。
[0132] 在其它实施方案中并且根据上述中的任一项，本发明的可溶性Toso蛋白是与细 胞穿透肽融合。
[0133] 在其它方面，本发明涵盖编码一种或多种可溶性Toso蛋白的核酸以及包含这类 核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，根据本发明使用的宿主细胞包括但不限于J1EK293F、 HEK298T、Cos7、HeLa和CH0-DHFR缺陷的细胞。在仍然其它实施方案中，本发明的可溶性 Toso蛋白在已进行修饰以便在不含血清的悬浮液中生长的细胞系中稳定表达。
[0134] 在其它方面，本发明的组合物可包含本文所讨论的任何可溶性Toso蛋白连同添 加剂和药学上可接受的载体。如本文所用，"药学上可接受的载体"包括当与缀合物组合时 保留所述缀合物的活性并且不与受试者的免疫系统反应的任何材料。实例包括但不限于任 何标准的药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂（如油/水乳剂），以及各种类型的润 湿剂。其它载体还可包括无菌溶液，片剂（包括糖衣片剂）和胶囊。通常这类载体包含赋 形剂，如淀粉、奶、某些类型的白土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物 油脂或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这类载体还可包括调味剂和颜色添加剂或其 它成分。包含所述载体的组合物是通过熟知的常规方法进行配制。
[0135] III. Toso 的抗体
[0136] 一方面，本发明提供结合Toso蛋白的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体增 加Toso活性。在其它实施方案中，本发明的抗体减少Toso活性。
[0137] 制备抗体的方法通常是本领域中已知的。例如，美国专利号6, 727, 350公开了针 对Toso的抗体，所述专利特此出于所有目的并且特别是出于涉及针对Toso蛋白的抗体的 所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0138] 本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其衍生物 或片段，如以下所定义。一方面，片段包含抗体的CDR或可替代地基本上由抗体的CDR的组 成或更进一步由抗体的CDR组成。一方面，本发明的抗体是可检测地标记的或进一步包含 与它缀合的可检测标记。还提供一种产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本文进一 步提供包含上述实施方案中的一个或多个的组合物。
[0139] 还提供包含一种包含所述抗体和载体的组合物。进一步提供所述抗体的一种生物 活性片段或一种包含所述抗体片段的组合物。合适的载体在上文中定义。
[0140] 进一步提供一种包含所述抗体和与所述抗体特异性地结合的多肽、或可替代地基 本上由所述抗体和与所述抗体特异性地结合的多肽组成或还可替代地由所述抗体和与所 述抗体特异性地结合的多肽组成的抗体-肽复合物。一方面，所述多肽是针对其产生所述 抗体的嵌合多肽。
[0141] 本发明还提供一种能够与Toso特异性地形成复合物的抗体，所述抗体适用于本 发明的治疗性方法中。本发明的抗体包括但不限于小鼠、大鼠和兔或人抗体。抗体可在细胞 培养物中、在噬菌体中或在各种动物中产生，所述动物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大 鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿等。所述抗体还适用于鉴别和纯化治疗性多肽。
[0142] 本发明还提供一种包含上述抗体和与所述抗体特异性地结合的多肽、或可替代地 基本上由上述抗体和与所述抗体特异性地结合的多肽组成或还可替代地由上述抗体和与 所述抗体特异性地结合的多肽组成的抗体-肽复合物。一方面，所述多肽是针对其产生所 述抗体的多肽。一方面，所述抗体-肽复合物是分离的复合物。另一方面，所述复合物的抗 体是但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体或本文所描述的抗体衍生物。所述抗 体-肽复合物的抗体或肽中的任一者或两者可被可检测地标记或进一步包含与它缀合的 可检测标记。一方面，本发明的抗体-肽复合物可用作诊断测定或筛选测定中的对照或参 比样本。
[0143] 本发明的多克隆抗体可使用本领域中已知的常规技术来产生并且在文献中进行 了充分描述。存在一些方法学用于产生多克隆抗体。例如，多克隆抗体通常通过适合哺乳 动物的免疫来产生，所述哺乳动物如不限于鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、美洲驼、小鼠、大鼠和 兔。抗原被注射至所述哺乳动物中，所述抗原诱导B淋巴细胞产生对所述抗原具有特异性 的IgG免疫球蛋白。这种IgG是从哺乳动物的血清纯化的。这种方法学的变化形式包括佐 齐U、施用途径和部位、每部位注射体积和每动物部位的数目的修改以获得动物的最佳产生 和人性化治疗。例如，佐剂通常用于改进或增强对抗原的免疫应答。大多数佐剂提供注射 部位抗原储库，其允许抗原缓慢释放至引流淋巴结中。其它佐剂包括促进蛋白质抗原分子 在较大表面面积上的和免疫刺激分子的浓缩的表面活性剂。用于多克隆抗体产生的佐剂 的非限制性实例包括弗氏佐剂、Ribi佐剂系统和Titermax。多克隆抗体可使用美国专利 号 7, 279, 559 ;7, 119, 179 ;7, 060, 800 ;6, 709, 659 ;6, 656, 746 ;6, 322, 788 ;5, 686, 073 ;和 5, 670, 153中描述的方法来产生，所述专利特此出于所有目的并且特别是出于涉及抗体的 所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0144] 本发明的单克隆抗体可使用本领域中已知的和文献中充分描述的常规杂交瘤技 术来产生。例如，杂交瘤是通过使合适的无限增殖细胞系（例如，骨髓瘤细胞系如但不限 于5?2/0、5?2/0-六614、呢0、呢1、呢2、六￡-1、1.5、> 243、？3父63六§8.653、5?2 5六3、5?2嫩1、Sp2 SSl、Sp2 SA5、U397、MLA 144、ACT IV、M0LT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、C0S、RAJI、 NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEUR0 2A、CH0、PerC.6、YB2/0)或类似物、或杂合骨髓 瘤、其融合产物、或源自其的任何细胞或融合细胞、或如本领域中已知的任何其它适合的细 胞系（参见，例如在2007年11月26日最后一次访问的www. atcc. org，www. lifetech. com. 等）与以下各项融合来产生：产生抗体的细胞，如但不限于分离的或克隆的脾细胞、外周血 细胞、淋巴细胞、扁桃体细胞、或其它免疫细胞或含有B细胞的细胞；或表达重链或轻链恒 定区或可变序列或框架序列或CDR序列的任何其它细胞来产生，作为内源或异源核酸、作 为重组或内源病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿动 物、马、绵羊、山羊、绵羊、灵长类动物、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、 叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂合的等或其任何组合。产生抗 体的细胞还可从已用目标抗原进行免疫的人或其它合适的动物的外周血或优选地脾或淋 巴结获得。任何其它合适的宿主细胞还可用于表达编码本发明的抗体、其特定片段或变体 的异源或内源核酸。融合的细胞（杂交瘤）或重组细胞可使用选择性培养条件或其它合适 的已知方法进行分离，并且通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法进行克隆。
[0145] 在一个实施方案中，本文描述的抗体可使用多抗原肽（MAP)系统来产生。MAP系统 使用三个或七个径向分支的赖氨酸残基的肽基核心，可使用标准固相化学在所述肽基核心 上构建目标抗原肽。取决于通常占总分子量的小于10%的内核，赖氨酸核心产生携带肽表 位的约4至8个拷贝的MAP。所述MAP系统不需要用于缀合的载体蛋白。MAP中的抗原表 位的多个拷贝的高摩尔比和致密填充已经显示产生强免疫原性应答。这一方法描述于美国 专利号5, 229, 490中并且出于所有目的且特别是出于涉及MAP系统的所有教导的目的而以 引用的方式整体并入本文。
[0146] 可以使用产生或分离具有所需特异性的抗体的其它合适的方法，包括但不 限于使用本领域已知的方法从肽或蛋白质文库（例如但不限于，噬菌体、核糖体、寡 核苷酸、RNA、cDNA等展示文库；例如，如从各种商业销售商如Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg, Del.)、 Biovation (Aberdeen，Scotland，UK)、Bioinvent (Lund，Sweden)可获得）选择重组抗体 的方法。参见美国专利号 4, 704, 692 ;5, 723, 323 ;5, 763, 192 ;5, 814, 476 ;5, 817, 483 ; 5, 824, 514 ;5, 976, 862,所述专利特此出于所有目的并且特别是出于涉及与抗体有关的方 法的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。替代方法依赖于如本领域中已知和/或 如本文所描述的能够产生人抗体的谱系的转基因动物的免疫（例如SCID小鼠，Nguyen等 人（1997)Microbiol. Immunol. 41 :901_907 ;Sandhu等人（1996)Crit. Rev. Biotechnol. 16 : 95-118 ;Eren等人（1998) Immunol. 93 :154-161)。这类技术包括但不限于核糖体展示 (Hanes 等人（1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 ;Hanes 等人（1998)?1~〇。. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135);产生单细胞抗体的技术（例如，选择的淋巴细胞 抗体方法（"SLAM"）（美国专利号 5, 627, 〇52, Wen 等人（I987) J. Immunol. I7 :887-892 ; Babcook 等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848);凝胶微滴和流式细胞术 (Powell 等人（1990)Biotechnol.8 :333_337 ;单个细胞系统（Cambridge，Mass) ;Gray 等人 (1995) J. Imm.Meth. 182 :155-163 ;和 Kenny 等人（1995) Bio. Technol. 13 :787-790) ;B 细胞 选择（Steenbakkers 等人（1994)Molec.Biol. Reports 19:125-134,其特此出于所有目的 并且特别是出于涉及用于产生抗体的方法的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0147] 本发明的抗体衍生物还可通过将编码本发明的抗体的多核苷酸递送至适合的宿 主以便提供在其奶中产生这类抗体的转基因动物或哺乳动物（如山羊、牛、马、绵羊等）来 制备。这些方法是本领域中已知的并且描述于例如美国专利号5, 827, 690 ;5, 849, 992 ; 4,873,316 ;5, 849, 992 ;5, 994, 616 ;5, 565, 362 ;和 5,304,489 中，所述专利特此出于所有 目的并且特别是出于涉及产生抗体的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0148] 术语"抗体衍生物"包括对抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰。例如，美国 专利号6, 602, 684 B1 (其特此出于所有目的并且特别是出于涉及抗体的修饰的所有教导的 目的而以引用的方式整体并入）描述了一种用于产生修饰的二醇形式的抗体的方法和如 此产生的糖蛋白，所述抗体包括完整抗体分子、抗体片段或融合蛋白（其包括等效于免疫 球蛋白的Fc区的区）、具有增强的Fc介导的细胞毒性。
[0149] 抗体衍生物还可通过递送本发明的多核苷酸以便提供在植物部分中或在自其 培养的细胞中产生这类抗体、指定部分或变体的转基因植物和培养的植物细胞（例如但 不限于烟草、玉蜀黍和浮萍）来制备。例如，Cramer等人（1999)Curr.Top.Microbol. Immunol. 240 :95-118和在其中引用的参考描述了例如使用可诱导的启动子产生表达大量 重组蛋白的转基因烟草叶。转基因玉蜀黍已经用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白质， 所述蛋白质具有等效于在其它重组系统中产生或从天然来源纯化的那些的生物活性。参 见，例如Hood等人（1999)Adv. Exp. Med. Biol. 464 :127-147和在其中引用的参考文献。抗 体衍生物还已经自包括抗体片段如单链抗体（scFv' s)的转基因植物种子，包括烟草种子 和马铃薯块茎大量产生。参见，例如Conrad等人（1998) Plant Mol. Biol. 38 :101-109和在 其中引用的参考文献。因此，本发明的抗体还可根据已知方法使用转基因植物产生。
[0150] 抗体衍生物还可例如通过添加外源序列以便修饰免疫原性或减少、增强或修饰结 合、亲和力、结合速率（〇n-rate)、解离速率（off-rate)、亲合力、特异性、半衰期或任何其 它合适的特征来产生。通常部分或全部非人或人CDR序列被维持，而可变区和恒定区的非 人序列被人或其它氨基酸置换。
