中和rsv、mpv和pvm的抗体和其应用的制作方法
【专利摘要】本公开涉及抗体和其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染。本公开还涉及编码这样的抗体和抗体片段的核酸、产生这样的抗体和抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞以及结合这样的抗体和抗体片段的多肽。此外，本公开涉及抗体、抗体片段以及本发明的抗体识别的多肽在筛选方法以及在RSV或MPV感染和RSV和MPV共感染的诊断、治疗和预防中的应用。
【专利说明】中和RSV、MPV和PVM的抗体和其应用
[0001] 该申请要求2012年3月20日提交的美国临时申请号61/613, 197和2012年6月4 日提交的美国临时申请号61/655, 310的权益，其公开内容以其全部在此通过引用被并入， 如同记载在本文中。
[0002] 发明背景
[0003] 小鼠呼吸道合胞病毒（RSV)和变性肺病毒（MPV)和肺炎病毒是常见的属于副粘病 毒（paramyxovirus)家族的感冒病毒，其共享目标群体和代表新生儿和免疫受损的患者中 主要的健康问题。
[0004] RSV是全球婴儿和成人呼吸道疾病的主要原因。具有RSV感染的儿童的0.5% 和 3. 2 % 需要住院（Thompson, W.W.et al·，2003, JAMA:The Journal of the American Medical Association 289:179-186)，并且儿童的5%至10%具有延长的严重感染，认为是 以后童年里易感染哮鸣和哮喘样症状的一个因素。对RSV的免疫似乎是短暂的，因此再感 染频繁（〇gra, 2003, Paediatric Respiratory Reviews 5 Suppl A:S119_126)。
[0005] 人MPV在2001年被首次分离，并且现在被公认为是婴儿和成人中急性呼吸道疾病 的第二主要原因；据估计它感染超过50%的两岁婴儿和几乎所有五岁的儿童。MPV占住院 的幼儿中呼吸性疾病的大致 5 至 15% (Alto, 2004, The Journal of the American Board of Family Practice/American Board of Family Practice 17:466-469 ;WiIliams et al.，2004, N Engl J Med 350:443-450)。具有MPV的感染是濒临危险的早产儿中的疾病、 早产的慢性肺病、充血性心脏病和免疫缺陷的显著负担（Martino et al.，2005, Biology of Blood and Marrow Transplantation:Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation 11:781-796)。
[0006] MPV和RSV的共感染可以是常见的，假定它们的流行和重叠的冬季疾病流行。虽 然不清楚是否协同的病理学可在这两种病毒之间发生，但是导致特别严重的呼吸道疾病的 恶化在一些MPV和RSV共感染的儿童中观察到（Greensill, 2003, Emerging Infectious Diseases 9:372)。
[0007] RSV-其属于肺病毒属（Pneumoviriniae)亚科肺炎病毒（Pneumovirus)属，以 及MPV-其属于肺病毒属亚科变性肺病毒（Metapneumovirus)属，在它们的基因结构中 具有一些相似性，虽然MPV缺少在RSV中发现的非结构基因 NSl和NS2。RSV和MPV包膜含 有三个病毒编码的跨膜表面糖蛋白：主要附着蛋白G、融合蛋白F和小的疏水SH蛋白。虽 然RSV和MPV包膜含有功能上相似的蛋白，然而，重要的是注意RSV和MPV的F蛋白只共享 33 %的氨基酸序列同一性。另外，针对RSV或MPV产生的抗血清不交叉中和两种病毒（Wyde et al·，2003, Antiviral Research 60:51-59)，并且到目前为止能交叉中和 RSV 和 MPV 的 单克隆抗体没有被分离。
[0008] RSV和MPV F糖蛋白通过病毒粒子包膜和宿主细胞质膜之间的融合来指导病毒穿 入。后来在感染中，细胞表面上表达的F蛋白可用邻近细胞介导融合，形成合胞体（Collins et al.，1984PNAS 81:7683-7687)。在两种情况中，溶蛋白性裂解和含有氨基酸的疏水伸展 的F亚基--称作融合肽--的N-端直接插入靶细胞膜以启动融合。结合到靶细胞和随后 的活化之后，相对稳定的融合前F蛋白经历一系列结构重排，其导致融合肽插入靶细胞膜， 之后是当病毒和细胞膜放在附近时形成的稳定的螺旋束的形成。这些结构变化导致稳定的 融合后F蛋白的形成。
