用于纯化单克隆抗体的结晶方法
【专利摘要】本公开涉及从无细胞培养物上清中结晶抗体的方法。
【专利说明】用于纯化单克隆抗体的结晶方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年5月11日提交的美国临时申请序列号61/645, 855的优先权。
【技术领域】
[0003] 本公开涉及结晶和纯化单克隆抗体的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 本公开涉及直接从培养物上清（如细胞培养物的无细胞上清，所述培养物分泌抗 体到上清中）高产率制备和纯化晶体形式的单克隆抗体。蛋白结晶的问题包括例如：1)需 要专用设备；2)生成多形态晶体；3)需要接种以起始结晶；4)耗时的工艺（如60-80小 时）；5)结晶前的色谱步骤（如蛋白A、离子交换（IEX) ;7)使用不利的添加剂和/或赋形 剂（如聚乙二醇）；和8)存储困难。尽管单克隆抗体先前从细胞培养物上清中直接结晶， 但产率较低。另外，之前的方法需要使用添加剂如聚乙二醇。令人惊讶地，本文所述方法可 从无细胞培养物上清高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体，而不需使用昂贵的步骤或设 备。这些新方法提供许多优势，包括例如适于配制成药物产品的高浓缩、稳定结晶抗体以及 显著的时间和成本效益。
[0006] 附图简要说明
[0007] 图L示例性结晶方法。
[0008] 图2A-C.示例性结晶条件。
[0009] 图3A-B.示例性晶体。
[0010] 图4.示例性条件下pH对结晶的影响。
[0011] 图5.示例性条件下的结晶动力学。
[0012] 图6.额外示例性条件下的结晶动力学。
[0013] 图7A和B.示例性晶体。
[0014] 图8.示例性晶体。
[0015] 图9.示例性晶体。
[0016] 图10.示例性晶体。
[0017] 图11.示例性晶体。
【发明内容】
[0018] 本公开涉及解决单克隆抗体纯化中通常所遇到问题的发明方法。令人惊讶地，本 文所述方法用于从含单克隆抗体的混合物中提供纯化单克隆抗体制品。在一些实施方式 中，本文所述发明方法可直接从无细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗 体。在本文所述特定实施方式中，这通过使用低离子强度缓冲液完成。在一些实施方式中， 所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括在促进沉淀的合适PH条件下将低离子强度缓 冲液引入含单克隆抗体的无细胞培养物上清。然后，通常移出所得主要含杂质的沉淀物 (如，由此生成澄清的上清）。随后，任选地，浓缩所述澄清的上清。接着可引入合适缓冲液 以生成预处理溶液。之后，该预处理溶液的pH可处于或调整至蛋白结晶的合适水平（如，对 于在pI6. 8或附近结晶的蛋白，pH应为约6. 8)。还可包括一种或多种添加剂（如氯化钠、 聚乙二醇、糖）。所得晶体可随之通过例如离心来分离。图1描述某些实施方式。一些实 施方式提供了包含存在于初始无细胞培养物上清中的至少约50 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%或99%蛋白（如抗体）的产品。使用前，所述晶体可溶于合适溶液，然后任选地，通过 调整溶液pH至蛋白结晶的范围（如对于在pI6. 8或附近结晶的蛋白，pH应为约6. 8)再结 晶。例如，通过调整细胞培养物上清的起始蛋白浓度和/或以特定速度搅拌任何步骤的底 物，可控制所得晶体的大小。还提供含结晶抗体的组合物和再溶解抗体。
[0019] 本发明方法可没有色谱步骤。从一个或多个发明方法步骤去除色谱的优势包括生 成晶体形式的纯化单克隆抗体的时间显著减少。本发明的特定实施方式包括对所述步骤的 原料或直接产品没有实施色谱的那些实施方式。本发明的特定实施方式包括在结晶步骤前 没有实施色谱的那些实施方式。
[0020] 发明详述
[0021] 如上所简要描述和下面更详细描述，本公开涉及纯化单克隆抗体的方法。令人惊 讶地，本文所述方法可用于从含单克隆抗体的组合物中提供纯化单克隆抗体制品。如上所 述，这通过使用低离子强度缓冲液完成。在一些实施方式中，本文所述发明方法可直接从无 细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体。在一些实施方式中，所述制备晶 体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下步骤：提供含单克隆抗体的无细胞培养物 上清，将低离子强度缓冲液以足以促进所述抗体结晶的量引入（如稀释或置换（例如通过 部分或完全透析））无细胞培养物上清，调整所得溶液的PH以生成晶体，以及分离晶体，其 中分离所述无细胞培养物上清中含有的至少50 %抗体。