[0151] 一般来说，CDR残基（抗体片段的实例）直接并且最实质性地参与影响抗原结合。 本发明的抗体的人源化或工程化可使用任何已知方法来进行，所述方法如但不限于美国专 利号 5, 723, 323 ;5, 976, 862 ;5, 824, 514 ;5, 817, 483 ;5, 814, 476 ;5, 763, 192 ;5, 723, 323 ; 5, 766, 886 ；5, 714, 352 ；6, 204, 023 ；6, 180, 370 ；5, 693, 762 ；5, 530, 101 ；5, 585, 089 ； 5, 225, 539 ;和4, 816, 567中所描述的那些，所述专利特此出于所有目的并且特别是出于涉 及抗体的人源化或工程化的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0152] 用于制备部分至完全人抗体的技术是本领域中已知的并且可使用任何这类技 术。根据一个实施方案，在已经工程化以便表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中 制备完全人抗体序列。已经制备了可产生不同类别的抗体的这类转基因小鼠的多种品 系。可融合来自正在产生所希望的抗体的转基因小鼠的B细胞以便制备用于持续产生 所需抗体的杂交瘤细胞系。（参见例如，Russel等人（2000)Infection and Immunity 68(4) :1820-1826;Gallo 等人（2000)European J. of Immun. 30:534-540 ;Green(1999) J. of Immun.Methods 231:11-23 ;Yang 等人（1999A)J. of Leukocyte Biology 66: 401-410 ；Yang (1999B)Cancer Research 59(6) ：1236-1243 ；Jakobovits (1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31 ：33-42 ；Green&Jakobovits(1998)J. Exp.Med. 188 (3)： 483-495 ;Jakobovits(1998)Exp. Opin. Invest. Drugs7(4) :607_614;Tsuda 等人（1997) Genomics 42 :413_421 ;Sherman_Gold(1997)Genetic Engineering News 17(14) ；Mendez 等人（1997)Nature Genetics 15:146-156 ;Jakobovits(1996)Weir，s Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System 第 IV 卷，194.1-194. 7 ; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology6:561_566;Mendez 等人（1995) Genomics 26:294-307 ;Jakobovits(1994)Current Biology 4(8) :761_763;Arbones 等人（1994) Immunityl (4) :247-260; Jakobovits (1993) Nature 362 (6417) :255-258; Jakobovits 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6) :2551-2555;以及美国专利号 6, 075, 181。）
[0153] 本发明的抗体还可以进行修饰以便产生嵌合抗体。嵌合抗体是其中抗体的重链 和轻链的不同结构域由来自多于一种物种的DNA编码的那些抗体。参见，例如美国专利号 4, 816, 567。
[0154] 或者，本发明的抗体还可以进行修饰以便产生贴面化（veneered)抗体。贴面化抗 体是其中一种物种的抗体的外部氨基酸残基被审慎地置换或被第二物种的氨基酸残基"贴 面化"以使得所述第一物种的抗体在所述第二物种中将不是免疫原性的，从而减少所述抗 体的免疫原性的那些抗体。因为蛋白质的抗原性主要依赖于其表面的性质，所以抗体的免 疫原性可通过置换与通常在另一哺乳动物物种抗体中发现的那些残基不同的所暴露的残 基来减少。外部残基的这种审慎置换应对内部结构域或对结构域间接触具有很少作用或不 具有作用。因此，配体结合特性应不受局限于可变区框架残基的改变的结果影响。所述过 程被称为"贴面化"，因为仅抗体的外表面或外皮被改变，支持残基保持未受干扰。
[0155] 用于"贴面化"的程序利用由 Kabat 等人（1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版，Bethesda，Md.，国立卫生研究院汇编的人抗体可变结构 域的可供使用的序列数据、对这一数据库的更新以及其它可访问的美国和外国数据库（核 酸和蛋白质两者）。用于产生贴面化抗体的方法的非限制性实例包括EP 519596 ;美国专利 号 6,797,492;并且描述于？3(11311等人（1991)]\1〇1.1臟1111〇1.28(4-5):489-498 中。
[0156] 术语"抗体衍生物"还包括为具有两个抗原结合位点的小抗体片段的"双链抗体"， 其中片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域（VL)连接的重链可变结构域（VH)。（参 见，例如 EP 404,097 ;W093/11161 ;和 Hollinger 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 : 6444-6448。）通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述 结构域与另一链的互补结构域配对并建立两个抗原结合位点。（还参见，Chen等人的美国 专利号6, 632, 926,所述专利公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且 对靶抗原具有的结合亲和力比所述亲本抗体对所述抗原的结合亲和力强至少约两倍的抗 体变体。）
[0157] 术语"抗体衍生物"进一步包括"线性抗体"。用于制备线性抗体的程序是本领域 中已知的并且描述于Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10) : 1057-1062中。简言之，这些 抗体包含一对串联Fd区段（Vh-Ch1-VH-Ch1)，所述区段形成一对抗原结合区。线性抗体可以 是双特异性的或单特异性的。
[0158] 本发明的抗体可通过已知方法从重组细胞培养物回收并且纯化，所述方法包括但 不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸 纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高 效液相色谱法（"HPLC"）也可以用于纯化。
[0159] 本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物以及通过重组技术从真 核宿主（包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）或可替代地从如上描述的原核细 胞产生的产物。
[0160] 如果所测试的单克隆抗体与蛋白质或多肽结合，那么所测试的抗体和由本发明的 杂交瘤提供的抗体是等效的。还有可能在无过度实验的情况下确定抗体是否具有与本发明 的单克隆抗体相同的特异性，方法是通过确定所测试的抗体是否防止本发明的单克隆抗体 结合所述单克隆抗体通常与其反应的蛋白质或多肽。如果所测试的抗体与本发明的单克隆 抗体竞争，如通过由本发明的单克隆抗体结合的减少所示，那么很可能两种抗体结合相同 或密切相关的表位。或者，可将本发明的单克隆抗体与它通常与其反应的蛋白质一起预孵 育，并且确定所测试的单克隆抗体是否在其结合抗原的能力方面受到抑制。如果所测试的 单克隆抗体受到抑制，那么很可能它与本发明的单克隆抗体具有相同或密切相关的表位特 异性。
[0161] 术语"抗体"还意图包括所有同种型的抗体。单克隆抗体的具体同种型可直接通过 从初次融合选择来制备，或使用描述于Steplewski等人（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8653 或 Spira 等人（1984) J. Immunol. Methods 74 :307 中的程序通过使用同胞（sib) 选择技术以便分离类别转换变体来从分泌不同同种型的单克隆抗体的亲本杂交瘤继发地 制备。
[0162] 分泌具有本发明的单克隆抗体的特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤的分离还可 通过产生抗个体基因型抗体由本领域技术普通技术人员完成。Herlyn等人（1986) Science 232 :100。抗个体基因型抗体是识别存在于由目标杂交瘤产生的单克隆抗体上的独特决定 簇的抗体。
[0163] 两个杂交瘤的单克隆抗体之间的个体基因型同一性证明所述两种单克隆抗体是 相对于其识别相同表位决定簇来说相同的。因此，通过使用单克隆抗体上的表位决定簇的 抗体，有可能鉴别表达相同表位特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤。
[0164] 还有可能使用抗个体基因型技术来产生模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一 单克隆抗体制备的抗个体基因型单克隆抗体将在高变区中具有结合结构域，其是由所述第 一单克隆抗体结合的表位的镜像。因此，在这种情况下，抗个体基因型单克隆抗体可用于免 疫以产生这些抗体。
[0165] 在本发明的一些方面，可检测地或治疗性地标记所述抗体将是有用的。用于使抗 体缀合至这些药剂的方法是本领域中已知的。仅出于说明的目的，可使用可检测部分如放 射性原子、生色团、荧光团等标记抗体。这类标记的抗体可用于诊断技术，体内抑或在分离 的测试样本中。
[0166] 抗体与低分子量半抗原的偶联可增加抗体在测定中的灵敏度。半抗原然后可通 过二次反应特异性地检测。例如，通常使用半抗原如与抗生物素蛋白反应的生物素或二 硝基酚、吡哆醛和荧光素，所述半抗原能够与特异性抗半抗原抗体反应。参见，Harlow和 Lane (1988)同上。
[0167] 本发明的抗体还可与许多不同的载体结合。因此，本发明还提供含有所述抗体和 另一种物质（活性或惰性）的组合物。熟知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙 烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的 目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。本领域技术人员将了解用于结合单克隆抗 体的其它合适的载体，并且将能够使用常规实验确定所述载体。
[0168] 在某些实施方案中，本发明的抗体包括在恒定区中的突变，如与无这类突变的抗 体相比，所述突变改进所述抗体的药物代谢动力学特性。这类抗体将在某些实施方案中包 括源自C末端处的人IgGl的Fc结构域，所述抗体在又其它实施方案中包括减弱或消除抗 体依赖性和补体依赖性细胞毒性的突变。在仍然另一实施方案中，这类突变包括单独地 或以任何组合的以下突变中的一个或多个：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ; P331S。在又另一实施方案中，所述Fc结构域包含根据SEQ ID NO :3的序列（其在图10中 示出）。在仍然另一实施方案中，所述Fc结构域包含与SEQ ID N0:3具有约70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一 性的序列。
[0169] 在其它实施方案中，在抗体的一个或多个CDR中进行一种或多种氨基酸修饰。一般来说，任何单个⑶R中仅取代1或2或3个氨基酸，并且通常一组⑶R内进行不超过4、5、 6、7、8、9或10个改变。然而应理解，任何⑶R中没有取代、有1、2或3个取代的任何组合可 独立地且任选地地与任何其它取代相组合。
[0170] 在一些情况下，⑶R中的氨基酸修饰被称为"亲和力成熟"。"亲和力成熟的"抗体 是一个或多个CDR中具有一个或多个改变从而导致抗体对抗原的亲和力相较于不具有那 些一个或多个改变的亲本抗体得到改进的抗体。在一些情况下，尽管很少见，可能需要减小 抗体对其抗原的亲和力，但这通常并不是优选的。
[0171] 可进行亲和力成熟以使抗体对抗原的结合亲和力相较于"亲本"抗体增加至少约 10%至50-100-150%或更多，或1至5倍。优选的亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔 级或甚至皮摩尔级亲和力。亲和力成熟抗体通过已知的程序产生。参见，例如Marks等人， 1992, Biotechnology 10 :779-783,其描述通过可变重链（VH)和可变轻链（VL)结构域改 组的亲和力成熟。⑶R和/或框架残基的随机诱变描述于：例如Barbas等人1994, Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91 :3809-3813 ;Shier 等人，1995, Gene 169 :147-155 ;Yelton 等人， 1995, J. Immunol. 155 :1994-2004 Jackson 等人，1995, J. Immunol. 154(7) :3310-9 ;以及 Hawkins 等人，1992, J. Mol. Biol. 226 :889-896 中。
[0172] 或者，可在本发明的抗体的一个或多个CDR中进行"沉默的"氨基酸修饰，例如不 显著改变抗体对抗原的亲和力的修饰。这些修饰可出于许多原因进行，包括使表达最佳化 (如可对编码本发明的抗体的核酸所做的修饰）。
