用于稳定干燥的生物材料的方法和组合物的制作方法

用于稳定干燥的生物材料的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于生产生物药物试剂的干燥制剂的方法，所述方法旨在使所述试剂在干燥时的活性损失最小并提供贮存期延长的干燥制剂。该方法包括干燥水性溶液的步骤，除了该生物药物试剂，该水性溶液至少还包括氨基酸、多元醇和金属盐。优选地，所述氨基酸是谷氨酸，所述多元醇是山梨糖醇并且任选的还有甘露醇，并且所述金属盐是镁盐。该溶液是通过真空干燥法或低压冻干法干燥。所述方法可特别用于制备病毒(如脊髓灰质炎病毒或呼吸道合胞病毒)的干燥制剂，以用于疫苗接种。本发明还涉及根据本发明的方法制备的干燥制剂以及它们作为药物(如作为疫苗)的用途。
【专利说明】用于稳定干燥的生物材料的方法和组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于稳定和保存干燥的生物材料的方法和组合物。这些生物材料包括 生物药物（如疫苗，特别是病毒疫苗）的低压冻干制剂或者真空干燥制剂。因此，本发明涉 及生物药物的生产和制剂领域，还涉及疫苗学领域。

【背景技术】
[0002] 考虑到生物化合物通常是脆弱的和易损坏的，这些化合物的长期贮存造成了独特 的挑战。几乎没有生物化合物可在液体环境中、溶液中或悬浮液中足够稳定以使得它们能 够被分离、纯化并且在非冷冻条件下（尤其是在室温或更高的温度下）以溶液形式储存较 长时间。
[0003] -种改善生物药物的稳定性的方法是转化它们为干燥状态[17]。在商业上和实际 应用中，以干燥形式贮存生物化合物都带来巨大的益处。不仅它们的贮存期会延长，成功干 燥的试剂、材料和组织还具有减少的重量，且需要的贮存空间减少。这不仅对成品有用，如 在3个月到2年内使用的最后批的疫苗，而且也可用于贮备（1-50年或更长时间的贮存）毒 种批、原液（bulk)或最后批。与低温贮存方案及其相应成本相比，干燥材料的室温贮存是 有更高性价比的。另外，许多递送途径--包括粉剂的肺部递送、通过包衣微针或溶解微针 进行的真皮递送、通过粉剂或可溶解的针进行的肠胃外递送--依赖于复杂的制剂方式。 现有几种生产干燥的生物化合物的技术，包括喷雾干燥法、真空干燥法、风干法、涂覆法、泡 沫干燥法。其中一种最古老和常用的技术是冷冻干燥法，也称作低压冻干法。在很长一段时 间里，冷冻干燥法更多地被看作是一门技术而非一门科学，这成为科学方法和研究的障碍。
[0004] 最经常用于制备固体生物药物的方法是低压冻干法。这种方法由冷冻步骤和之 后的两次干燥步骤组成，在第一次干燥中冻结的水被升华作用除去，第二次干燥中非冻结 的一结合Il水被除去。冷冻应力或者干燥应力能改变生物药物的热力学稳定性并且能引 起或促进蛋白质解折叠。解折叠能导致生物药物的不可逆变性，但也能减少处于干燥状态 的I&存稳定性[19]。对于稳定的冻干品（Iyophilisate)，使用赋形剂作为稳定剂和/或填 充剂。已证实，不同的化合物，如糖、聚合物、氨基酸和表面活性剂，能够在低压冻干期间和 随后的贮存期间改善生物药物的稳定性[18, 20]。在文献中，记载了认为赋形剂在冷冻、干 燥和随后的贮存期间如何保护生物药物（如蛋白质和疫苗）的几种机制。在稳定的低压冻 干疫苗的合理配制和过程设计的开发中，理解不同稳定剂的低温保护（cryo-)和冻干保护 (Iyoprotection)机制是很重要的[21]。
[0005] 在冷冻期间，生物药物的物理环境剧烈改变，导致形成影响蛋白质性质的生物药 物的完整性的应力。在冷冻期间生物药物接触到的最关键的应力是低温、冷冻浓度和冰的 形成[18, 19, 21，22]。冷变性是生物药物由于温度下降而失去它们的紧密折叠结构的现象。 对于冷变性，当前接受的解释是基于在更低的温度下水与非极性基团之间的接触自由能的 改变，这会弱化疏水作用从而破坏生物药物的结构[19, 20, 23]。由于冰的形成，所有溶质的 浓度在冷冻期间显著增高。与浓度相关的所有变化，例如离子强度、溶质结晶化和相分离， 都有可能使生物药物不稳定[21]。
[0006] 通过冷冻应力，所述制剂的最初相对组成和pH能避免生物药物变质的发生。例 如，已在一些生物药物中发现，在冷冻前增加所述制剂中该生物药物相对于其它赋形剂的 浓度，将会提高冻融过程中该生物药物的稳定性[24]。类似地，溶液中所述生物药物的最佳 初始PH，将会在冻融后获得完整生物药物的最高复原[20]。
[0007] 即使在优化所有这些因素之后，一些生物药物仍然在冻融期间变性，因此需要添 加剂来使蛋白质/生物药物的变性最小化。来自完全不同化学类别的不同赋形剂能提供低 温保护。根据一溶质排斥假说II，已证明低温保护剂优先地不与水性溶液中的生物药物的 表面接触[24]。已测定了各种赋形剂在各种生物药物的存在下的溶质排斥的热力学现象， 所述赋形剂如盐、氨基酸、甲胺、聚乙二醇、多元醇、表面活性剂和糖[19, 21，24, 25]。
[0008] -玻璃化假说Il是广泛知晓的动力学机制。根据该机制，冷冻浓度和温度下降两 者都提高粘度，减少流动性和减缓所有动力学进程。当该系统到达玻璃态时，玻璃中的所有 分子都变得在物理上（如变性、聚集作用）和在化学上（如氧化作用、水解作用、脱酰胺作 用）静止，且生物药物降解的速率常数减小[19, 26]。
[0009] 在冷冻过程中形成的冰-水界面可能引起表面变性。添加表面活性剂可以减小生 物药物溶液的表面张力从而减少生物药物的吸附和聚集[25, 27]。
[0010] 通过提高所述制剂的玻璃化转换温度（glass transition temperature)和通过 抑制小的稳定添加剂（如二糖）的结晶化，聚合物可以稳定生物药物[18, 22]。通过降低缓 冲盐结晶的速度和范围并因而抑制pH变化，氨基酸也可以使生物药物免受冷冻变性[18]。 [0011] 在水性溶液中，生物药物是完全水合的，这意味着该生物药物具有覆盖生物药物 表面并与生物药物表面相互作用（通过氢键）的水单层[28]。干燥会除去部分水合外层 (hydration shell)，这可能破坏所述生物药物的自然状态而导致变性。为了在干燥过程中 防止变性，需要保护剂。这类保护剂的重要稳定机制被称作一水替代假说Il [18-20, 29]。 糖（如蔗糖和海藻糖）、多元醇[20, 30]和氨基酸[31]能与干燥的生物药物形成氢键。如 此，当水合外层被除去时，它们能充当水替代物。无定形玻璃的形成，如上解释为一玻璃化 假说Il，也是一种重要的保护机制。
[0012] 除了水的替代物和玻璃态的形成，一些赋形剂（尤其是聚合物）能通过提高玻 璃化转化温度（T g)来使生物药物稳定，玻璃化转化温度（Tg)被定义为橡胶态（液体样） 和玻璃态（固体样）之间的转化温度。一般来说，T g越高，玻璃中的分子流动性越低（如 生物药物、稳定化合物、氧和水的运动），且干燥过程和随后贮存期间生物药物制剂越稳定 [18, 22]。涉及到在干燥期间生物药物的稳定并且适用于多糖和其它聚合物的其它机制，是 在小的赋形剂的溶质浓缩期间抑制结晶，这种小赋形剂在干燥过程中稳定所述生物药物。