[0022] 在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下 步骤：测定抗体在低离子强度缓冲液中结晶的PH范围，将所述缓冲液以足以促进所述抗体 在该PH范围内结晶的量引入（如稀释或置换（如通过部分或完全透析））细胞培养物上清 从而生成预结晶溶液，调整所述预结晶溶液的PH到上面测定步骤的测定范围以生成晶体， 以及分离晶体，其中分离所述无细胞培养物上清中含有的至少50%抗体。
[0023] 在一些实施方式中，所述制备晶体形式单克隆抗体的方法可包括一个或多个以下 步骤：a)获得生成单克隆抗体的杂交瘤的无细胞培养物上清，且任选地，将其浓缩；b)用缓 冲液（如低离子强度缓冲液）透析上清以提供合适pH ;c)从所述上清移除步骤b)形成的 沉淀物（若存在）以生成澄清的上清；d)任选地，浓缩所述澄清上清；e)任选地，用合适缓 冲液透析c)或d)的澄清上清以生成预处理溶液；f)从步骤e)的预处理溶液移除沉淀物 (若存在）；g)调整步骤e)或f)的预处理溶液的pH至单克隆抗体结晶的合适水平（如对 于在pI6. 8或附近结晶的单克隆抗体，pH应为约6. 8)，和任选地，引入一种或多种添加剂以 生成结晶溶液；和h)通过例如离心来分离步骤g)形成的晶体。
[0024] 尽管单克隆抗体先前从细胞培养物上清中直接结晶，但产率较低。之前的方法通 常需要使用添加剂如聚乙二醇。标准结晶筛选一般不包括低离子强度缓冲液。PH对蛋白溶 解度的影响极高（其可能降低过饱和的可能性）。如本文所示（如实施例），含低离子强度 缓冲液的蛋白溶液的简单pH变化能令人惊讶地用于降低单克隆抗体溶解度（例如，从pH5 的>200g L-1到pH6. 8的0. 3g L-1)，进而引起极高的过饱和及结晶（如，在pH6. 8无沉淀）， 在pH5(在该点抗体可溶）有杂质沉淀（其中一些能抑制结晶）。令人惊讶地，本文所述方 法可直接从无细胞培养物上清中高产率生成高纯度、结晶的单克隆抗体。图1描述某些实 施方式。在某些实施方式中，可浓缩步骤a)产生的澄清上清。在一些实施方式中，pH可用 缓冲液调整，所述缓冲液任选地包括一种或多种选自氯化钠、聚乙二醇和糖的添加剂。令人 惊讶地，一些实施方式提供的产品包括例如上面步骤a)的初始无细胞培养物上清中存在 的至少约50 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或99 %抗体（如高产率）。使用前，所述晶体可 溶于合适溶液（如药物组合物）。所述晶体还能溶解且随后任选地再结晶，例如通过调整溶 液pH到合适水平（如对于pi约6. 8的单克隆抗体，pH应为约6. 8)。这些方法中，例如通 过调整细胞培养物上清的起始蛋白浓度和/或以特定速度搅拌任何步骤的底物，可控制所 得晶体的大小。下面描述这些方法的其他细节、所生成产物和所述产物的应用。
[0025] 本文所述方法通常起始于细胞的无细胞培养物上清，其生成待结晶的单克隆抗体 (如步骤a))。应理解还可使用其它原料（如杂交瘤培养物，腹水，含待结晶抗体的半纯化 或纯化制品）。这些方法还能适于从血清等分离"纯化的"多克隆抗体。关于无细胞培养物 上清，其可从培养物中直接使用（如直接）或在加工前进行浓缩。例如，所述无细胞培养物 上清可浓缩约 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 倍以提供更小体 积和因而更高蛋白（和其它组分）浓度（例如，IOOml到10ml，倍数为10,或10:1)。例如， 所述无细胞上清的浓度可为约l-l〇〇g/L，如约10g/L、25g/L或50g/L。如本领域普通技术 人员所理解，可用数种广泛可行技术中的任意一种来实现浓缩，所述技术例如离心、硫酸铵 浓缩、微型离心和/或超过滤（如有Ultracel-IO膜的Amicon Ultra-15离心超滤管）。本 领域普通技术人员会理解这些和其它适当原料。
[0026] 如实施例所述，所述无细胞培养物上清（例如，任选地浓缩）通常包含单克隆抗体 以外的许多组分（如杂质）。所述细胞培养基可能不适用于本文所述方法，因此可与另一 缓冲液交换。因此，所述无细胞培养物上清能与缓冲液（例如低离子强度缓冲液如组氨酸 缓冲液如IOmM组氨酸、IOmM NaCl，用乙酸通过错流超滤管调至pH5)交换（如稀释和/或 透析），所述缓冲液包含与本文所述方法兼容的组分（例如提供约PH4-10的适当pH(如约 4· 9、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、6· 8、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9. 0 或 9. 5))。