[0173] 因此，本发明的⑶R和抗体的定义内包括变异⑶R和抗体；也就是说，本发明的抗 体可包括Ab79和Abl9的一个或多个⑶R中的氨基酸修饰。此外，如以下概述，氨基酸修饰 也可独立地并且任选地地在⑶R以外的任何区，包括框架区和恒定区中进行。
[0174] 在一些实施方案中，本发明的抗体与药物缀合以形成抗体-药物缀合物（ADC)。一 般来说，ADC用于肿瘤学应用中，在所述应用中使用抗体-药物缀合物用于局部递送细胞毒 性或细胞生长抑制剂允许靶向递送药物部分至肿瘤，这可以允许更高的功效、更低的毒性 等等。这种技术的综述提供于Ducry等人，Bioconjugate Chem.，21 :5_13 (2010)、Carter等 人，Cancer J. 14(3) : 154 (2008)和 Senter，Current Opin.Chem. Biol. 13 :235-244 (2009) 中，所述文献特此出于所有目的并且特别是出于涉及抗体药物缀合物的所有教导的目的而 以引用的方式整体并入。
[0175] 因此，在一些实施方案中，本发明提供与药物缀合的Toso抗体。通常，缀合是通过 共价附接至抗体来进行，并且通常依赖于接头，经常是肽键联（如本领域中所已知，肽键联 可被设计成对靶位点处的蛋白酶裂解敏感或不敏感）。另外，如上所述，可通过附接至抗体 内的半胱氨酸来进行接头-药物单元（LU-D)的键联。如本领域技术人员将理解，每个抗体 的药物部分的数量可取决于反应的条件而变化，并且可在1 : 1至10 : 1药物：抗体之间 变化。如本领域技术人员将理解，实际数量是平均值。
[0176] 提供了可以是任何数量的药剂的ADC的药物，所述药剂包括但不限于细胞毒性 齐U，如化学治疗剂、生长抑制剂、毒素（例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或 其片段），或放射性同位素（即，放射性缀合物）。在其它实施方案中，本发明进一步提供了 使用所述ADC的方法。
[0177] 用于在本发明的抗体-药物缀合物中使用的药物包括细胞毒性药物，特别是用于 癌症治疗的那些。所述药物通常包括：DNA损伤剂、抗代谢物、天然产物以及它们的类似物。 细胞毒性剂的示例性类别包括：酶抑制剂，如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合酶抑制剂； DNA嵌入剂、DNA裂解剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素（anthracycline)家族的药物、长春 药物、丝裂霉素（mitomycin)、博来霉素（bleomycin)、细胞毒性核苷、蝶陡（pteridine)家 族的药物、烯二炔、鬼臼毒素、多拉司他汀（dolastatin)、类美登醇（maytansinoid)、分化 诱导剂、以及紫杉醇（taxol)。
[0178] 这些类别的成员包括，例如：甲氨蝶呤（methotrexate)、甲蝶呤 (methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿啼陡（5-fluorouracil)、6_巯基噪呤、阿糖胞 苷（cytosine arabinoside)、美法仑（melphalan)、长春罗新（leurosine)、长春罗新 地新（leurosideine)、放线菌素（actinomycin)、柔红霉素（daunorubicin)、阿霉素 (doxorubicin)、丝裂霉素 C、丝裂霉素 A、卡柔比星（caminomycin)、氨蝶呤（aminopterin)、 他利霉素（tallysomycin)、鬼臼毒素以及鬼臼毒素衍生物（如依托泊苷（etoposide)或磷 酸依托泊苷）、长春碱（vinblastine)、长春新碱（vincristine)、长春地辛（vindesine)、紫 杉烧（taxane)(包括紫杉醇（taxol)、泰索帝（taxotere)视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、 喜树喊（camptothecin)、卡奇霉素（calicheamicin)、埃斯波霉素（esperamicin)、烯二块、 多卡米新（duocarmycin)A、多卡米新SA、卡奇霉素、喜树碱、类美登醇（包括DM1)、甲基澳瑞 他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)、甲基澳瑞他汀F(MMAF)以及类美登醇（DM4)以及 它们的类似物。
[0179] 毒素可以用作抗体-毒素缀合物，并且包括细菌毒素，如白喉毒素；植物毒素， 如菌麻毒素；小分子毒素，如格尔德毒素（861(^1^1115^;[11)(1&111(1161'等人（2000)]\似1:. Cancer Inst.92(19) :1573-1581 ;Mandler 等人（2000)Bioorganic&Med.Chem. Letters 10 :1025-1028 ;Mandler 等人（2002)Bioconjugate Chem. 13 :786-791);类美登醇（EP 1391213 ;Liu 等人（1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623)，以及卡奇霉素（Lode 等人（l"8) Cancer Res. 58 :2928 ;Hinman 等人（I993) Cancer Res. 53 :3336-3342)。毒素 可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来施加它们的细胞毒性作用 和细胞生长抑制作用。
[0180] 涵盖Toso抗体与一种或多种小分子毒素（如类美登醇、多拉司他汀、澳瑞他汀、单 端孢霉烯、卡奇霉素以及CC1065)和具有毒素活性的这些毒素的衍生物的缀合物。
[0181] 根据上述中的任一项，可对本发明的抗体进行的另一种类型的修饰是糖基化中的 改变。在另一个实施方案中，本文公开的抗体可被修饰以便包括一种或多种工程化糖型 (glycoform)。如本文所用的"工程化糖型"意思是共价附接至抗体的碳水化合物组成，其 中所述碳水化合物组成在化学上不同于亲本抗体的碳水化合物组成。工程化糖型可适用于 多种目的，包括但不限于增强或减弱效应子功能。工程化糖型的示例性形式是无岩藻糖基 化（afucosylation)，其已被证实与ADCC功能的增加相关，这可能是通过与Fc Y Rllla受体 的较紧密结合而实现。在这种情形下，"无岩藻糖基化"意思是宿主细胞中产生的大多数抗 体大致上不含岩藻糖，例如90-95-98%的所产生抗体中没有可观量的岩藻糖作为抗体的碳 水化合物部分的组分（通常附接在Fc区中的N297处）。功能上定义的无岩藻糖基化抗体 通常表现出对FcyRIIla受体至少50%或更高的亲和力。
[0182] 工程化糖型可通过本领域中已知的各种方法产生（Umana等人，1999, Nat Biotechnol 17:176-180 ;Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng74:288_294;Shields 等人，2002, J Biol Chem 277:26733-26740 ;Shinkawa 等人，2003, J Biol Chem 278: 3466-3473 ;美国专利号6, 602, 684 ;美国序列号10/277, 370 ;美国序列号10/113, 929 ;PCT W000/61739A1 ;PCT TO 01/29246A1 ;PCT TO 02/31140A1 ;PCT TO02/30954A1，它们全部出 于所有目的并且特别是出于涉及工程化糖型的所有教导的目的以引用的方式整体并入。这 些技术中的许多技术是基于控制共价附接至Fc区的岩藻糖基化和/或平分型寡糖的水 平，例如通过于各种工程化的或其它生物体或细胞系（例如Lec-13CH0细胞或大鼠杂交瘤 YB2/0细胞）中表达IgG、通过调控涉及糖基化途径的酶（例如FUT8[a 1，6_岩藻糖基转移 酶]和/或0 1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶111[0111'111])、或通过在1§6被表达之后修饰 一种或多种碳水化合物来进行控制。例如，Seattle Genetics的"糖工程化抗体"或"SEA 技术"通过添加抑制产生期间的岩藻糖基化的修饰的糖而起作用；参见例如20090317869， 其特此以引用的方式整体并入本文。工程化糖型通常是指不同碳水化合物或寡糖；因此抗 体可包括工程化糖型。
[0183] 或者，工程化糖型可指包含不同碳水化合物或寡糖的变体。如本领域中所已知，糖 基化模式可取决于蛋白质的序列（例如存在或不存在以下所论述的特定糖基化氨基酸残 基）或产生蛋白质所处的宿主细胞或生物体两者。具体表达系统是本领域中已知的并且在 本文进行了论述
[0184] 多肽的糖基化通常是N-连接的糖基化或0-连接的糖基化。N-连接的是指碳水化 物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬 酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序 列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一者都会产生潜在糖基化位点。0-连接的糖基 化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者附接至羟基氨基酸，最通常是丝氨酸或 苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0185] 向抗体（或向任何其它多肽，如以上所论述的可溶性Toso蛋白）添加糖基化位点 宜通过改变氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一个或多个来完成（针对N-连接 的糖基化位点）。改变也可通过向起始序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或取代 起始序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（针对〇-连接的糖基化位点）。为方便 起见，抗体氨基酸序列优选通过DNA层次上的变化来改变，尤其通过使编码靶多肽的DNA在 预选的碱基处突变以使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
[0186] 增加抗体上的碳水化合物部分的数目的另一手段是通过使糖苷化学或酶促偶联 至蛋白质来达成。这些程序是有利的，因为它们不需要在具有N-连接的糖基化和0-连接 的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联模式，一种或多种 糖可附接至（a)精氨酸和组氨酸，（b)游离羧基，（c)游离硫氢基，如半胱氨酸的游离硫氢 基，（d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基，（e)芳族残基，如苯丙氨酸、 酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或（f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于W0 87/05330及 Aplin和 Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 页中，两者全部出于所有目的 并且特别是出于涉及将碳水化合物部分偶联至蛋白质的所有教导的目的而以引用的方式 整体并入。
[0187] 起始抗体上存在的碳水化合物部分的去除（例如翻译后）可用化学方法或酶方法 实现。化学去糖基化需要蛋白质暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。这种处理导致 除连接糖（N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺）之外的大多数或全部糖裂解，同时保持 多肤完整。化学去糖基化由 Hakimuddin等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52和Edge 等人，1981，Anal. Biochem. 118 :131描述，两者以引用的方式整体并入。多肽上的碳水化合 物部分的酶裂解可通过如由Thotakura等人，1987, Meth. Enzymol. 138 :350所描述使用各 种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，所述文献以引用的方式整体并入。可通过如由Duskin 等人，1982, J. Biol. Chem. 257 :3105所描述使用化合物衣霉素（tunicamycin)来防止潜在 糖基化位点处的糖基化。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键联的形成。
[0188] 另一类型的抗体共价修饰包括以例如Nektar Therapeutics的2005-2006PEG目 录（可从 Nektar 网站获得）美国专利号 4, 640, 835、4, 496, 689、4, 301，144、4, 670, 417、 4, 791，192或4, 179, 337中提及的方式将抗体连接至各种非蛋白质聚合物，包括但不限于 各种多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述文献都出于所有目的并且特别是出于 涉及将抗体连接至聚合物的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。此外，如本领域中 所已知，氨基酸取代可于抗体内的各种位置上进行以促进如PEG的聚合物的添加。参见例 如，美国公布号2005/0114037A1，其以引用的方式整体并入。
[0189] 本发明进一步包括编码本发明的Toso抗体的核酸。在重链恒定结构域和轻链恒 定结构域均包括于抗体中的情况下，通常使用编码各自的核酸来制作这些恒定结构域，所 述核酸被组合到标准宿主细胞（例如CH0细胞等）中，以便产生抗体的四聚体结构。如果 制作仅一个恒定结构域，将使用仅单个核酸。