[0013] 由于一些赋形剂对松散环境（bulk environment)而不是生物药物试剂量表面的 偏爱（之前称为一溶质排斥II)，它们能担当填充剂，这表示它们为最终的块状物（final cake)提供机械支持，使产品更精巧（elegance)，且在干燥期间防止产品破裂。甘露醇和 甘氨酸经常被使用作填充剂，因为它们的无毒性、高溶解度、和高的低共熔温度（eutectic temperature) [18, 25, 32]。大多数氨基酸是潜在的填充剂并且它们很容易结晶[33]。
[0014] 如果所述生物药物在干燥过程中是稳定的，那么以干燥状态长期贮存通常是可行 的。尽管通常来说，干燥过程本身对所述生物药物是最有害的，但是，如果配制不当，干燥的 生物药物仍可在贮存过程中失去它们的结构或效能。在贮存期间，对于生物药物剂而言，聚 集是主要的物理不稳定性因素。不同的化学降解作用（如脱酰胺作用、氧化作用和水解作 用）也可能在贮存过程中发生，但取决于转变的残基的位置，这些改变未必会影响所述生 物药物的活性。还原糖（如葡萄糖和蔗糖）能与生物药物中的赖氨酸和精氨酸残基反应， 以通过麦拉德反应形成碳水化合物加合物，麦拉德反应是一种棕黄反应，能导致贮存过程 中低压冻干的生物药物的活性明显丧失。
[0015] 贮存温度是影响固态生物药物试剂稳定性的最重要因素之一。影响长期贮存稳定 性的其它因素是所述制剂的玻璃化转变温度（Tg)、制剂pH和干燥后的剩余水含量。在贮存 过程中，干燥制剂的水分含量可能由于几个原因而明显改变，包括阻塞物的水分释放、非结 晶赋形剂的结晶或来自赋形剂水合物的水分释放。如果在制剂中所用赋形剂的量不合适， 那么用于在干燥过程中稳定生物药物试剂的赋形剂可能使固态的生物药物试剂不稳定。并 且，在贮存期间存在非晶形赋形剂结晶的风险，因为结晶状态在热力学上比玻璃态更加稳 定[39]。一些糖和多元醇具有结晶的倾向，但这受它们在制剂中的相对含量、贮存温度和 相对湿度的强烈影响[18, 40]。另外，几种赋形剂的相对组成和非结晶稳定剂（如聚合物） 的存在，可抑制赋形剂的结晶。
[0016] 在长期贮存期间，干燥状态的生物药物试剂的稳定机制与用低压冻干保护的那 些稳定机制相似，包括无定形玻璃态的形成、水取代以及赋形剂与生物药物试剂之间的 氢键结合[41]。为了实现最大化稳定固态形式的生物药物试剂，要求联合使用这些机制 [18, 42]。低压冻干产品的最终品质由赋形剂（包括缓冲剂、填充剂和稳定剂）的选择和低 压冻干过程决定。
[0017] 脊髓灰质炎是一种主要影响幼儿的高度传染性疾病。对于由脊髓灰质炎病毒的三 种血清型（1型、2型或3型）中任何一种引起的这种疾病，没有特别的治疗方法，但该疾病 可通过疫苗接种预防。目前，口服脊髓灰质炎疫苗（Sabin 0PV)是选择用于争取全球根除 脊髓灰质炎的疫苗。然而，主要的顾虑是OPV具有复原为能导致瘫痪的形式的能力，所谓的 疫苗相关的麻痹型脊髓灰质炎（VAPP)。长期使用减毒脊髓灰质炎活病毒的另一风险是转变 为疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒（VDPV) [1]。在西方国家，灭活的Salk polio疫苗（IPV)是 当前消除VAPP风险和传播VDPV风险的优选方法。IPV被认为是最适合用于继续进行全球 根除计划[1-3]。
[0018] 为了实现全球根除脊髓灰质炎，（改良的）IPV必须是有效的、低廉的、可安全生产 的和易于给药的[4]。当前IPV在发展中国家的可行性受到限制，因为IPV比OPV更贵，而 且只能通过注射给药[1，3, 5]。为了限制IPV的费用，WHO和RIVM正在开发用于技术转移 到发展中国家的非商用IPV。因为在生产过程中野生型Salk脊髓灰质炎病毒的抑制可能会 有问题，特别是在发展中国家，所述新疫苗会基于OPV菌株，Sabin (sIPV)，也可预见其生产 成本会不那么昂贵。为了进一步降低成本，RIVM正在开发SlPV制剂，所述SlPV制剂通过 使用佐剂和/或其它免疫途径而表现出剂量节省[6]。
[0019] 因为替代的递送方法和改良的疫苗制剂具有使疫苗递送更容易和更安全的可能 性[7, 8]，目前正在研究几种替代的疫苗递送方法。
[0020] 看来，各种灭活的脊髓灰质炎血清型的热稳定性存在差异，其中1型是最脆弱的。 在没有任何防腐剂存在的情况下，1型在4°c下贮存两年后会慢慢变质，而2型和3型可保 持多年有效。D-抗原含量在24°C下20天后会明显减少，而且在暴露于32°C下相同时间后 不可被检测到。相反，在这些温度中的任一温度下没有观察到2型D-抗原性的明显变化。 3型在24°C下20天后仍保持稳定，但D-抗原含量在32 °C下会明显降低[9]。
[0021] 基于对DT-脊髓灰质炎疫苗的观察，当将IPV的所有三种血清型纳入到联合疫苗 中并于4°C下贮存1年到4年以上的时间时，IPV的所有三种血清型都显示出令人满意的 效能维持，所述DT-脊髓灰质炎疫苗是使用2-苯氧基-乙醇保存且被吸附到氢氧化铝上 [9, 10]。更长的保存时间导致抗原性减弱，尤其是对于1型[9]。作为独立的疫苗，IPV可 在4°C下稳定4年，25°C下稳定1个月[10]。在37°C下，1-2天后1型的效能显著降低、在 两周后2型和3型的效能明显降低[11，12]。而且，冷冻对IPV效能有负面影响，这与D-抗 原结构的丧失有关[12]。
[0022] 在脊髓灰质炎根除后，要求储备脊髓灰质炎疫苗，以便为新脊髓灰质炎爆发的潜 在风险而预先做好准备，所述爆发是由循环VDPV (即使在OPV停止后）[13-15]或者生物恐 怖主义袭击引起。为了实现最佳的疫苗储备，需要考虑各种问题。贮存期是一个重要的细 节，因为延迟到期时间会减少储备费用[16]。为了保证疫苗的效能能够持续多年，需要延长 疫苗（如IPV)的贮存期。因此，需要能够延长生物药物的贮存期的改良制剂和生产这类制 剂（优选以干燥形式）的改良方法。


【发明内容】

[0023] 第一方面，本发明涉及生产生物药物试剂的干燥制剂的方法，其中所述方法包括 干燥包括生物药物试剂、氨基酸、多元醇、金属盐和水的溶液。
[0024] 优选地，在本发明的方法中，该溶液基本上由以下构成：lpg_10g/ml的所述生物 药物试剂、0.01-20% (w/v)的所述氨基酸、0.5-20% (w/v)的所述多元醇、0.005-10% (w/ v)的所述金属盐和水。更优选地，所述氨基酸是谷氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、甘氨酸 或它们的混合物；所述多元醇是山梨糖醇、甘露醇、甘露糖、麦芽糖醇或它们的混合物；所 述金属盐是Mg++盐、Ca++盐或Li +盐或者它们的混合物，其中优选Cl-盐或者S0,盐或者它 们的混合物。