例如，所述缓冲液可以是"低 离子强度"缓冲液（如提供约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或121^〇1^或更低的传导率）。 例如，示例性合适缓冲液可包括IOmM组氨酸缓冲液，有或没有一种或多种盐，如IOmM组氨 酸缓冲液/20mM氯化钠或IOmM组氨酸缓冲液/IOOmM氯化钠（传导率：10. 9mS cnT1)。这 类缓冲液还能促进杂质从无细胞培养物上清沉淀。在一些实施方式中，可采用透析管式膜 (Dialysis Tubing Visking(MWCO) 14000)。杂质在透析/缓冲交换期间和/或之后沉淀时， 能用诸如过滤或离心的技术（例如3000-5000rcf (如3200rcf、5252rcf)，持续10、15或20 分钟）分离沉淀物与抗体（和其它非沉淀组分）。在一些实施方式中，含抗体的所得溶液可 称为"澄清的上清"（或如实施例，称为"预处理收获物"）。澄清上清（或预处理收获物） 的传导率优选为约 0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 46、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9. L 0、1· 1、1· 2、1· 3、1· 4、 1. 5、1· 6、1· 7、1· 8、1· 9、2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0、11 (例如 10. 9)或 12mS cnT1。如本领域普通技术人员所理解，其它制备预处理收获物的方法也可能适合，所述收获 物用于通过本文所述方法加工。
[0027] 然后，所述澄清的上清任选地用数种广泛可行技术（如离心、硫酸铵浓缩、和/或 超过滤）中的任意一种来浓缩，如本领域普通技术人员所理解。随后，所述澄清的上清（未 浓缩或浓缩）任选地用另一缓冲液（如低离子强度缓冲液）透析（如交换）以生成"预处 理溶液"（例如组氨酸缓冲液如IOmM组氨酸、IOmMNaCl，用乙酸通过错流超滤管调至pH5)。 例如，所述缓冲液能包含缓冲组分（如约l_15mM组氨酸（例如3、10、14mM)(约pH4-10 (例 如约 4· 9、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、6· 8、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9. 0 或 9. 5))、一种或多种盐（如 NaCl) 和/或一种或多种糖（如海藻糖）。引入这类缓冲液通常会引起含杂质的沉淀物形成。然 后，能用诸如过滤或离心的技术（例如3000-5000rcf (如3200rcf、5252rcf)，持续10、15 或20分钟）分离沉淀物与抗体（和其它非沉淀组分）以生成"澄清的预处理溶液"。澄清 的预处理溶液的传导率优选为约 0. l、〇. 2、0. 3、0. 4、0. 46、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9. I. 0、1. 1、 1. 2、1· 3、1· 4、1· 5、1· 6、1· 7、1· 8、1· 9、2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0、11(例如 10.9)或12mS cnT1。之后，所述澄清的预处理溶液通常用作结晶底物，尽管预处理收获物也 适合。如本领域普通技术人员所理解，其它制备结晶用预处理溶液的方法也可能适合。
[0028] 然后，所述预处理溶液的pH通常调至特定蛋白会结晶的合适水平。通常地，合适 pH是匹配待结晶蛋白pi的pH。例如，对于pi约6. 8的蛋白，pH应为约6. 8。pH可由合 适缓冲液提供，所述缓冲液包括例如TRIS (如约2-20mM TRIS (例如TRIS-HC1)，如约4、6、 7、8、9、12、12.8、14、15、16、18禮）、组氨酸（例如约5-2〇1111组氨酸，如约10或约14.251111)、 HEPES (例如约5-20mM HEPES，如约IOmM)、磷酸盐（例如约5-20mM磷酸盐，如约IOmM)、甲次 砷酸盐（例如约5-20mM如约IOmM)，任选地连同酸或碱（如乙酸、HCl和/或NaOH，来自例 如10%或0.5M储液）以提供取决于蛋白的适当pH(例如，就对应pi为约4-10(如约4. 9、 5· 0、5· 5、5· 5-7. 7、6· 0、6· 4、6· 5、6· 6、6· 8、7· 0、7· 5、7· 6、8· 0、8· 5、9. 0 或 9. 5)的蛋白而言， pH通常为约4-10)，以及任选地一种或多种额外添加剂（例如约5-100mM NaCl (如约10、 15、20、25、30、40、50、60、70*80mMj^]2-8%w/vPEGMffi2000 4^]2-8%w/vPEGMME5000; 约 0· 8-1. 