[0190] 根据本发明使用的抗体的制剂可通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可 接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol， A.编辑[1980]) -起混合成冻干制剂或水溶液的形式来制备以供储存。可接受的载体、 赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、 柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂（如十八烷基二甲基 节基氯化铵、氯化六经季铵（hexamethonium chloride)、氯化苯二甲轻铵（benzalkonium chloride)、氯化节甲乙氧铵（benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或节醇、对轻苯甲酸烧 酯（如对羟苯甲酸甲酯或丙酯）、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇以及间-甲酚）；低分子 量（小于约10个残基）多肽；蛋白质，如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如 聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单 糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA ;糖，如蔗糖、甘 露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠离子；金属络合物（例如Zn-蛋白质络合物）； 和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇（PEG)。
[0191] 本发明的制剂也可含有所治疗的特定适应症所需要的多于一种活性化合物，优选 为具有互补活性并且不会不利地影响彼此的那些化合物。例如，可能需要提供具有其它特 异性的抗体。或者或此外，组合物可包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子 拮抗剂。这类分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
[0192] 所述活性成分也可围堵在例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊（例 如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚（甲基丙酸甲酯）微胶囊）中、胶状药物递送系 统（例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊）中、或巨乳液中。这类技术 公开于 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol，A?编辑（1980)中。
[0193] 待用于体内施用的制剂应当无菌或接近无菌。这可通过经无菌过滤膜过滤来容易 地实现。
[0194] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合 物的半透性基质，所述基质呈成形物品例如膜、或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包括 聚酯、水凝胶（例如聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美国专利号 3, 773, 919)、L-谷氨酸与.Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPR0NDEPOT'K'(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞 林组成的可注射微球）以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸 的聚合物能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。
[0195] 当囊封的抗体保留在体内持续长时间时，其可能会因暴露于37°C下的湿气而变 性或聚集，从而使生物活性丧失且可能使免疫原性发生变化。可取决于所涉及的机制设计 出合理策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫键交换而形成分子内 S--S键，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制湿气含量、使用适当添加剂以及 开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
[0196] IV.调节Toso活件的方法
[0197] 一方面，本发明涉及调节Toso活性的方法。在一个实施方案中，调节Toso活性的 方法包括抑制Toso活性。在其它实施方案中，调节Toso活性的方法包括增加Toso活性。
[0198] 在一些实施方案中，本发明的方法直接涉及调节Toso活性。在一个示例性实施方 案中，所述方法包括应用结合Toso的药剂如抗体。
[0199] 在其它实施方案中，间接地调节Toso活性，例如通过结合Toso的同源配体来调节 Toso活性。在一个示例性实施方案中，通过施用可溶性Toso蛋白来调节Toso活性。
[0200] 在其它实施方案中，通过多种机制的组合来调节Toso活性，例如通过施用包含结 合Toso的药剂的组合物与包含结合Toso的同源配体的药剂的组合物的组合来调节Toso 活性。在一个示例性实施方案中，这种组合物可包括但不限于Toso抗体和可溶性Toso蛋 白。
[0201] 如将理解，调节Toso活性的方法可包括使用以任何组合的本文所描述的任何组 合物，包括SEQ ID N0. 1-25中的任何一个或多个以及如本文所描述的其任何变体或修饰。
[0202] V.治疗病症的方法
[0203] -方面并且根据以上中的任一项，本发明提供通过用调节Toso活性的组合物（包 括但不限于可溶性Toso蛋白或Toso的抗体）治疗有需要的受试者来治疗病症的方法。
[0204] 在一个具体实施方案中并且根据以上中的任一项，本发明提供通过用包括可溶性 Toso蛋白的组合物治疗有需要的受试者来治疗病症的方法。不受理论限制，通过其可溶性 Toso蛋白是用于这些病症的有效治疗的一种潜在机制是通过调节Toso活性。在某些实施 方案中，根据本发明治疗病症的方法包括施用治疗有效量的本文所描述的任何可溶性Toso 蛋白，包括包含SEQ ID NO :1-25中的任何一个或多个的可溶性Toso蛋白或其任何变体。在 其它实施方案中，用于治疗病症（包括糖尿病、多发性硬化症、哮喘和癌症）的可溶性Toso 蛋白包括与 SEQ ID N0:l-25 中的任一个具有约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的多肽。所述多肽可进一步根据本文所描述 的方法进行修饰（包括化学修饰）以用于治疗本文所描述的任何病症。
[0205] 在其它方面，本发明涉及通过向受试者施用可溶性Toso蛋白（或其变体）来治疗 病症和疾病的方法。本发明的可溶性Toso蛋白可用于治疗患有但不限于以下各项的受试 者：自身免疫性病症（包括但不限于1型糖尿病、多发性硬化症或类风湿关节炎）、2型糖 尿病、哮喘、过敏症、慢性阻塞性肺病（"C0PD"）、高-IgM综合症、狼疮、癌症或中性白细胞 增多症相关的病症（包括但不限于中性粒细胞减少症、重度先天性中性粒细胞减少症、环 状中性粒细胞减少症、抗体介导的中性粒细胞减少症、网状发育不良、白细胞粘附缺陷、常 见骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、常见感冒荨麻疹和白细胞增多以及慢性肉芽肿 病）。如将理解，本文所描述的任何可溶性Toso蛋白均可单独地或以任何组合用于治疗任 何这些病症或疾病。
[0206] 在其它实施方案中，将药学上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受试 者以便治疗本文所讨论的任何病症。在一些实施方案中，施用至受试者的可溶性Toso蛋白 包括细胞外Toso结构域和/或Fc结构域和/或信号序列和/或柔性接头。在仍然其它实施 方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :1-25中的任一个的序列。还可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一个的组合（作为单独的多肽或一起作为融合蛋白）以便治疗本文所讨 论的任何病症。所述多肽还可根据本文的描述进行进一步修饰（包括化学修饰）以便治疗 所述病症。在仍然其它实施方案中，用于治疗本文所描述的任何病症的可溶性Toso蛋白具 有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在图8中示出）。在又其它实施方案中，施用至受试者以 用于治疗本文所讨论的任何病症的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5具有至少约70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。 在其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗本文所讨论的任何病症的可溶性Toso蛋白 具有与 SEQ ID N0 :5 具有约 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% _96%、91% -99%、 92% -98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它实施方案中，施用至受试者 以用于治疗本文所讨论的任何病症的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11. 12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代的5￡〇10勵.5。在又其它实施方案 中，施用至受试者以用于治疗糖尿病的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、 5-10、6-9、7-8个氨基酸取代的SEQ ID N0:5。在其它示例性实施方案中，将约12. 1、12. 2、 12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、 13. 9、14mg的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。如将理解，可溶性Toso蛋白 的量可使用用于将来自实验动物的剂量转换至人的广泛接受的体表面积（BSA)标准化方 法基于动物研究来确定。（参见 Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇
[0207] 在具体实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗处于1型糖尿病或2型糖尿 病的风险或具有1型糖尿病或2型糖尿病的受试者。在其它实施方案中，将药学上可接受量 的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，施用至受试者以便治疗糖 尿病的可溶性Toso蛋白包括细胞外Toso结构域和/或Fc结构域和/或信号序列和/或接 头。在仍然其它实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :1-25中的任一个的 序列或本文所讨论的SEQ ID N0 :1-25的任何变体。在又其它实施方案中，施用至受试者以 用于治疗糖尿病的可溶性Toso蛋白包括与SEQ ID N0 :1-25中的任一个具有至少约70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。 还可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一个的组合（作为单独的多肽或一起作为融合蛋白）以 便治疗糖尿病。所述多肽还可根据本文的描述进行进一步修饰（包括化学修饰）以便治疗 糖尿病。在仍然其它实施方案中，用于针对糖尿病治疗受试者的可溶性Toso蛋白具有包含 SEQ ID N0 :5的序列（其在图8中示出）。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗 糖尿病的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。在其它实施方案中，施 用至受试者以用于治疗糖尿病的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5具有约75%-99%、 80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、92%-98%、93%-97%、94%-96%同一 性的序列。在仍然其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗糖尿病的可溶性Toso蛋白包 含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸取代的SEQ IDNO. 5。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗糖尿病的可溶性Toso蛋白包含 具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8个氨基酸取代的5￡0 1〇勵：5。在仍然其它实 施方案中，用根据本文所描述的任何组合物的可溶性Toso蛋白治疗用于改进受试者中的 葡萄糖耐量，并且由此治疗糖尿病。在示例性实施方案中，将约10-20、11-19、12-18、13-17、 14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。在其它示例性实施方案中， 将约 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、 11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、 13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、 14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可 溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。如将理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于 将来自实验动物的剂量转换至人的广泛接受的体表面积（BSA)标准化方法基于动物研究 来石角定° (参见 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M.和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。对于本文进一步详细地描述的 实验来说，50 y g剂量用于疾病模型中，所述剂量在20g小鼠中将大约是2. 5mg/kg。使用 BSA转换，所述剂量将是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或对于60kg成人来说大约12. 2mg。