[0025] 在本发明的方法中，优选地谷氨酸是以谷氨酸单钠盐的形式溶解在溶液中。
[0026] 在本发明方法的优选实施方案中，所述溶液基本上以下构成：lpg_10g/ml的所述 生物药物试剂、5-20% (w/v)的山梨糖醇、5-20% (w/v)的谷氨酸单钠盐、2-10% (w/v)的 镁盐（优选MgCl2和/或MgSO4)，以及任选的5-20% (w/v)的甘露醇。
[0027] 在本发明的方法中，该溶液优选地包括可药用缓冲剂并且被缓冲在中性pH下。还 优选地，通过真空干燥法或通过低压冻干法干燥该溶液。
[0028] 在本发明的方法中，所述生物药物试剂优选地是一种包括蛋白质材料 (proteinaceous material)的药物。更优选地，所述生物药物试剂是病毒，优选肠道病毒属 (Enterovirus)或肺病毒属（Pneumovirus)。最优选地，所述生物药物试剂包括血清型1、2 和3型的脊髓灰质炎病毒，优选灭活的血清型1、2和3型的脊髓灰质炎病毒，或者其中所述 生物药物试剂是人RSV或牛RSV。
[0029] 本发明方法的优选实施方案中，所述干燥制剂在干燥后复原时，保留干燥前存在 于所述溶液中的生物药物试剂的活性的至少50%。在本发明方法的另一实施方案中，其中 待干燥的溶液包括一种以上的不同生物药物试剂，并且其中所述不同试剂的活性损失的差 异优选地少于50%，籍此活性损失最多的试剂的保留活性表示为活性损失最少的试剂的保 留活性的百分数，后者设为100%。
[0030] 在本发明方法的优选实施方案中，在45°C下贮存至少一周后复原时，所述干燥制 剂保留干燥前存在于溶液中的生物药物试剂的活性的至少50%。在本发明方法的另一实施 方案，其中所述干燥制剂包括一种以上的不同生物药物试剂，并且其中所述不同试剂的活 性损失的差异优选地少于50%，籍此活性损失最多的药物的保留活性表示为活性损失最少 的药物的保留活性的百分数，后者设为100%。
[0031] 在第二方面，本发明涉及可通过根据本发明的任何方法得到的生物药物试剂的干 燥制剂。
[0032] 在第三方面，本发明涉及根据本发明的制剂用作药物，优选地用于（在个体中）诱 导针对传染病或肿瘤的免疫反应。

【具体实施方式】
[0033] 在第一方面，本发明涉及生产生物药物试剂的干燥制剂的方法。本发明的方法旨 在实现至少两种改进：1)使干燥所述制剂（并且优选随后复原所述干燥制剂）时所述生物 药物试剂的活性损失最少；和2)增加稳定性，即所述生物药物试剂的干燥制剂的贮存期， 即使在贮存所述干燥制剂时所述生物药物试剂的活性损失最少。该方法优选地包括干燥水 性溶液的步骤，该水性溶液包括生物药物试剂，以及氨基酸、多元醇和金属盐中的一种或多 种。
[0034] 在本发明的方法中，待干燥的溶液包括以下、基本由以下组成或者由以下组成：a) 如下文所列举的生物药物试剂且具有如下文所列举的浓度；b)如下文所列举的氨基酸且 具有如下文所列举的浓度；c)如下文所列举的多元醇且具有如下文所列举的浓度；d)如下 文所列举的金属盐且具有如下文所列举的浓度；e)水；任选的，f)如下文所列举的缓冲剂、 具有如下文所列举的浓度和处于如下文所列举的PH下；和，任选的，g)如下文所列举的其 它成分且具有如下文所列举的浓度。
[0035] 生物药物试剂
[0036] 在此应理解一生物药物试剂Il指的是生物试剂，当其应用于哺乳动物时具有生 理学活性，特别是当应用于人类患者时，优选是以可药用的形式。该生物试剂优选地是由细 胞生产或可从细胞得到的试剂，但是可从细胞获得的试剂的合成复制物（copy)和可从细 胞获得的化学修饰的试剂都被包括在该术语生物试剂中。该生物试剂可以是一种基于蛋白 质的试剂，即含有蛋白质材料（如蛋白质、多肽和肽）的试剂。所述生物试剂还可包括核酸 或由核酸组成，如DNA、RNA或核酸类似物。
[0037] 优选的生物药物试剂是病毒或病毒体，优选感染哺乳动物的病毒，优选感染人的 病毒。所述病毒可以是有包膜病毒但优选无包膜病毒。在此可以理解，在此使用的术语一 病毒Il包括以其天然存在形式的野生型病毒（如天然的分离株），以及一人造的Il减毒、 突变和缺陷病毒。术语一病毒Il还包括重组病毒，即使用重组DNA技术构建的病毒，如缺 陷病毒（例如缺乏一个或多个病毒基因（的一部分）），和基因治疗载体，其中部分的病毒 基因组被一个或多个目的基因取代。优选的病毒是微小RNA病毒（Picornavirus)，更优选 肠道病毒属，例如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（Coxsackievirus)、埃可病毒（echovirus) 和鼻病毒（rhinovirus)。最优选的病毒是脊髓灰质炎病毒。脊髓灰质炎病毒可以为减毒 的脊髓灰质炎病毒，但优选灭活的脊髓灰质炎病毒（IPV)。脊髓灰质炎病毒还可以为灭活 的减毒脊髓灰质炎病毒。所述生物药物试剂能包括血清型1、2和3型的脊髓灰质炎病毒中 的一种或多种，但优选地所述试剂包括所有三种血清型1、2和3型的脊髓灰质炎病毒。血 清型1型脊髓灰质炎病毒的合适病毒株包括但不限于Sabin 1、Mahoney、Brunhilde、CHAT 和Cox病毒株中的一种或多种。血清型2型脊髓灰质炎病毒的合适病毒株包括但不限于 Sabin 2、MEF-1和Lansing病毒株中的一种或多种。血清型3型脊髓灰质炎病毒的合适病 毒株包括但不限于Sabin 3、Saukett H和G、和Leon病毒株中的一种或多种。在一个优选 实施方案中，所述生物药物试剂是三价的灭活脊髓灰质炎疫苗，例如包括灭活的脊髓灰质 炎病毒Mahoney病毒株（对于1型）、灭活脊髓灰质炎病毒MEF-I病毒株（对于2型）和 灭活脊髓灰质炎病毒Saukett病毒株（对于3型）的Salk-IPV，或包括灭活脊髓灰质炎病 毒Sabin-1、Sabin-2和Sabin-3病毒株的sIPV。灭活脊髓灰质炎病毒株以在疫苗中安全 使用的方法是本领域中公知的，且包括如使用福尔马林或β_丙内酯进行的灭活（参见，例 如 Jonges et al.，2010, J. Clin. Microbiol. 48:928 - 940)。
[0038] 在另一实施方案中，生物药物试剂是肺病毒的病毒或者病毒体。所述肺病毒优选 地为呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV)，更优选人RSV或牛RSV。人 RSV既可以是亚群A或亚群B病毒，优选临床分离株，更优选尚未在体外被大量传代的分离 株（优选传代少于1〇、8、6或5次）。优选地，所述（人或牛）RSV病毒是包括这样的病毒基 因组的病毒，即所述病毒基因组具有缺失的或失活的G附着蛋白基因，如在它的病毒基因 组中有突变，籍此所述病毒基因组不编码功能性G附着蛋白，如记载在WO 2005/061698和 Widjojoatmodjo et al. (2010，Virol.J.，7:114)中的 RSVAG 和 RSVAG+G 病毒体。