6mM MgSO4 ;约 5-llmM mM KCl (例如约 5. 4mM 或 10. 8mM);约 I-IOmM CaCl2 (例如 约 1. 8、3· 6 或 IOmM)、约 2mM EDTA ;约 10-20mM Li2SO4 ;约 10-40mM LiCl (例如约 10、20、 40 或 40mM LiCl);约 10-20mM NH4Cl ;约 IOmM(NH4)2SO4 ;聚乙二醇（如 PEG1500、PEG3000、 PEG10000G^i^^^Jl-20%vA^^^]2-8%GnPEG10000)、4%、4-8%GnPEG3000)*6-10% (如PEG1500)v/v);-种或多种糖（如鹿糖、海藻糖（例如约40-400mM如约250mM);甘油 (例如约 5-20% v/v) ;2_ 丙醇（例如约 1-20% v/v) ;1，4-二恶烷（约 1-20% v/v);己二 醇（例如约1-5% v/v);乙醇（例如约1-25% v/v);和/或己二醇）以生成结晶溶液。晶 体随后能在合适温度（如l〇°C、2(TC、25°C或30°C，优选约KTC )下于合适时间段内（约 1-150分钟，如约3、35、60或120分钟）形成。蛋白浓度通常是约0. l-100g/L(如约1、2、4、 10、25、26、50g/L)。合适的结晶溶液通常包含一种、一些或所有这类组分并提供（如诱导） 结晶而没有沉淀。这可在结晶前或期间有或没有用预形成晶体接种结晶溶液的情况下发 生。然后，通过例如过滤或离心（如约60-55000Xg(例如5252Xg或50377Xg))约1-10 分钟（如约3分钟）来分离所形成的这些晶体。例如，通过调整细胞培养物上清的起始蛋 白浓度到合适水平（如约1、3、5、10、25、30、35、40、45或50g/L)和/或用特定设备和/或 以特定速度搅拌任意一个或多个步骤的底物，可至少一定程度上控制用这些方法最终所得 晶体的大小。例如，在一些实施方式中，采用叶轮可能有益，所述叶轮提供温和的水动力条 件（如小于IW kf的每体积功率输入）和/或维持悬浮晶体，如适当的多叶片分段式叶轮 (例如三叶分段式叶轮）和/或以约50-300rpm(例如约100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290 或 300rpm)搅拌。这些实施方 式能提供高度过饱和，使得成核和晶体生长速率增加。
[0029] 还可通过在特定范围的最大局部能量耗散（ε _)搅拌来实现成核速率增加。例 如，适当的范围可以是约0.009W kg4 -约1.3W kg4(如约任意0.009、0.01、0.025、 0· 05、0· 075、0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、1· 0、1· 1、1· 2、1· 3 ;或约 300rpm)。 例如，最优范围可以是约0. 1-约0. 4W kg4 (如约0. 1、0. 2、0. 3或0. 4W kg4)。适当范围 可能取决于所用反应器类型且可通过测量硅油/表面活性剂/水乳胶的粒径分布来测定。 适当范围可选作硅油粒径减少直至达到平衡的点。此系统的所得粒径分布完全归因于反应 器特异性粉碎工艺。因此，粒径与局部水流应力的最大强度ε_(=最大局部能量耗散） 之间存在依赖性，ε_越高，产生的颗粒越小（Henzler，H.《生物反应器中的颗粒应力》 (Particle Stress in Bioreactors)，Adv. Biochem. Eng. 67:59(2000))。使用具有 20mm2s-1 低粘度和〇. 98g ·αιΓ3密度（25°C下）的硅油（baysilon油PK20)，特性使实验能在甚至低搅 拌速率（如30rpm-350rpm)下进行。例如，9体积的水溶液与8% v/v曲通（Triton)X-IOO 用1体积的苏丹红IV染色硅油仔细分层。在KTC搅拌所述体系24小时后，平衡颗粒直径 (d5Q, 3)是体积和分布的中位油滴直径，如图像分析（例如光学）所测。用于结晶的(15。,3值 是300μπι-240〇 μπι。其它蛋白（如溶菌酶）可用更快成核速率（如d5Q，3值为约440μπι)结 晶。为了估计对应值，如下所述额外鉴定1升反应器。用扭矩传感器测量平均功率消 耗 ε。emax/ε比能通过下式估计（如Henzler,同上，等式20):
[0030]
【权利要求】
1. 一种制备晶体形式的单克隆抗体的方法，所述方法包括： a) 提供包含单克隆抗体的无细胞的细胞培养物上清， b) 将低离子强度缓冲液以足以促进所述抗体结晶的量引入该无细胞的细胞培养物上 清， c) 调整所述预结晶溶液的pH以生成晶体，和 d) 分离步骤c)形成的晶体， 其中在步骤d中分离所述无细胞的细胞培养物上清中含有的至少50%抗体。