[0208] 在其它实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗处于多发性硬化症的风险或 具有多发性硬化症的受试者。在其它实施方案中，将药学上可接受量的可溶性Toso蛋白 施用至有需要的受试者以用于治疗或改善多发性硬化症。在一些实施方案中，施用至受试 者的可溶性Toso蛋白包括和Fc结构域和/或柔性接头。在一些实施方案中，施用至受试 者的可溶性Toso蛋白包括细胞外Toso结构域和/或Fc结构域和/或信号序列和/或接 头。在仍然其它实施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :1-24中的任一个 的序列。还可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一个的组合（作为单独的多肽或一起作为融合 蛋白）以便治疗多发性硬化症。所述多肽还可根据本文的描述进行进一步修饰（包括化 学修饰）以便治疗多发性硬化症。在仍然其它实施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包 含SEQ ID N0 :5的序列（其在图8中示出）。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于 治疗多发性硬化症的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5具有至少约70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。在其它实施 方案中，施用至受试者以用于治疗多发性硬化症的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5具 有约 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、91% -99%、92% -98%、93% -97%、 94% -96%同一性的序列。在仍然其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗多发性硬化 症的可溶性 Toso 蛋白包含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20个氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗多发性 硬化症的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8个氨基酸取代 的SEQ ID N0 :5。在仍然其它实施方案中，用根据本文所描述的任何组合物的可溶性Toso 蛋白治疗用于延迟多发性硬化症的进展。在示例性实施方案中，将约10-20、11-19、12-18、 13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。在其它示例性实施方 案中，将约 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、 11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、 12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、 14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。如将理解，可溶性Toso蛋白的量可使 用用于将来自实验动物的剂量转换至人的广泛接受的体表面积（BSA)标准化方法基于动 物研究来确定。（参见 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。对于本文进一步详细地 描述的实验来说，50ii g剂量用于疾病模型中，所述剂量在20g小鼠中将大约是2. 5mg/kg。 使用BSA转换，所述剂量将是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或对于60kg成人来说大约12. 2mg。
[0209] 在其它实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗处于关节炎的风险或具有关 节炎的受试者。在其它实施方案中，将药学上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的 受试者以用于治疗或预防关节炎。在一些实施方案中，施用至受试者的可溶性Toso蛋白包 括和Fc结构域和/或接头。在一些实施方案中，施用至受试者的可溶性Toso蛋白包括细 胞外Toso结构域和/或Fc结构域和/或信号序列和/或接头。在仍然其它实施方案中， 所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID N0 :1-25中的任一个的序列。还可使用SEQ ID N0: 1-25中的任一个的组合（作为单独的多肽或一起作为融合蛋白）以便治疗关节炎。所述多 肽还可根据本文的描述进行进一步修饰（包括化学修饰）以便治疗关节炎。在仍然其它实 施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在图8中示出）。在又 其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗关节炎的可溶性Toso蛋白具有与SEQ ID N0. 5 具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%同一性的序列。在其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗关节炎的可溶性Toso蛋 白具有与 SEQ ID 勵.5具有约75%-99%、80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、 92% -98%、93% -97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它实施方案中，施用至受试者 以用于治疗关节炎的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20个氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它实施方案中，施用至受试者以 用于治疗关节炎的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8个氨基 酸取代的SEQ ID N0 :5。在仍然其它实施方案中，用根据本文所描述的任何组合物的可溶 性Toso蛋白治疗用于预防关节炎的发病或针对关节炎的严重程度进行保护。
[0210] 在具体实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗处于哮喘的风险或具有哮喘 的受试者。在其它实施方案中，将药学上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受试 者。在一些实施方案中，施用至受试者以便治疗哮喘的可溶性Toso蛋白包括细胞外Toso 结构域和/或Fc结构域和/或信号序列和/或接头。在仍然其它实施方案中，所述可溶性 Toso蛋白包含根据SEQ ID N0:l-25中的任一个的序列或本文所讨论的SEQ ID N0:l-25 的任何变体。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗哮喘的可溶性Toso蛋白包 括与 SEQ ID N0:l-25 中的任一个具有至少约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。还可使用5￡0 1〇勵.：1-25中的 任一个的组合（作为单独的多肽或一起作为融合蛋白）以便治疗哮喘。所述多肽还可根 据本文的描述进行进一步修饰（包括化学修饰）以便治疗哮喘。在仍然其它实施方案中， 用于针对哮喘治疗受试者的可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在图8中 示出）。在又其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗哮喘的可溶性Toso蛋白具有与 SEQ ID 吣.5具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %冋一性的序列。在其它实施方案中，施用至受试者以用于治疗哮喘的可溶 性 Toso 蛋白具有与 SEQ ID NO. 5 具有约 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、 91% _99%、92% _98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它实施方案中，施 用至受试者以用于治疗哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、 14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代的5￡〇10勵.5。在又其它实施方案中，施用至 受试者以用于治疗哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8 个氨基酸取代的SEQ ID NO :5。在仍然其它实施方案中，用根据本文所描述的任何组合物 的可溶性Toso蛋白治疗用于改进受试者中的葡萄糖耐量，并且由此治疗哮喘。在示例性实 施方案中，将约10-20、11-19、12-18、13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获 得治疗作用。在其它示例性实施方案中，将约l〇、l〇. l、l〇. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、 10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、 12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、 14、 14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、 15、 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg的可溶性Toso蛋白施用至受试者以获得治疗作用。如将理解， 可溶性Toso蛋白的量可使用用于将来自实验动物的剂量转换至人的广泛接受的体表面积 (BSA)标准化方法基于动物研究来确定。（参见Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和Admad，N.Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇 对 于本文进一步详细地描述的实验来说，50 y g剂量用于疾病模型中，所述剂量在20g小鼠中 将大约是2. 5mg/kg。使用BSA转换，所述剂量将是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或对于60kg 成人来说大约12. 2mg。
[0211] 在其它实施方案中，本文所描述的可溶性Toso蛋白，包括包含SEQ ID NO. 1-25的 多肽中的任何一种或多种的可溶性Toso蛋白是呈用作药剂的形式。在其它实施方案中，本 发明提供一种用作药剂的可溶性Toso蛋白，所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 的多肽中的任何一 种或多种（或任何一种或多种的一部分）。在仍然其它实施方案中，本发明提供用于使用包 含SEQ ID N0. 1-25的多肽中的任何一种或多种的可溶性Toso蛋白用于治疗以下病症中的 任一种的方法：自身免疫性病症（包括但不限于1型糖尿病或2型糖尿病、多发性硬化症或 类风湿关节炎）、哮喘、过敏症、慢性阻塞性肺病（"C0PD")、高-IgM综合症、狼疮、癌症或中 性白细胞增多症相关的病症（包括但不限于中性粒细胞减少症、重度先天性中性粒细胞减 少症、环状中性粒细胞减少症、抗体介导的中性粒细胞减少症、网状发育不良、白细胞粘附 缺陷、常见骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、常见感冒荨麻疹和白细胞增多以及慢性 肉芽肿病）。