[0039] 生物药物试剂优选地存在于待干燥溶液中，其量为每毫升I X 10°到I X IO25之间 的活的并且/或者死的或灭活的颗粒。可以通过如空斑形成单位、细胞培养或组织培养 50%感染剂量（CCID 5tl或TCID5tl)以及用于确定试剂滴度的其他合适病毒学测定法来确定 活的颗粒的数量。死的或者灭活颗粒数目是可以使用定量抗原量的测定法（如蛋白质测 定法）或确定血细胞凝集单位或脊髓灰质炎D-抗原单位的测定法来确定。优选地，生物 药物试剂以以下量存在于所述溶液中：每毫升至少IX IO1UX IO2UX IO3UX IO3UX 1〇4、 IX 105、IX 106、IX IO7UX IO8UX IO9或IX 101°个活的和/或死的或灭活的颗粒，并且 / 或者最高达每毫升 IX IO24UX IO23UX IO22UX IO21UX 102°、ix IO19UX IO18UX 1〇17、 I X 1016、I X IO15或I X IO14个活的和/或死的或灭活的颗粒。
[0040] 待干燥溶液中生物药物试剂的量也可以表达为每ml溶液中生物药物试剂的重 量。优选地，存在于溶液中的生物药物试剂（以重量/ml表示）为lpg/ml到10g/ml之 间。更优选地，生物药物试剂存在于所述溶液中的量为至少l〇_ n、1〇_1(|、1〇_9、1〇_8、1〇_7、1〇_ 6、 l(T5、l(T4g/ml和/或最高达ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ1或10°g/ml。可通过本领域中已知的方法确定溶液 中所述生物药物试剂的重量，包括如蛋白质测定法。因此，所述生物药物试剂的前述重量可 以也表示为一克蛋白质/ml Il以在合适的蛋白质测定法中确定（如the Bradford assay ; Zor and Selinger, 1996, Anal. Biochem. 236:302-308)〇
[0041] 在其中所述生物药物试剂是脊髓灰质炎病毒的优选实施方案中，所述溶液中脊 髓灰质炎病毒的量优选地是至少0. 〇l、〇. 1、1. 0、或lODU/ml并且最高达10. 000、1. 000或 100DU/ml，其中lDU是用如Westdijketal.[6]所描述的QC-ELISA来定义和测定的。在 其中所述生物药物试剂包括多价脊髓灰质炎病毒（疫苗）的实施方案中，应理解每个脊髓 灰质炎病毒血清型的存在的量是至少〇. 〇l、〇. 1、1. 〇或l〇DU/ml并且最高达10. 000、1. 000 或 100DU/ml。
[0042] 在其中所述生物药物试剂是RSV的优选实施方案中，所述溶液中RSV的量优选 地为至少 IX 101、IX 1〇2、IX 1〇3、IX 1〇3、IX l〇4TCID5(l/ml 并且最高达 IX 1025、IX 102°、 I X 1015、I X 1012、I X 101。或 I X 109TCID5(l/ml，其中 RSV 的 TCID5tl 是按照 Widjo joatmodjo et al. (2010, Virol. J·，7:114)所述的来定义和确定。
[0043] 氨基酸
[0044] 待干燥溶液中的氨基酸可以是任何可药用的D-或L-氨基酸。这样的氨基酸包括 20种标准的一蛋白源Il氨基酸或一天然Il氨基酸（组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮 氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰 胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和丝氨酸），以及非天然氨基酸，如鸟氨酸、瓜氨 酸、硒代半胱氨酸、牛磺酸和吡咯赖氨酸。优选地，待干燥溶液中的氨基酸是谷氨酸、谷氨酰 胺、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸中的一种或多种，更优选谷氨酸、精 氨酸和组氨酸中的一种或多种。因此，待干燥溶液可以包括氨基酸的混合物。待干燥溶液 中的一种或多种氨基酸可以是光学的D-或L-异构体或其混合物，但是优选地，所述氨基酸 是L-异构体。
[0045] 在优选的实施方案中，待干燥溶液中的氨基酸是L-谷氨酸、L-精氨酸和L-组氨 酸中的一种或多种。L-谷氨酸也可以是谷氨酸钠、蛋白胨、非动物蛋白胨、植物蛋白胨的形 式。L-精氨酸也可以是聚-L-精氨酸、蛋白胨、非动物蛋白胨、植物蛋白胨的形式。L-组氨 酸也可以是组氨酸钠形式。L-赖氨酸也可以是聚-L-赖氨酸形式。
[0046] 在特别优选的实施方案中，待干燥溶液中的氨基酸包括谷氨酸。谷氨酸可以是谷 氨酸钠、谷氨酸钾、谷氨酸铵、谷氨酸钙、谷氨酸镁和谷氨酸中的一种或多种。更优选地，所 述谷氨酸以谷氨酸单钠盐（MSG)形式溶于溶液中。
[0047] 所述一种或多种氨基酸优选地存在于待干燥溶液中，其浓度在范围0.01-20% (w/v)之间，即重量百分比/溶液体积。因此，优选地，所述一种或多种氨基酸存在于待干 燥溶液中，其浓度为至少或超过 〇· 〇1、〇· 02、0· 05、0· 1、0· 2、0· 5、1· 0、2· 0、5· 0、8· 0、9· 0 或 9. 5 % (w/v)，并且/或者所述一种或多种氨基酸存在于待干燥溶液中，其浓度为不超过或 少于20. 0、17. 5、15. 0、12. 5、11. 0或10. 5% (w/v)。最优选地，所述一种或多种氨基酸存在 于待干燥溶液中，其浓度是约10% (w/v)。
[0048] 多元醇
[0049] 待干燥溶液中的多元醇优选地是糖或糖醇。优选的糖包括蔗糖、海藻糖、甘露糖和 葡聚糖。优选的糖醇包括山梨糖醇、甘露醇和麦芽糖醇（matltitol)。待干燥溶液优选地包 括山梨糖醇、甘露糖、甘露醇和麦芽糖醇中的至少一种或多种，更优选山梨糖醇、甘露糖和 甘露醇中的至少一种或多种，还更优选山梨糖醇和甘露醇中的至少一种或两种。最优选地， 待干燥溶液至少包括山梨糖醇作为多元醇，任选地与甘露醇组合。
[0050] 在一个实施方案中，所述一种或多种多元醇优选地存在于待干燥溶液中，其浓度 在0. 1-20% (w/v)范围内，即重量百分比/溶液体积。因此，优选地，所述一种或多种多元醇 存在于待干燥溶液中，其浓度为至少或超过0. l、〇. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、8. 0、9. 0或9. 5% (w/v)，并且/或者所述一种或多种多元醇存在于待干燥溶液中，其浓度为不超过或少于 20. 0、17. 5、15. 0、12. 5、11. 0或10. 5% (w/v)。最优选地，在此实施方案中，所述一种或多种 多元醇存在于待干燥溶液中，其浓度为约10% (w/v)。举例来说，当使用山梨糖醇为多元醇 的时候，本实施方案中的所述浓度是合适的。