2. -种制备纯化的单克隆抗体的方法，所述方法包括： a) 将包含单克隆抗体的组合物用低离子强度缓冲液透析，其中杂质从所述组合物中沉 淀； b) 移除沉淀物以生成第一澄清组合物； c) 任选地，用低离子强度缓冲液透析所述澄清组合物，其中杂质从所述组合物中沉淀 以生成第二澄清组合物； d) 移除来自步骤c)组合物的沉淀物； e) 调整所述第一或第二澄清组合物的pH到大约单克隆抗体的pi和任选地引入一种或 多种添加剂以生成晶体；和 f) 分离步骤e)中形成的晶体。
3. -种直接从细胞培养物上清制备晶体形式单克隆抗体的方法，所述方法包括： a) 将包含单克隆抗体的无细胞的细胞培养物上清用低离子强度缓冲液透析； b) 从所述上清移除步骤a)中形成的沉淀物（若存在）以生成澄清的上清； c) 任选地，浓缩所述澄清上清； d) 任选地，用低离子强度缓冲液透析b)或c)的澄清上清以生成预处理溶液； e) 从步骤d)的预处理溶液移除沉淀物（若存在）； f) 调整步骤d)或e)的预处理溶液pH到大约单克隆抗体的pi和任选地引入一种或多 种添加剂以生成晶体；和 g) 分离步骤f)中形成的所述晶体。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤b)前浓缩所述无细胞的细 胞培养物上清。
5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液提供小 于或等于约12mS cnT1的传导率。
6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液在所述 调整步骤前的pH处于所述抗体可溶且不结晶或沉淀的pH附近。
7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液是组氨 酸缓冲液。
8. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液包括至 少一种或多种盐。
9. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液包括至 少一种或多种糖。
10. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH用Tris缓冲液调节。
11. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH用含一种或多种添加 剂的缓冲液调节，所述添加剂选自氯化钠、聚乙二醇和糖。
12. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述无细胞的细胞培养物上清 中含有的至少约50 %抗体在所述分离步骤中被分离。
13. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述结晶抗体的纯度为至少约 90%。
14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述分离晶 体溶于溶液。
15. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过调整所述 溶液pH到大约单克隆抗体的pi来再结晶所述单克隆抗体。
16. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过调整所述 细胞培养物上清的起始蛋白浓度来控制晶体大小。
17. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过以特定速 度搅拌底物来控制晶体大小。
18. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述结晶在每体积功率输入小 于1W Γ1的搅拌下发生。
19. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述最大局部能量耗散（ε_)是约 0· 009W kg-1 -约 1. 3W kg'
20. 如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述最大局部能量耗散（ε max)是约0.1_ 约 0· 4W kg-1。
21. 如权利要求17-20中任一项所述的方法，其特征在于，三叶分段式叶轮被用于搅 拌。
【文档编号】A61K39/395GK104284676SQ201380024777
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2012年5月11日
【发明者】D·赫克马特, B·赫尔克, H·K·舒尔茨, B·斯梅杰卡尔 申请人:诺华股份有限公司