[0212] 如以上所讨论，在一些实施方案中，本发明的可溶性Toso蛋白用于治疗癌症。在 其它实施方案中，根据本发明的治疗癌症的方法包括通过调节Toso活性来抑制肿瘤侵袭 和/或转移的方法。在示例性实施方案中，本发明的组合物用于治疗有需要的受试者中的 腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤或畸胎癌的组中的任一个。在其它实施方案 中，本发明的组合物用于治疗患有以下中的一个或多个中的癌症的受试者：肾上腺、膀胱、 骨、骨髓、脑、乳房、子宫颈、胆囊、神经节、胃肠道、心脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁 腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、甲状腺或子宫。
[0213] 实施例1 :T〇S〇在关节炎的发病机制中起作用
[0214] 将TOSO+小鼠和野生型小鼠皮下注射于完全弗氏佐剂中的II型鸡胶原并且监测 随时间推移的疾病进展。暴露于II型胶原的动物发展具有与人类风湿性关节炎（RA)类似 的免疫学、病理学和组织学特征的疾病。如使用数字测径器通过踝关节厚度的变化测量的 关节炎症在T〇S〇+小鼠中显著减轻（图1A)。此外，基于可见肿胀和活动性针对每个关节 从0-4对疾病严重程度进行计分。与野生型对照相比，TOSO+小鼠具有显著降低的临床得 分（图1B)。对引流淋巴结中的淋巴细胞群体的流式细胞术分析显示B220+B细胞的显著减 少（图1C)。这些数据表明Toso在关节炎的发病机制中具有重要作用。
[0215] 实施例2 :用Toso-Fc治疗针对关节炎进行保护
[0216] 这个实施例显示用Toso-Fc(SEQIDN0 :5)治疗针对关节炎进行保护。将易患关 节炎的小鼠DBA1腹膜内预先给药50ygToso-Fc，用于完全弗氏佐剂中的II型胶原进行免 疫以便诱导疾病，并且然后在实验过程中每周三次用Toso-Fc进行治疗。Toso-Fc治疗的 小鼠被针对疾病的严重程度和发病率两者保护，从而表明Toso-Fc施用可适用于管理关节 炎。例如，图24A示出如与对照小鼠（仅用媒介物治疗）相比，累加关节炎得分在Toso-Fc 治疗的小鼠中是可忽略不计的。类似地，图24B也示出如与对照相比，关节炎的发病率百分 比在Toso-Fc治疗的小鼠中是可忽略不计的。关节炎的临床症状被评定如下：0=正常，1 =轻微肿胀和/或红斑，2 =显著肿胀，3 =关节强直。添加每个小鼠的单独肢得分，从而得 到12的最大疾病得分。当观察到小鼠在一个肢中具有1的疾病得分时，注意到疾病的发病 率。
[0217] 图25提供显示来自用胶原刺激的Toso-Fc治疗的小鼠和媒介物治疗的小鼠的脾 细胞的回忆应答（增殖）的另外数据。如图中所示，来自用Toso-Fc治疗的小鼠的脾细胞 显示比来自媒介物治疗的对照的脾细胞减少的增殖应答。
[0218] 实施例3 :-旦关节炎形成，Toso-Fc是针对所述疾病有效的
[0219] 如以上所示，Toso-Fc的预防性施用在类风湿性关节炎的鼠类模型中改善疾病症 状。这个实施例显示施用Toso-Fc在治疗性背景下（S卩，当疾病已经形成时）也是有效的。
[0220] 将雌性DBA. 1小鼠（6至8周大）随机分配成2组，当观察到疾病时一组接受媒介 物治疗，并且另一组接受Toso-Fc。将所有小鼠用胶原进行接种以便诱导疾病。在免疫后第 43天观察到疾病症状的引发。将所述动物在第52天时用媒介物对照或Toso-Fc进行治疗， 如由曲线上的箭头所指示（图26)。在第57天之后，Toso-Fc的治疗性施用显著降低总疾 病得分和关节炎发病率（参见图26)。这些数据指示当疾病已经形成时，Toso-Fc可有效地 管理关节炎症状，并且因此可以在治疗性以及预防性背景下是有效的。
[0221] 实施例4 :Toso在哮喘的发展中起作用
[0222] 哮喘是以异常TH2活化、IgE的产生、支气管高反应性以及白细胞外渗至支气管粘 膜中的过敏性病症。嗜酸性粒细胞增多是过敏性哮喘的标志并且被认为是炎症中的关键参 与者。哮喘的病理表现引起肺收缩，从而导致气喘、呼吸短促、胸闷和咳嗽。
[0223] 对Toso-/-小鼠和野生型小鼠进行0VA诱导的哮喘模型（图2A)。在第0天、第7 天和第14天腹膜内递送OVA (10mg/kg)。小鼠然后在第21天、第22天和第23天接受雾化 0VA(lmg/ml)达30分钟，并且在2天之后处死。如通过DifQuik染色所评定，Toso-/-小鼠 在嗜酸性粒细胞迁移至支气管肺泡空间方面具有显著减少（图2B)。基于形态，通过对每个 载玻片至少200个白细胞进行计数来量化嗜酸性粒细胞（图2C)。
[0224] 哮喘和其它过敏性疾病典型特征具有天然T细胞优先分化成TH2细胞的典型特 征。评定了支气管肺泡灌洗液（BALF)中TH2相关细胞因子和趋化因子的存在。如通过 ELISA所评定，Toso-/-小鼠在BALF中具有0VA诱导的TH2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13 的显著减少（图3A-C)。与受阻抑的嗜酸性粒细胞迁移至肺中一致，Toso-/-小鼠在BALF 中具有显著减少的嗜酸性细胞活化趋化因子（一种嗜酸性粒细胞虏获C-C趋化因子）（图 3D)。支气管平滑肌细胞已知响应于TNF a产生嗜酸性细胞活化趋化因子。既然Toso已知 在肺中表达，并且Toso缺陷使小鼠对TNF顽固，本发明人寻求解决Toso对嗜酸性粒细胞趋 化因子水平的作用是否是肺固有的。培养的Toso-/-支气管平滑肌细胞具有显著降低的响 应于TNF a治疗产生的嗜酸性粒细胞趋化因子的水平（图3E)。这些数据一起表明Toso缺 陷影响肺中的0VA诱导的TH2细胞因子和嗜酸性粒细胞趋化因子水平。
[0225] 过敏性哮喘的一个标志是IgE的过量产生。产生抗体的B细胞被诱导以便由TH2 细胞因子如 IL-4 产生 IgE(0ettgen，H.C?和 R.S.Geha，IgE regulation and roles in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol，2001.107(3) :p. 429-40)。血清中 OVA诱 导的总IgE水平和OVA特异性IgE水平在Toso-/-小鼠中受到显著阻抑（图4A和B)，而 0VA特异性IgGl在野生型和敲除的之间类似（图4C)。这些数据表明Toso的遗传消融或 可能治疗性阻断可以减少IgE的产生。
[0226] 代表过敏性气喘的炎症事件在引起限制气流至肺的气道重塑中达到顶点。因此， 通过使用全身体积描记法测量响应于增加的乙酰甲胆碱剂量的增强间歇（Penh)来评定 Toso缺陷是否影响0VA诱导的气道高反应性。Toso-/-小鼠被显著保护免于0VA诱导的气 道高反应性，如通过与野生型对照相比Penh值的显著降低所指示（图5)。这些数据表明 Toso阻断是用于减轻过敏性哮喘中的气道反应性的有效策略。
[0227] 实施例5 :Toso消融影响树突细胞活性
[0228] Toso消融对过敏性和炎性疾病的发作具有广泛作用。一种可能的非限制性机制 是Toso在全局水平下调控这些疾病过程，可能通过树突细胞（DC)将抗原呈递至天然T细 胞的功能。
[0229] 为了测试TOSO+树突细胞在疾病的发作或在T细胞的活化中的功能相关性，本发 明人确定负载抗原的T 〇S〇-/-DC的转移是否引发与野生型对应受体类似的疾病过程。
[0230] 通过与GM-CSF -起培养来制备源自野生型和Tosof骨髓的DC (参见Lutz， M. B.等人，An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods,1999. 223(1)： p. 77-92,所述文献特此出于所有目的并且特别是出于关于培养树突细胞的所有教导的 目的而以引用的方式整体并入）。与Lambrecht等人的方案类似，本实验中的DC负载有 0VA。将负载抗原的DC滴入C57BL6动物的气管中（参见Lambrecht，B. N.，等人，Myeloid dendritic cells induce Th2 responses to inhaled antigen，leading to eosinophilic airway inflammation. J Clin Invest，2000. 106(4) :p. 551-9,所述文献特此出于所有目 的并且特别是出于涉及树突细胞的所有教导的目的而以引用的方式并入）。一周之后，将动 物按照哮喘研究用雾化0VA进行治疗持续连续三天。显著地，负载0VA的T 〇S〇f树突细胞与 野生型对照相比在其诱导至BALF中的TH2细胞因子产生的能力方面被显著降低（图7A)。 2d2TCR转基因品系包含对用于引发EAE的M0G35-55肽具有特异性的T细胞（Bettelli， E.，等人，Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med, 2003.197(9)： p. 1073-81)。源自2d2小鼠的T细胞未能在与负载M0G35-55的Tos〇-/-DC共培养时增 殖（图7B)。在大鼠胰岛素启动子（RIP)的控制下表达来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠发展糖尿病，如通过增加的血清葡萄糖水平所评定。类似 地，接受负载GP肽的DC的RIP-GP发展疾病。T 〇S〇-/-DC显示与野生型对照相比在其引发 疾病的能力方面的损伤，并且接受负载肽的T〇S〇-/-DC的RIP-GP小鼠比接受负载肽的野生 型DC的那些小鼠显著更好地存活（图7C)。这些结果一起表明Toso对于树突细胞活化T 细胞并且诱导疾病的能力来说是必要的。
[0231] 实施例6 :施用可溶性Toso蛋白废除哮喘疾病量度
[0232] 为了产生可溶性受体，将来自人脾cDNA文库的Toso的胞外结构域进行扩 增并且然后用源自C末端处的人IgGl的Fc结构域框内克隆至IL2信号序列下游的 pFuse-hIgGle3-Fc2中，从而允许最佳分泌至培养物上清液中（图8A-信号序列由盒指示， 并且Fc结构域用下划线指示）。此外，Fc区包含几种突变（E233P/L234V/L235A/AG236/ A327G/A330S/P331S)，所述突变已经显示消除抗体依赖性和补体依赖性细胞毒性。当体内 施用时，这些突变可增强蛋白质的半衰期并且赋予有利的药物代谢动力学曲线。将这种 Toso-Fc构建体以及空载体对照使用自由式表达系统转染至于400ml的不含血清的培养基 细胞中的3x 108个293F细胞中。两天之后，收集上清液并且将细胞重悬浮于另外400ml的 培养基中。在再培养2天之后，收集第二上清液并且将其与第一上清液组合。使用ELISA 来确认Toso-Fc可溶性受体的分泌（图8B)，通过蛋白质G色谱法进行纯化，并且用lOOmM 甘氨酸（pH 2. 3)洗脱。将lml洗脱液级分收集至60 ill的中和缓冲液（1M Tris pH 9. 5) 中并且通过使用针对Fc区的抗体蛋白质印迹（图8C i)和考马斯蓝染色（图8Cii)进行 确认。
[0233] 在鼠类脾细胞上测试所述可溶性受体的结合。将大约106个细胞与指示量的于 100 ii 1 FACS染色缓冲液（PBS+1 % BSA+0. 05% NaN3)中的Toso-Fc在冰上一起孵育2小 时。将细胞在FACS缓冲液中进行洗涤并且与FITC缀合的抗人FC g F(ab'）2片段在冰上 一起孵育30分钟，并且在FACS Canto流式细胞仪上获得。大约10%的脾细胞在10 y g下 结合至所述可溶性受体（图8D)。纯化的Fc蛋白质独自不显示与脾细胞的显著结合，从 而表明Toso-Fc结合是特异性的。进一步详细的分析指示Toso-Fc最显著地结合脾中的 ⑶llc+MHChi成熟树突细胞或⑶11C+B220+浆细胞样DC (图8E)。这些数据说明Toso-Fc 可溶性受体是功能性的，并且Toso的配体可被表达于成熟树突细胞上。
[0234] 在0VA诱导的哮喘的鼠类模型中评定了 Toso-Fc施用的治疗性效用。疾病是如以 上所描述在略微修改的情况下引发。将雌性BALB/c小鼠如所描述进行治疗，除了在雾化 0VA激发之前腹膜内施用50 y g的Toso-Fc持续连续3天（图9A)。通过评估BALF中的Th2 细胞因子（图9B)、BALF中的细胞结构（图9C)来评定疾病的严重程度。用Toso-Fc预治 疗显著废除疾病度量，从而表明施用Toso-Fc可以是哮喘管理中的有用治疗模式。
[0235] 实施例7 :Toso是治疗多发性硬化症的潜在靶标
[0236] 实验性自身免疫性脑炎（EAE)是用于人MS的有用小鼠模型。这一系统涉及 CD4+TH1/TH17细胞的抗原依赖性活化和导致脱髓鞘的单核细胞的血管周围积聚以及后肢 麻痹。在C57BL/6背景下，EAE被认为是慢性进行性的，因为疾病随时间增加并且是通过注 射髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽M0G35-55与完全弗氏佐剂中的百日咳毒素引发的。每日 从0至5对疾病严重程度进行计分持续大约1个月（其中0 =无疾病病征，1 =跛行的尾 部或后肢虚弱但不是两者，2 =跋行的尾部和后肢虚弱,3 =部分后肢麻搏,4 =完全后肢麻 搏,5 =垂死状态或由于EAE死亡）。
[0237] 在上述M0G诱导的模型中，与野生型对照相比，Toso-/-小鼠被明显保护免于EAE 的发作（图6)。这些数据表明阻断Toso功能可以代表用于MS的新颖治疗策略。
[0238] 实施例8 :用Toso-Fc治疗延迟EAE的发作
[0239] 这个实施例证明用Toso-Fc (SEQ ID N0 :5)治疗延迟EAE的发作。如以上所讨论， EAE小鼠模型是用于人MS的有用模型。对于图23A中描绘的实验来说，将C57BL/6小鼠在 用诱导疾病的M0G肽进行免疫之前用Toso-Fc进行预治疗。在免疫之后，将小鼠每周三次 腹膜内使用50 y g Toso-Fc (或对于对照小鼠来说PBS)进行治疗持续30天。如图23B中 所示，Toso-Fc延迟EAE的进展，从而显示Toso-Fc在多发性硬化症中的缓和作用。
[0240] 实施例9 :T〇S〇减弱先天性抗细菌免疫应答