[0051] 在另一实施方案中，所述一种或多种多元醇优选地存在于待干燥溶液中，其浓度 处于0.1-40% (w/v)范围中，即重量百分比/溶液体积。因此，优选地，所述一种或多种多 元醇存在于待干燥溶液中，其浓度为至少或超过〇. l、〇. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、10. 0、12. 5、 15. 0、18. 0、19. 0或19. 5% (w/v)，和/或所述一种或多种多元醇存在于待干燥溶液中，其 浓度为不超过或少于 50. 0、40. 0、35. 0、30. 0、25. 0、22. 5、21. 0 或 20. 5% (w/v)。最优选地， 在此实施方案中，所述一种或多种多元醇存在于待干燥溶液中，其浓度为约40% (w/v)。例 如，使用两种不同的多元醇（如山梨糖醇和甘露醇）时，此实施方案中的所述浓度是合适 的。在此情况下，两种多元醇之间的重量比为1:100到1:1，包括如1:50、1 :20、1:10、1:5和 1:2。
[0052] 金属盐
[0053] 溶于待干燥溶液中的金属盐可以是二价或一价金属阳离子的任何可药用的盐。优 选的二价阳离子是Ca ++、Mg++和Zn++，其中Ca++和Mg++是更优选的，且其中Mg++是最优选的。 优选的单价阳离子是Li+、Na +和K+，其中Li+、Na+是更优选的，且其中Li+是最优选的。金 属盐中的抗衡阴离子（counter-anion)优选地不是氨基酸,优选地不是谷氨酸或天冬氨酸 盐。更优选地，金属盐中的抗衡阴离子是无机阴离子。优选的（无机）抗衡阴离子是C1-、 SO,和CO32'其中Cl-和SO,是更优选的，且其中Cl-是最优选的。所述溶液能包括上述 金属盐中的一种或多种的混合物。
[0054] 所述一种或多种金属盐优选地存在于待干燥溶液中，其浓度处于0.005-10% (w/ v)范围中，即重量百分比/溶液体积。因此，优选地，所述一种或多种金属盐存在于待干燥 液体中，其浓度为至少或超过 〇· 005、0· 01、0· 02、0· 05、0· 1、(λ 2、0· 5、L 0、2· 0、3· 0、4· 0 或 4. 5% (w/v)，和/或存在于待干燥溶液中的所述一种或多种金属盐的浓度为不多于或少于 10. 0、8. 0、7. 0、6. 0或5. 5% (w/v)。最优选地，存在于待干燥溶液中的所述一种或多种金属 盐的浓度为约5% (w/v)。
[0055] 应理解，假如待干燥溶液中的氨基酸是以氨基酸金属盐（如MSG)的形式溶解，那 么所述氨基酸金属盐不包括在所述一种或多种金属盐的重量百分比中而是包括在所述一 种或多种氨基酸的重量百分比中，因此金属抗衡阳离子的重量被包括在所述氨基酸的重量 中。
[0056] 缓冲剂
[0057] 所述待干燥溶液优选地具有中性pH，如pH在范围6. 0-8. 0,或6. 5-7. 5或约7. 0的 pH。所述待干燥溶液优选地包括缓冲剂以保持pH在指定的值。原则上，任何可药用缓冲剂 都能用于所述待干燥溶液中，缓冲剂优选地在如指定的PH值范围内具有有效的缓冲能力。 缓冲剂优选地以〇. 5-100mM的浓度存在，更优选l-50mM，最优选2-20mM，如约10mM。
[0058] 用于所述待干燥溶液的合适缓冲剂包括McIlvaine缓冲剂（参见实施例）、朽1檬酸 盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、HEPES缓冲剂和组氨酸缓冲剂。
[0059]水
[0060] 用于制备所述待干燥溶液的水优选地是超纯水，并优选无热原的水，如用于注射 的水。
[0061] 在本发明的待干燥溶液中的成分（如赋形剂）的浓度在本文中通常表示为重量百 分比/溶液体积（w/v)。应理解，溶质（如赋形剂）与溶剂（如水）的关系表示为克溶质/ 升总溶液。举例来说，在IL溶液中的50克葡萄糖被看为5% w/v溶液。
[0062] 在优选的实施方案中，所述待干燥溶液基本上由以下组成：具有上文限定的量的 生物药物试剂、5-20% (w/v)山梨糖醇、5-20% (w/v)谷氨酸单钠盐、2-10% (w/v)镁盐（优 选MgCl2和/或MgSO4)、任选的5-20% (w/v)甘露醇和任选的2-50mM可药用缓冲剂，该缓 冲剂将所述溶液缓冲至所指定的中性pH。
[0063] 干燥
[0064] 在本发明的方法中，干燥包括所述生物药物试剂的水性溶液。可以使用任何已知 的干燥方法。干燥的方法可以是，例如，喷雾干燥法，风干法、涂覆法、泡沫干燥法、脱水法 (desiccation)、真空干燥法、真空/冰冻干燥法或冰冻干燥法，其中所有的这些方法本身 都为本领域技术人员所知晓。在优选的实施方案中，所述干燥的方法是真空干燥法或冰冻 干燥法，其中冰冻干燥法或低压冻干法（Iyophilization)更为优选。
[0065] 在冰冻干燥过程的实施方案中，优选地首先将所述待干燥溶液冷冻至 初始冷冻干燥温度或搁板温度，所述初始冷冻干燥温度或搁板温度等于或低 于-50°C、-40°C、-30°C、-20°C或-KTC。优选的初始搁板温度是等于或低于-50°C或-40°C。 通过立即将所述溶液（含所述溶液的容器/小瓶）放置到具有如上所指定的初始搁板温 度的搁板上对所述待干燥溶液进行快速冷冻。或者，可通过以下方式对所述待干燥溶液进 行缓慢冷冻：通过将所述溶液（含所述的容器/小瓶）放置到具有〇°C以上的温度（如2、 4或6°C )的搁板上，然后通过降低温度（优选以每分钟约0. 5°C、I°C、2°C的速度），慢慢地 冷冻所述溶液到如上指定的初始冷冻干燥温度。可将所述待干燥的溶液置于100微巴或更 低的压力下。当到达设定的压力，可提高搁板温度到更高的温度。例如，可以以如〇.〇5°C、 0. 1°C或0. 2°C /分钟的速度提高搁板温度到高于初始冷冻干燥温度5°C、10°C或15°C的温 度。当在室内测量不到压力升高时，优选地结束首次干燥步骤。优选地在此时，以每分钟 如0. 01°C、0. 02°C或0. 05°C的速度提高搁板温度到如5°C、KTC、15°C、20°C或25°C，且任选 地，在一个或多个步骤中进行。在二次干燥阶段，优选保持温度在这个值直到监测不到压力 升高。本文的实施例中描述了一个优选的冷冻干燥过程。
[0066] 在真空干燥过程的一个实施方案中，所述待干燥溶液的温度优选地处于约 5°C -25°C范围内（如室温）或更优选地，温度在约10°C -20°C范围之间，如约15°C的温度。 随后降低压力到如小于1、〇· 5、0· 2、0· 1、0· 05mbar的压力。一旦处于降低的压力下，正被干 燥的溶液的温度可被降低至可以低于〇°C但（刚好）高于该溶液的低共熔温度的温度，以防 止溶液冻结。当室中测量不到压力提升时，可以每分钟如〇. 01°C、0. 02°C或0. 05°C的速度 提高溶液的温度到51：、101：、151：、201：或251：，且任选地，在一个或多个步骤中进行。优 选地，将所述温度保持在这个值直到监测不到压力提升。本文的实施例中描述了一个优选 的真空干燥过程。
[0067] 在第二方面，本发明涉及根据如上所述的方法可得到或得到的生物药物试剂的干 燥或被干燥的制剂。
[0068] 本发明的用于生产生物药物试剂的干燥制剂的方法优选地目标在于使干燥该制 剂时所述生物药物试剂的活性损失最小。优选地，本发明的方法以及制剂自身的目标也在 于使随后贮存根据本发明方法可得到的干燥制剂时，所述生物药物试剂的活性损失最小。 因此，本发明的方法优选地为生产生物药物试剂的稳定制剂的方法，即具有长的或延长的 贮存期的制剂，优选地在冷藏条件（如2°C -KTC )下，在室温（如18°C -25°C )下，或甚至 在可能出现在热带地区的高温（如32°C -45°C )下。
[0069] 生物药物试剂的活性损失或失活被理解为包括由化学途径（如氧化、水解作用或 酶作用）和物理途径（如变性、聚集、凝胶化）引起的活性损失。优选地，所述生物药物试 剂的活性损失不超过可接受的水平。换句话说，在干燥和/或随后的贮存后，保留的生物活 性或生存力的水平并且/或者原始功能或结构的水平至少足够用于该生物药物试剂的预 期商业治疗应用和/或诊断应用。
[0070] 根据所述生物药物试剂的种类，技术人员会知道使用哪种测定法来评估所述生物 药物试剂的活性。所述生物药物试剂的活性可表示为其生存力（如在有活力的活病毒的情 况下），或者活性可表示为可用技术人员已知的合适测定法中确定的酶活性或生物活性。在 其他情况下，所述活性还涉及该试剂的物理和化学完整性，且可通过评估所述生物药物试 剂的结构和/或功能来测定。抗原结构优选地是通过ELISA或Biacor分析进行评估。二 级和三级结构优选地是由UV-光谱法、荧光光谱法，傅里叶变换红外（FTIR)光谱法和/或 圆二色性（CD)光谱法进行评估。免疫源性优选地是通过使用动物模型（如小鼠、大鼠、棉 鼠、雪貂或兔子）的体内分析进行评估。例如，大鼠是脊髓灰质炎病毒的优选模型，棉鼠是 RSV的优选模型。
[0071] 在本发明方法的优选实施方案中，对所述（待干燥）溶液的干燥会使干燥的制剂 在干燥后（优选马上）再水化时，保留干燥前所述溶液中存在的生物活性的至少50、60、70、 75、80、85、90或95%。如果一种以上生物药物试剂存在于所述制剂中时，不同试剂的活性 损失的差异优选地小于50、60、70、75、80、85、90或95 %，籍此活性损失最多的试剂的剩余 活性表示为活性损失最少的试剂的剩余活性的百分比，后者设为100%。
[0072] 在本发明的另一优选实施方案中，在45°C下贮存至少一周后的干燥的制剂在将所 述干燥制剂再水化时，保留了干燥前所述溶液中存在的生物活性的至少50、60、70、75、80、 85、90或95%。假如一种以上生物药物试剂存在于所述制剂中时，不同药物的活性损失的 差异优选地少于50、60、70、75、80、85、90或95 %，籍此活性损失最多的试剂的剩余活性表 示为活性损失最少的试剂的剩余活性的百分比，后者设定为100%。优选地，如上所述的 贮存后所保留的活性的百分数在37°C或45°C下贮存两周、三周、四周、五周、六周、七周、八 周、九周、十周或更长时间后仍然能够保持。
[0073] 在第三方面，本发明涉及根据上述本发明方法可得到或得到的生物药物试剂的制 剂用作药物。对于用作药物，该制剂可以作为干燥的制剂使用或它可以通过例如使用如上 定义的水溶解干燥的制剂来复原。优选地，将该制剂复原到它的原始体积，即干燥前的体 积。优选地，该制剂是（在个体中）诱导针对传染病或肿瘤的免疫反应的制剂。应理解，被 给予本发明制剂的个体或受试者可以是人但也可以是动物，如农场动物或宠物，包括如哺 乳动物、鸟、家畜、家禽、牛（cattle)、牛科动物（bovines)。更优选地，该制剂是用于针对传 染病或肿瘤的疫苗接种的制剂。因此，优选地，该制剂是用于传染病或肿瘤的预防或治疗的 制剂。在另一实施方案中，本发明涉及根据如上所述的本发明方法可得到或得到的制剂用 于制备用于诱导免疫反应、用于疫苗接种和/或用于传染病或肿瘤的预防和治疗的药物的 用途。还在另一实施方案中，本发明涉及通过将有效量的所述制剂给予需要其的受试者来 诱导针对传染原或肿瘤的免疫反应的方法。优选地，诱导针对所述生物药物试剂中的抗原 的免疫反应。所述抗原优选地是引起传染病的病原体的抗原或肿瘤的抗原，或诱导针对该 病原体或肿瘤的免疫反应的抗原。所述病原体优选地为如上所述的病毒。通过鼻内、胃肠 夕卜、肌内、皮下的和/或经皮的途径，在复原或不复原的情况下，给予本发明的制剂。
[0074] 在本文及其权利要求书中，动词一包括Il和其词形变化以其非限制的含义来使 用，表示包括跟在该词后面的项目，但不排除未被具体提到的项目。另外，用不定冠词一一 (a) Il或一一个（an) Il提及的元素不排除存在一种以上该元素的可能性，除非上下文清楚 地要求有且只有一个该元素。因此，不定冠词一一（a) Il或一一个（an) Il通常表示一至少 一个 Il。
[0075] 本说明书中引用的所有专利和参考文献都以引用的方式全文纳入本文。
[0076] 以下提供的实施例只作为示例性的目的，而并未意在以任何方式限制本发明的范 围。

【专利附图】

【附图说明】
[0077] 胤！在血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率（实验 A) 。检测蔗糖（SUC)、海藻糖（TREH)、甘露醇（MAN)、葡聚糖（DEX)和氯化钠（NaCl)的稳定 效果。
[0078] 图2响应曲面图(response surface plots)，代表含10%甘露醇和0%葡聚糖的 IPV-制剂的低压冻干后即时的三种血清型的D-抗原回收百分数。
[0079] 在血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率（实验 B) 。检测了蔗糖（SUC)、海藻糖（TREH)、谷氨酸单钠盐（MSG)、羟乙基淀粉（HES)和氯化钠 (NaCl)的稳定效果。
[0080] Mi在真空干燥（V)、慢速冷冻速度的低压冻干（L)和快速冷冻速度的低压冻干 (S)后即时的D-抗原回收率。研究了蔗糖与海藻糖的稳定效果（与不添加稳定剂的IPV疫 苗（阴性对照）相比）。