[0241] 这个实施例证明粒细胞在细菌感染之后在Toso缺陷的小鼠中早期活化并且对于 控制病原体来说是必要的。Toso缺陷的粒细胞显示增强的⑶lib和⑶18表达并且展示降 低的活化阈值。与这些结果一致，Toso缺陷的粒细胞显示在周围组织中的炎症部位处的减 少的效应子功能。由于改变的粒细胞功能，Toso缺陷的小鼠未能清除全身性李斯特氏菌感 染，从而导致Toso缺陷的小鼠的快速死亡。因此，Toso影响粒细胞的活化阈值和效应子功 能，并且因此关键性地减弱先天性抗细菌免疫应答。
[0242] 材料和方法
[0243] 小鼠：短序列是使用源自小鼠Toso cDNA序列的一系列低聚物通过对文库分离的 基因组DNA片段进行测序来获得。6.5kbp片段是使用Bglll限制消化酶从5'端分离的 并且被用作敲除构建体的长臂。650bp短臂是使用源自所述基因的3'端的序列的低聚物 (5, GTGAATACGTGAGCTTGGGCTACC 3' SEQ ID N0 :1 和 5' CAAGTGATGG GGGATTACAGTGAA3' SEQ ID N0 :2)通过聚合酶链式反应产生的。将长臂和短臂以与Toso翻译正义相同的定向连 接在新霉素抗性盒的任一端上。这种敲除构建体位点特异性插入胚胎干（ES)细胞基因组 DNA中首先使用在Neo的3'端中和在所述短臂的3'端下游的基因组DNA侧翼区中设计的 引物通过聚合酶链式反应（PCR)来进行筛选。使用三种引物对小鼠进行筛选。共用引物 (5'TGTTTAATATGATGTGTCAGGCTG 3'SEQ ID N0:3)位于短臂区中并且两种其它引物是来自 Neo 的 3' 区（5, AGGGCCAGCTCAITCCTCCCACTCAT 3' SEQ ID N0 :4)或通过所述敲除构建体 切除的 DNA 的 3' 区（5'AACTCTGCCCCTGCTCCTTCAITTCC 3'SEQ ID N0:5)。如此从重排的 等位基因获得的条带具有400bp并且天然基因的条带是450bp。将D3ES细胞用敲除构建 体进行电穿孔并且在存在SOOyg/ml G418的情况下生长。然后将阳性ES克隆注射至源自 E3. 5 C57/BL6的胚泡中。针对重排等位基因的存在筛选嵌合子代并且将其与C57BL/6背景 回交。0)1 ltT^小鼠源自C57BL/6背景的Jackson。
[0244] 骨髓嵌合小鼠：将小鼠用1050rad进行致死辐射处理并且用107⑶45. 1WT骨髓细 胞或107CD45. 2T0S0-A骨髓细胞或5x 106CD45. 1WT骨髓细胞加5x 106CD45. 2T0S0+骨髓细 胞进行重构。将用于这一研究的所有小鼠维持在C57BL/6遗传背景上。所有实验在单个通 风笼中进行。
[0245] 李斯特氏菌感染：将李斯特氏菌生长在心脏浸液琼脂中。如果未不同地指示，那么 将小鼠用2xl0 4CFU静脉内感染。
[0246] 在细胞因子刺激之后的粒细胞活化和FACS分析：如所描述进行FACS染色和分析 (Lang, P. A.,等人 Aggravation of viral hepatitis by platelet-derived serotonin. Nat Med 14, 756-761 (2008)，其特此出于所有目的并且特别是出于涉及FACS染色和分析 的所有教导的目的而以引用的方式整体并入）。重组小鼠TNF-a来自R+D系统，LPS来自 Sigma并且GM-CSF是从X630细胞上清液获得。在所指示的浓度下使用来自Sigma的fMLP。 对于活化研究，将10 U 1血液在含有不同细胞因子还有抗Grl (eBiosciences)、二氢罗丹明 (八161丨8)和〇)1113(613；[08(^611068，如果指不）的100111培养基中进行孵育。在孵育30分 钟或45分钟（如果未不同地指示在37°C )之后，将粒细胞固定并且使用红细胞溶解缓冲 液（BD Biociences)溶解红细胞。对于⑶11a、⑶lib和⑶18的天然表达来说，将血液用 2 %福尔马林固定10分钟，并且然后用抗Grl和相应抗体在4°C下染色。Toso抗体是根据 Nguyen 等人，（Blood，2011年 7 月 21 日，118(3) :598-608)产生的。
[0247] 对于引发研究来说，将粒细胞与不同细胞因子一起孵育30分钟，接着fMLP孵育15 分钟。
[0248] 组织学：如 Lang，K. S.,等人 Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. J Clin Invest 116,2456-2463(2006) 中所描述在急速冷冻或福尔马林固定的组织上进行组织学分析，所述文献特此出于所有目 的并且特别是出于涉及组织学分析的所有教导的目的而以引用的方式整体并入。
[0249] MP0 ELISA :MP0 ELISA源自Hycult biotech并且根据制造商的说明书进行。
[0250] 通过定量RT-PCR进行的mRNA基因序型分析：使用Trizol进行RNA提取和cDNA 合成。使用来自Applied Biosystems的Toso(Faim3)试剂盒Mm01302388_ml进行的基因 表达分析。对于分析，将所有靶基因的表达水平针对18sRNA进行标准化（ACt)。基因表达 值被表示为ACt。
[0251] 统计分析：数据被表示为平均值土S. E. M。使用学生t检验对两个不同组之间的统 计学上有意义的差异进行分析。如果未不同地提及，那么双向未配对。使用单向AN0VA与 另外Bonferroni或Dunnett测试来进行包括几组的分析。使用双向AN0VA(重复测量值） 来计算多个时间点内实验组之间的统计学上有意义的差异。P值< 〇. 05被认为是统计学上 有意义的。
[0252] T0S0在粒细胞上表达但对于白细胞分化来说不是必要的
[0253] 为了分析Toso在体内的功能相关性，本发明人如材料和方法中所描述产生了一 种Toso缺陷的小鼠。将Toso缺陷的小鼠与C57BL/6背景回交并且然后针对Toso RNA的 表达进行分析。来自Tos〇f小鼠的RT-PCR分析显示缺乏Toso,从而表明Toso确实不在 TOSO+小鼠中表达（图12a)。接着使用Toso特异性抗体在淋巴细胞上对Toso蛋白进行分 析。据发现与出版的文献一致，天然B细胞而不是T细胞表达Toso (图12b)。接着，本发明 人分析了 Toso在粒细胞上的表达。本发明人发现血液和脾两者中的粒细胞在细胞表面上 表达Toso (图12c)。为了分析Toso是否影响淋巴细胞或粒细胞发育，本发明人对T〇S〇+小 鼠的外周血中的这些细胞群体进行了分析。TOSO+小鼠未显示血液粒细胞中的任何显著差 异（图12d)。在Toso缺陷的小鼠中存在血液淋巴细胞数目的稍微显著减少，这被归因于减 少的B细胞数目（图12d和e)。T 〇S〇+小鼠的脾大小是正常的并且脾淋巴细胞显示正常 分布（图12f和g)，从而表明Toso对免疫细胞的发育不存在主要作用。
[0254] 3.活化阈值在T0S0缺陷小鼠的粒细胞中被降低
[0255] 将来自Toso+小鼠和野生型小鼠的粒细胞用粒细胞活化剂N-甲酰蛋氨酰-亮氨 酰-苯丙氨酸（fMLP)进行活化。fMLP活化粒细胞上的fMLP受体，其模拟病原体接触。在 预活化的粒细胞中，与fMLP相接触导致活性氧物种（R0S)的强烈产生和脱粒。相比之下， 未通过细胞因子预活化的粒细胞显示对fMLP的有限应答。当通过R0S的产生和脱粒进行 分析时，仅10 %的野生型粒细胞在用fMLP处理之后被活化（图13a)。相比之下，用fMLP 处理活化50%的TOSO+粒细胞（图13a)。
[0256] 接着，在用TNF- a处理之后对TOSO+粒细胞的R0S产生和脱粒进行分析，TNF- a 通常仅引发粒细胞，但不会导致R0S产生。用TNF-a处理导致WT粒细胞中实际上不存在 的R0S产生（图13b)。相比之下，TOSO+粒细胞在TNF-a处理之后显示显著R0S产生/脱 粒的粒细胞，从而表明Toso影响粒细胞活化的阈值（图13b)。用LPS和GM-CSF处理（其 也已知引发粒细胞）既未活化野生型粒细胞中的R0S也未活化TOSO+粒细胞中的R0S (图 13c和d)。这些结果显示Tosof粒细胞对于fMLP和TNF- a两者来说均具有降低的活化阈 值。用GM-CSF或LPS连同fMLP共处理使WT粒细胞中产生R0S的野生型粒细胞的百分比 增加10倍（图13e)。产生R0S的粒细胞的百分比在LPS或GM-CSF引发的fMLP共处理的 Tosof粒细胞中也增加（图13e)。这些数据显示Tosof粒细胞还在用GM-CSF或LPS引发 的粒细胞的情况下展示降低的活化阈值。这表明T 〇S〇+粒细胞一般具有降低的活化阈值。
[0257] 细胞应激可活化粒细胞，其可能显著导致（自身）炎性疾病。为了分析T〇S〇+粒 细胞是否更易于这种活化，将野生型（WT)粒细胞和TOSO+粒细胞在不同温度下进行孵育。 温度降低诱导30%的T 〇S〇+粒细胞中的脱粒，这是野生型粒细胞未显示任何应答的一种 条件（图13f)。活化阈值的差异可通过WT粒细胞与TOSO+粒细胞之间的寿命差异来解 释。粒细胞通常具有非常有限的寿命，其通过在体外培养之后24小时内的自发性细胞凋亡 加强。粒细胞活化通常与延长的寿命和减少的细胞凋亡相关。然而，在T 〇S〇+粒细胞与WT 粒细胞之间不存在自发性细胞凋亡的差异（图17)。用GM-CSF处理减少粒细胞中的细胞凋 亡，这是不依赖于Toso的一个过程（图17)。数据证明当遇到炎性信号或应激信号时，Toso 蛋白的表达保持粒细胞处于静止非活化状态。
[0258] 粒细胞中的活化阈值被内在地调控
[0259] 当与野生型粒细胞相比时，源自T〇S〇+小鼠的粒细胞针对分化成效应子表型具有 降低的阈值。除其内在调控之外，粒细胞活化受几种外在体液因素（像：细胞因子、抗体、补 体因素）以及周围细胞如B细胞、T细胞、内皮细胞或血小板的活化状态影响。为了得到关 于源自T 〇S〇+小鼠的粒细胞的降低的活化阈值的机制的更多认识，对混合的骨髓嵌合体进 行了分析。将C57BL/6小鼠进行辐射处理并且然后用WKTosof或混合的WT/Toso^(比例 1 : 1)骨髓进行重构。WT骨髓可以通过CD45. 1同种型的表达在嵌合小鼠中被单独地追踪 (图14a)。这种混合的骨髓嵌合体允许对源自同一小鼠的WT粒细胞和Tosc^粒细胞的活 化阈值的分析。活化阈值中的所观察到的差异（尤其是混合的嵌合小鼠中的那些）将表明 Toso内在地调控粒细胞的活化。在骨髓移植之后30天对骨髓嵌合体的分析显示T〇S〇+粒 细胞以与WT粒细胞相同的数目重构，从而再次表明Toso在粒细胞的发育中不存在主要作 用（图14b)。在混合的嵌合体中，总粒细胞（WT和T 〇S〇+)是与接受来自单一小鼠品系的 骨髓的小鼠可比的（图14b)。在混合的骨髓嵌合体的竞争模式方面不存在WT粒细胞对比 TOSO+粒细胞的显著优点（图14b)。
[0260] 接着，对嵌合小鼠中WT粒细胞对比TOSO+粒细胞的活化阈值进行分析。用fMLP 处理在接受骨髓移植的小鼠中活化更多粒细胞（图14a对比图13a)，这可能是由于接受骨 髓移植的小鼠中的不同细胞因子水平（但不限于这一潜在机制）。与源自T 〇S〇+小鼠的数 据可比，用TOSO+骨髓重构的C57BL/6小鼠显示降低的活化阈值（图14c)。这也在混合的 骨髓嵌合体中见到（图14c)。这表明Toso内在地影响粒细胞的活化阈值。
[0261] 为了确定Toso是否另外影响效应子功能的强度，测定了活化的WT粒细胞和活化 的TOSO+粒细胞的R0S产生量。活化的WT粒细胞显示比活化的TOSO+粒细胞显著更多的 R0S产生（图14d)。这些数据显示Toso增强了粒细胞的活化阈值。一旦粒细胞被活化，它 们就在存在Toso的情况下显示增强的效应子功能。
[0262] Toso缺陷的小鼠中李斯特氏菌的受损控制
[0263] 评定了粒细胞中Toso的缺乏对体内细菌控制的作用。用革兰氏阳性单核细胞增 生李斯特氏菌感染特别强烈地依赖于粒细胞的快速活化。用亚致死剂量的李斯特氏菌感染 导致TOSO+小鼠中增加的死亡（图15a)，从而表明Toso对于细菌的控制来说是必不可少 的。在李斯特氏菌接种之后两天，TOSO+小鼠中的血液粒细胞显示增强的脱粒和R0S产生 (图15b)。这与T 〇S〇+小鼠的血清中髓过氧化物酶的增强释放相关（图15c)。
[0264] 一个可能性是Toso+粒细胞在血液中被快速活化，但可能未能在受感染的器官 中发挥其充分发展的效应子功能。为了对这种假设进行分析，将受感染的野生型小鼠或 Tosof小鼠用2x 106CFU的李斯特氏菌感染并且在20小时之后对组织学进行分析。在WT 小鼠和TOSO+小鼠两者中均发现肉芽肿（图15d)，从而表明Toso未参与肉芽肿形成。针 对李斯特氏菌染色显示肉芽肿中增强的细菌（图15d)，从而表明肉芽肿中的效应子功能由 Toso实现。
[0265] 对器官中感染后一天粒细胞的分析显示减少的效应子功能（图15e)并且李斯特 氏菌生长在T 〇S〇+小鼠的肝和脾中显著增强（图15f)。这与李斯特氏菌散播至血液中相 关（图18)并且最终还散播至脑，这可能是感染李斯特氏菌的T 〇S〇+小鼠的死亡原因（图 15f)。这些数据显示T〇S〇+小鼠显示出对李斯特氏菌感染增强的敏感性。这与血液中增 强的粒细胞活化、肝和脾中减少的效应子功能以及李斯特氏菌散播至脑中相关。
[0266] Toso调控粒细胞上的表面CDllb和CD18表达
[0267] Toso缺陷的粒细胞展示在血液中增强的活化但在组织中减少的粒细胞效应子功 能。这种表型将适合整联蛋白的不同表达和/或不同信号传导。⑶11a、⑶lib和⑶18是 对于粒细胞活化来说重要的整联蛋白。因此在WT粒细胞和Tosc^粒细胞中比较⑶11a、 ⑶lib和⑶18的表达。存在⑶lib和⑶18在天然Toso缺陷的粒细胞上的显著增强的表达 (图16a)。⑶11a的表达在WT粒细胞与Tosc^粒细胞之间没有显著不同（图16a)。在用 GM-CSF或LPS活化之后，⑶lib表达在WT粒细胞和Tosc^粒细胞两者中上调，然而表达差 异随着增加LPS和GM-CSF浓度而减少（图16b)。LPS和GM-CSF在fMLP之后降低粒细胞 的活化阈值。因此，WT粒细胞与T〇S〇+粒细胞之间CDllb表达的差异可能可以解释不不同 活化阈值。为了观察CDllb表达是否确实参与活化阈值的调控，本发明人对CDllb在系统 中的作用进行了分析。如所预期，缺乏⑶lib导致减少的⑶18表达（图16c)。Cdllb+粒 细胞显示在用fMLP连同GM-CSF处理之后减少的活化和ROS产生（图16d)。这些数据显示 Toso-/粒细胞显示增强的⑶lib (影响粒细胞的活化阈值的一种整联蛋白）基础表达。这 些发现将T〇S〇+粒细胞中增强的⑶lib表达与在不存在Toso的情况下降低的活化阈值相 联系。