[0081] 在所示的血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率 (实验C)。
[0082] M6在血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后的D-抗原回收率（实验D)。除 了 D11-D16不包括5%蛋白胨，所有制剂包括5%山梨糖醇、125mM NaCl和5%蛋白胨，所有 制剂如文中进一步所示。
[0083] SI所示的冻干的血清型1、2和3型IPV-制剂的加速稳定性测验（实验D)，其由 在45°C下孵育一周后的D-抗原回收率确定。
[0084] _所示的血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率（实 验E)。通过使用快冷冻速度（A图）和慢冷冻速度（B图）测试山梨糖醇（SOR)、蔗糖（SUC)、 甘露醇（MAN)、谷氨酸单钠盐（MSG)、蛋白胨（PEP)和MgCl2的稳定效果。
[0085] _在45°C下培育一周后，所示的冻干的血清型1、2和3型IPV-制剂的稳定性 (实验E)，其使用快冷冻速度（A图）和慢冷冻速度（B图）检测。只显示在低压冻干后最 有前景的制剂。
[0086] 凰迎在血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率（实验 F，η = 3)。研究在有或没有10 %甘露醇的情况下蛋白胨对包括10 %山梨糖醇、10 % MSG和 5% MgCl2的IPV-制剂的稳定效果。在低压冻干过程的干燥阶段前，快速冷冻所有制剂。
[0087] fill在45°C下孵育一周后，冻干的血清型1、2和3型IPV-制剂的稳定性（实验 F，η = 3)。这个实验研究了在加速稳定性期间，添加蛋白胨或单氨基酸是否能够改善包括 10%山梨糖醇、10% MSG和5% MgCl2 (有或没有10%甘露醇）的IPV-制剂。
[0088] ai2具有所示的不同缓冲剂组分的血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即 时的D-抗原回收率（实验G)。在图A、B、C和D中所示的四种制剂均包括10%山梨糖醇 和10% MSG，并使用IOmM McIIvaine缓冲剂、IOmM柠檬酸缓冲剂、IOmM组氨酸缓冲剂、IOmM HEPES缓冲剂和IOmM磷酸盐缓冲剂进行测试。未对对照制剂进行透析。
[0089] _在低压冻干并随后在45°C下贮存一周后，具有所示的不同缓冲剂组分的冻 干的血清型1、2和3型IPV-制剂的稳定性（实验G)。测试与IOmM McIlvaine缓冲剂、IOmM 柠檬酸缓冲剂、IOmM组氨酸缓冲剂、IOmM HEPES缓冲剂和IOmM磷酸盐缓冲剂结合的四种制 齐U，所述四种制剂包括10%山梨糖醇、10% MSG和MgCl2，包含或不包含甘露醇，包含或不包 含蛋白胨。不透析对照制剂，且用含所示赋形剂的McIlvaine缓冲剂1:1稀释该对照制剂。
[0090] 凰11真空干燥（V)、慢冷冻速度的低压冻干（L)和快冷冻速度的低压冻干（S)后 即时的D-抗原回收率。与不添加稳定剂的IPV疫苗（阴性对照）以及蔗糖或海藻糖配制 的IPV相比，不同制剂的稳定效果。
[0091] 图15在所示血清型1、2和3型IPV-制剂的低压冻干后即时的D-抗原回收率。
[0092] 图16低压冻干并随后贮存在45°C下一周后，所示的血清型1、2和3型IPV-制剂 的稳定性，其通过D-抗原回收率确定。
[0093] 实施例
[0094] L材料和方法
[0095] L 1 材料
[0096] 从 RlVM-Vaccinology 的过程发展开发部（Bilthoven, The Netherlands)得到的 三价的灭活脊髓灰质炎疫苗（Salk-IPV)，所述疫苗包括灭活的Mahoney病毒株（对于I 型）、MEF (对于2型）和Saukett (对于3型）。Salk-IPV三价原液（10 X)被配制成十倍 浓缩的40-8-32DU/单人剂量（1ml)。使用Westdijk et al.所述的QC-ELISA确定了本研 究中使用的IPV05-126B原液的浓度为411-90-314DU/ml。
[0097] 赋形剂蔗糖、D-山梨糖醇、D-海藻糖二水合物、D-葡萄糖一水合物、甘露醇、 L-谷氨酸单钠盐一水合物（在此被称为谷氨酸盐、谷氨酸钠、谷氨酸单钠盐或MSG)、肌 醇（myo-inositol)、D-棉子糖、轻乙基淀粉、甘氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、二水氯化隹丐、 麦芽糖醇、氯化镁六水合物、氯化锂和卵清蛋白全采购于Sigma(St. Louis, MO)。蛋白胨 (植物）、葡聚糖（6kDa，来自明串珠菌属（Leuconostoc ssp))、L-组氨酸、L-丙氨酸、氯 化锌、乳糖酸1丐单水合物来自Fluka(Buchs,瑞士）。乳糖醇（LilCly电-M )来自Purac Biochem (Gorinchem, The Netherlands)，L-精氨酸（EP,非动物来源）和 Tween80 来自默 克（达姆施塔特，德国），聚乙烯吡咯烷酮25(PVP，29kDa)来自Serva Feinbiochemica GmbH (海德尔堡，德国），Sol-U-Pro ( -种水解猪明胶）来自Dynagel Inc. (Calumet City，IL)和聚焦糖（Ficoll)来自法玛西亚（乌普萨拉，瑞典）。作为缓冲剂成分，使用来 自Merck的磷酸二氢钠二水化合物（NaH 2PO4)、氯化钠（NaCl)、磷酸二氢钾（KH2PO4) 和EDTA。 柠檬酸三钠二水化合物、柠檬酸和HEPES来自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)和磷酸氢二钠 (Na2HPO4)来自Fluka (Buchs，瑞士）。所用的所有赋形剂都为试剂质量级或更高级别。
[0098] 为了制备IOmM McIlvaine缓冲剂，将IOmM柠檬酸以1:6的比例加到IOmM Na2HPO4 中，且pH值为7.0。对于IOmM柠檬酸缓冲剂，将成分柠檬酸三钠二水合物（IOmM)和柠 檬酸（IOmM)混合在一起直到pH为7. 0。pH7. 0的IOmM磷酸盐缓冲剂由IOmM KH2PO4和 IOmMNa2HPO4组成。IOmM HEPES缓冲剂和IOmM组氨酸缓冲剂是通过以下方式制备：称量和 溶解所述缓冲剂成分，随后用HCl和/或NaOH调整pH值在7. 0。
[0099] 1.2 方法
[0100] L 2. 1 诱析
[0101] 除非另外说明，使用IOkDa截留分子量、低结合的再生纤维素膜透析盒 (SlWe-A-Lyzer⑩，Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL)，将三价 IPV 原液用 IOmM McIlvaine缓冲剂（pH 7. 0)透析，以替换IPV原液（M199培养基）的缓冲剂成分。
[0102] 1. 2. 2待干燥溶液
[0103] 以指定最终浓度的两倍浓度，将所有赋形剂在McIlvaine缓冲剂中溶解。经透析 的IPV与待测试制剂等量混合。随后，用〇. 2ml的IPV-赋形剂混合物填充2ml玻璃注射小 瓶（Milller+Miiller, Holzminden, Germany)，并提供 13mm 的预干燥（90 °C 过夜）的橡皮塞 (V9250 型，来自 Helvoet Pharma, Aiken, Belgium)。
[0104] 1. 2. 3低压冻干讨稈和直宇干燥讨稈
[0105] 对于低压冻干，装填的且半塞上的小瓶被装到Leybold GT4冷冻干燥器或Zirbus pilot/laboratory冷冻干燥装置升华器2-3-3里，搁板温度（shelf temperature) 是-50°C，或搁板温度4°C然后通过以1°C /分钟的速度降低温度冷冻到_50°C，上述两种方 式分别被表示为快速冷冻和慢速冷冻。保持小瓶在-50°C持续2小时。对于首次干燥阶段， 以0. 1°C /min提升搁板温度到-45°C，然后以0. 02°C /min升到-40°C，随后孵育42小时。 通过以0. 02°C /min进一步提高搁板温度到KTC，随后在KTC孵育8小时，来进行第二次干 燥阶段。之后，以〇. 02°C /min提高搁板温度到25°C。
[0106] 对于真空干燥，装填的且半塞上的小瓶被装到Zirbus冷冻干燥装置升华器2-3-3 里，搁板温度15°C，且保持在该温度下持续10分钟。以不同速度（lmbar/min、0. 3mbar/min、 0. lmbar/min)的15分钟梯度降压（ramping)步骤，降低室压力到lmbar，且从25mbar的室 压开始。降低温度到_l〇°C，在0. 05mbar持续1小时，在0. 03mbar持续1小时，使得制剂不 被冻结（产品温度高于制剂的低共烙温度（eutectic temperature))。随后，以0· 05? / min提高搁板温度到30°C。在循环结束时，在真空中封闭所述小瓶，用alu-caps密封且保 持在4°C直到进行分析。真空干燥过程期间的搁板温度和室压的实例在表1中示出。
[0107] 表 1
[0108]

【权利要求】
1. 一种生产生物药物试剂的干燥制剂的方法，其中所述方法包括干燥包括生物药物试 齐U、氨基酸、多元醇、金属盐和水的溶液。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述溶液基本上由lpg-l〇g/ml的所述生物药物试剂、 0.01-20% (w/v)的所述氨基酸、0· 5-20% (w/v)的所述多元醇、0.005-10% (w/v)的所述 金属盐和水构成。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中： a) 所述氨基酸是谷氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸或它们的 混合物； b) 所述多元醇是山梨糖醇、甘露醇、甘露糖、麦芽糖醇或它们的混合物； c) 所述金属盐是Mg++盐、Ca++盐或者Li+盐或者它们的混合物，优选Cr盐或者SO,盐 或者它们的混合物。
4. 根据权利要求3的方法，其中谷氨酸以谷氨酸单钠盐的形式溶解在所述溶液中，并 且/或者其中精氨酸是聚-L-精氨酸的形式并且/或者其中赖氨酸是聚-L-赖氨酸的形式。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述溶液基本上由以下构成：lpg-10g/ml的所述生物 药物试剂、5-20% (w/v)的山梨糖醇、5-20% (w/v)的谷氨酸单钠盐、2-10% (w/v)的镁盐， 优选MgCl2和/或MgS04，以及任选的5-20% (w/v)的甘露醇。
6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述溶液包括可药用缓冲剂并且被缓冲在 中性pH下。
7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述溶液是通过风干法、真空干燥法、喷雾 干燥法或低压冻干法干燥。
8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物药物试剂是包括蛋白质材料 的试剂，优选地所述生物药物试剂是病毒，如肠道病毒属（Enterovirus)或肺病毒属 (Pneumovirus)〇
9. 根据权利要求8的方法，其中所述生物药物试剂包括血清型1、2和3型的脊髓灰质 炎病毒，优选灭活的血清型1、2和3型脊髓灰质炎病毒，或者其中所述生物药物试剂是人 RSV或牛RSV，优选包括具有缺失或失活的G附着蛋白基因的病毒基因组的RSV。
10. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述干燥制剂在干燥后复原时保留干燥 前存在于所述溶液中的生物药物试剂活性的至少50%。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述待干燥的溶液包括一种以上的不同生物药物试 齐U，并且其中所述不同试剂的活性损失的差异优选地少于50%，籍此活性损失最多的试剂 的保留活性表示为活性损失最少的试剂的保留活性的百分数，后者设为100%。
12. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在45°C下贮存至少一周后复原时，所述 干燥制剂保留干燥前存在于溶液中的生物药物试剂的活性的至少50%。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述干燥制剂包括一种以上的不同生物药物试剂， 并且其中所述不同试剂的活性损失的差异优选地少于50%，籍此活性损失最多的试剂的保 留活性表示为活性损失最少的试剂的保留活性的百分数，后者设为100%。
14. 根据权利要求1-13中任一项的方法可得到的生物药物试剂。
15. 根据权利要求14的制剂用于在个体中诱导针对传染病或肿瘤的免疫反应。
【文档编号】A61K9/19GK104271119SQ201380023800
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年3月5日 优先权日:2012年3月5日
【发明者】H·克兰, 简-皮埃尔·阿莫瑞杰 申请人:由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国