[0268] 实施例10 :T〇S〇在葡萄糖耐量和胰岛素敏感性中起作用
[0269] 这个实施例证明Toso在葡萄糖耐量和胰岛素敏感性中起作用。图19示出 Toso 7小鼠在开始商脂肪饮食之后具有正常食物摄取和体重。对于图19A中的实验，自开 始高脂肪饮食（开始于5周大）监测WT和T 〇S〇+雄性小鼠的体重。对于图19B，在高脂肪 饮食后14周测量食物摄取。食物摄取通过单独家养的动物测量，其中在2天周期的开始和 结束时测定食物重量的差异。
[0270] 如图20中所示，在进行高脂肪饮食持续10-13周之后，与野生型小鼠相比， TOSO+小鼠具有增强的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。用自5周大开始以高脂肪饮食喂养 10-13周的野生型小鼠和T 〇S〇+小鼠进行葡萄糖耐量测试（注意使用雌性小鼠组获得类似 结果）。用自5周大开始以高脂肪饮食喂养10-13周的野生型小鼠和TOSO+小鼠进行胰岛 素耐量测试。
[0271] 在9 :30a. m.与11 :30a. m.之间对禁食过夜的动物进行葡萄糖耐量测试，使用腹 膜内（1.?.)注射的以/1^体重的葡萄糖剂量和在注射之后0、15、30、60和120分钟时的葡 萄糖水平的测量值。
[0272] 使用在0. 5U/kg体重剂量下的人常规胰岛素（Humalog)在9 :30a. m.与11 :30a. m.之间对禁食过夜的动物或在1 :00p. m与3p. m.之间对禁食4. 5小时的动物进行胰岛素 耐量测试，并且在注射之后0、15、30、45和60分钟时测量血液葡萄糖水平。
[0273] 与喂以高脂肪饮食的小鼠相比，图21示出当两组小鼠均喂以常规食物持续10-13 周时，TOSO+具有与野生型小鼠类似的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。用喂以常规饮食的野 生型和T 〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）进行葡萄糖耐量测试。用喂以常规饮食的野生型 和T〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）进行胰岛素耐量测试。图21表明，不受理论限制，Toso 缺陷的保护作用要求高脂肪饮食。在9 :30a.m.与11 :30a.m.之间对禁食过夜的动物进行 葡萄糖耐量测试，使用腹膜内（i.P.)注射的lg/kg体重的葡萄糖剂量和在注射之后0、15、 30、60和120分钟时的葡萄糖水平的测量值。使用在0. 5U/kg体重剂量下的人常规胰岛素 (Humalog)在9 :30a. m?与11 :30a. m.之间对禁食过夜的动物或在1 :00p. m与3p. m?之间 对禁食4. 5小时的动物进行胰岛素耐量测试，并且在注射之后0、15、30、45和60分钟时测 量血液葡萄糖水平。
[0274] 实施例11 :用可溶性Toso治疗改善用高脂肪饮食喂养的野生型小鼠中的葡萄糖 耐量
[0275] 这个实施例证明用可溶性Toso蛋白（SEQ ID N0 :5)治疗改善用高脂肪饮食喂养 14周的野生型小鼠中的葡萄糖耐量。图22A示出来自在可溶性Toso治疗之前的野生型雄 性小鼠的数据。用自5周大开始以高脂肪饮食（60%脂肪卡路里）喂养14周的禁食野生 型小鼠进行葡萄糖耐量测试。图22B示出来自在可溶性Toso治疗之后的野生型小鼠的数 据。将小鼠（高脂肪饮食持续14周）在第0、2、5、7、9和12天用可溶性Toso-hlgG在腹 膜内50 yg的剂量下进行治疗。在禁食过夜之后第14天进行葡萄糖耐量测试。在可溶性 Toso蛋白治疗过程中，将小鼠连续喂以高脂肪饮食。在9 :30a.m.与11 :30a.m.之间对禁 食过夜的动物进行葡萄糖耐量测试，使用腹膜内（i.P.)注射的lg/kg体重的葡萄糖剂量和 在注射之后0、15、30、60和120分钟时的葡萄糖水平的测量值。
[0276] 实施例12 :分泌人和小鼠Toso-Fc的稳定细胞系的产生
[0277] 使用脂质体（Lipofectamine) 2000 将编码 cDNA 的 Toso-Fc 转染至粘附 HEK293T 细胞中。在补充有10%胎牛血清和〇. 2mg/ml博莱霉素（Zeocin)的DMEM培养基中选择单 个克隆。将高表达克隆扩大至15cm培养皿，并且在汇合时1 : 2分裂。在每次分裂，将稳 定的转染株在具有连续更多无血清自由式培养基和连续更少DMEM/FBS培养基中培养以便 针对无血清生长调理细胞。（例如在分割1时-90% DMEM/FBS 10%自由式一在分割10时 100%自由式）。将调理成在无血清培养基中生长的稳定转染株在无生存力损失的情况下生 长在定轨振荡器孵育箱（37°C，8% C02，125rpm)中的悬浮液中。
[0278] 本说明书在目前描述的技术的实施例方面中提供方法、系统和/或结构以及其用 途的完整描述。虽然所述技术的多种方面已经如上在一定程度的具体性上或参考一个或多 个单独方面作了描述，但是本领域技术人员在不脱离此技术的精神或范围的情况下能够对 所公开的方面做出大量的改变。因为可以在不脱离目前描述的技术的精神和范围的情况下 产生许多方面，所以适当的范围存在于下文所附的权利要求书中。因此涵盖其它方面。此 夕卜，应理解的是，除非另外明确地主张或主张语言本身需要特定的顺序，否则任何操作可以 以任何顺序进行。希望包含于以上描述和在附图中示出的所有事物只解释为特定方面的说 明性的并且不限于所示的实施方案。除非另外从上下文清晰可见或明确说明，否则本文中 提供的任何浓度值通常就混合物值或百分数给出，而不考虑添加混合物的特定组分时或之 后发生的任何转化。如果尚未明确地并入本文中，那么在本公开中提及的所有公开的参考 文献和专利文件均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。如在以下权利要求书中所定 义，可以在不脱离本技术的基本要素的情况下进行细节或结构上的改变。
【权利要求】
1. 一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，所述方法包括用包含治疗有效量的可 溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受试者。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸 残基 18-253。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID NO :5或6的 氨基酸序列。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含与SEQ ID NO :5或6具 有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
5. 如权利要求1至4所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚体。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述多聚体包含6个单体，其中每个单体包含根据 SEQ ID NO :6 的序列。
7. 如权利要求1至6所述的方法，其中所述自身免疫性病症是选自类风湿性关节炎、多 发性硬化症、狼疮和I型糖尿病的成员。
8. -种治疗受试者中的II型糖尿病或哮喘的方法，所述方法包括用包含治疗有效量 的可溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受试者。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸 残基 18-253。
10. 如权利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
11. 如权利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含与SEQ ID NO :5或6具 有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
12. 如权利要求8-11所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚体。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述多聚体包含6个单体，其中每个单体包含根据 SEQ ID NO :6 的序列。
14. 一种治疗受试者中的1型糖尿病、2型糖尿病、哮喘、多发性硬化症或类风湿性关节 炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用具有SEQ ID NO :5或6的氨基酸序列或其片段 或缺失变体的可溶性多肽。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述受试者中的Toso活性被降低。
16. 如权利要求14-15所述的方法，其中所述可溶性多肽包含SEQ ID NO :5或6的缺 失变体。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述缺失变体包含选自：SEQ ID NO. 9-24的成员。
18. -种治疗受试者中的癌症、过敏症、C0PD、高-IgM综合征或中性白细胞增多症相关 的病症的方法，所述方法包括用包含治疗有效量的可溶性Toso蛋白的组合物治疗所述受 试者。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基 酸残基18-253。
20. 如权利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根据SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含与SEQ ID NO :5或6具 有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
22. 如权利要求18-21所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚体。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述多聚体包含6个单体，其中每个单体包含根据 SEQ ID NO :6 的序列。
24. 如权利要求18-23所述的方法，其中所述自身免疫性病症是选自类风湿性关节炎、 多发性硬化症、狼疮和I型糖尿病的成员。
25. -种抑制受试者中的Toso活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效 量的可溶性Toso多肽。 26?-种抑制Toso活性的方法，所述方法包括将可溶性Toso多肽应用至包含膜结合 Toso受体的细胞。
27. -种组合物，其包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的多肽。
28. 如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物抑制Toso活性。
29. 如权利要求27-28所述的组合物，其中所述多肽是多聚体。
30. 如权利要求29所述的组合物，其中所述多聚体包含6个单体，其中每个单体包含根 据SEQ ID NO :6的序列。
31. -种分离的核酸，其编码如权利要求27-30所述的多肽。
32. -种宿主细胞，其包含编码如权利要求27-30所述的多肽的核酸。
33. -种包含可溶性多肽的组合物，其中所述可溶性多肽与SEQ ID NO :5或SEQ ID NO: 6具有至少90 %序列同一性。
34. 如权利要求33所述的组合物，其中所述可溶性多肽抑制Toso活性。
35. 如权利要求33-34所述的组合物，其中所述可溶性多肽是多聚体。
36. 如权利要求35所述的组合物，其中所述多聚体包含6个单体，其中每个单体包含根 据SEQ ID NO :6的序列。
37. -种分离的核酸，其编码如权利要求33-36所述的多肽。
38. -种宿主细胞，其包含编码如权利要求33-36所述的多肽的核酸。
39. -种融合蛋白，其包含人Toso蛋白的胞外结构域、Fc区和多聚化标签。
40. 如权利要求39所述的融合蛋白，其中所述胞外结构域包含人Toso蛋白的氨基酸 18-253。
41. 如权利要求39-40所述的融合蛋白，其中所述多聚化标签包含SEQ ID NO :4。
42. 如权利要求39-41所述的融合蛋白，其中所述Fc区包含SEQ ID NO :3。
43. -种分离的核酸，其编码如权利要求39-42所述的融合蛋白。
44. 一种宿主细胞，其包含编码如权利要求39-42所述的多肽的核酸。
45. -种分离的可溶性多肽，其包含与具有选自由SEQ ID NO. 1-24组成的组的氨基酸 序列的多肽具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
46. -种产生如权利要求45所述的多肽的方法，所述方法包括提供包含编码所述多肽 的核酸的细胞，其中将所述细胞在适于表达所述多肽的条件下进行培养。
47. -种核酸，其编码如权利要求45所述的多肽。
48. -种产生根据SEQ ID NO :5或6的多肽的方法，所述方法包括提供包含编码所述 多肽的核酸的细胞，其中将所述细胞在适于表达所述多肽的条件下进行培养。
49. 一种核酸，其编码根据SEQ ID NO :5或6的多肽。
50. -种宿主细胞，其包含编码根据SEQ ID NO :5或6的多肽的核酸。
【文档编号】A61P19/02GK104394880SQ201380023772
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年3月16日
【发明者】M.W.图舍, T.W.马克, P.S.奧哈施, P.朗, K.朗, D.布伦纳, G.林 申请人:大学保健网络