[0009] RSV或MPV感染的疫苗目前得不到。发现20世纪60年代测试的福尔马林灭活 的和铝为佐剂的RSV疫苗（FI-RSV)使婴儿易患导致高热和严重肺炎的自然RSV感染之 后增强的疾病，导致高的住院率和甚至一些死亡率（Fulginiti et al.，1969，American Journal of Epidemiology 89:435-448 ;Kapikian et al., 1969,American Journal of Epidemiology 89:405-421 ;Kim et al. , 1969, American Journal of Epidemiology 89:422-434)。相似地，福尔马林灭活的MPV疫苗显示在年幼的短尾猴中免疫介导的增强的 疾病（de Swart et al.，2007, Vaccine 25:8518-8528)。另外，抗病毒治疗如利巴韦林尚未 被证明在RSV或MPV感染中有效。
[0010] 血清抗体在抵御RSV病毒的保护中的作用的证据已出现自流行病学以及动物 研究。在婴儿中，母亲传递的抗体效价与抵抗严重疾病相关（Glezen et al.，1981，The Journal of Pediatrics 98:708-715)，在成人中，下呼吸道受累的发生率和严重性在存 在高水平的血清RSV中和抗体的情况下减少了（McIntosh et al·，1978, The Journal of Infectious Diseases 138:24-32)。单克隆抗体，帕利珠单抗（Synagis)，被注册用于早产 新生儿中RSV感染的预防。然而，帕利珠单抗在预防RSV感染中不总是有效并且在治疗上 没有效果。另外，在存在帕利珠单抗的情况下动物中RSV延长的肺的复制在抵抗的病毒株 出现之后继起（Zhao 和 Sullender, 2005, Journal of Virology 79:3962-3968)。目前没有 用于MPV感染的治疗或预防的单克隆抗体。
[0011] 缺少针对最严重形式的RSV感染的好的操作动物模型与RSV和MPV是宿主受限的 肺炎病毒病原体这一事实相关。用于RSV和MPV感染治疗的新药的发展已受到缺少能概括 人疾病的所有症状和严重性的动物模型的阻碍。实际上，RSV和MPV不是天然的小鼠病原体 和响应病毒的大量的、非生理学的接种物只引起有限的、最低限度的症状和迅速中止的首 次感染。小鼠肺炎病毒（PVM)是天然的啮齿动物肺炎病毒病原体，其属于人和牛RSV的相 同家族、亚科和属（肺炎病毒）。PVM F蛋白只共享与人RSV F蛋白的40%氨基酸同一性， 但是具有相同的遗传组织，除了 M2-L重叠--其存在于RSV但不存在于PVM。当它发生在 人婴儿中时，天然的小鼠病原体PVM引起的感染复制最严重形式的RSV的体征和症状中的 许多。PVM感染被表征为迅速的病毒复制，伴有大量的炎症应答--其导致呼吸衰竭和死亡 (Rosemberg 和 Domachowske, 2008, Immunology Letter 118:6-12)。小鼠中 PVM 感染因此 被认为是人RSV和MPV严重感染最相关的动物模型。
[0012] 缺少针对MPV感染的预防性治疗和针对RSV和MPV感染的疫苗以及帕利珠单抗 治疗的无效，突出了对于这些显著的人病原体的新的预防和治疗剂的需要。假定大流行 和共感染的可能性，将高度期望具有单个药剂--其能预防以及治疗或减弱RSV和MPV感 染--和具有在其中测试药剂的动物模型。因此，存在对广泛交叉反应的中和抗体的需要， 所述中和抗体保护抵御宽范围的副粘病毒，例如，至少RSV和MPV，和优选RSV、MPV和PVM。
【发明内容】
[0013] 本发明部分基于中和RSV、MPV和PVM感染的广泛中和抗体，以及本发明的抗体结 合的多肽的发现。因此，在本发明的一个方面，本发明包括分离的抗体，例如单克隆抗体、人 抗体、人单克隆抗体、抗体变体或抗原结合片段，其交叉中和RSV、MPV和PVM的感染。
[0014] 在本发明的一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其中和 RSV和MPV的感染。在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其 中和RSV、MPV和PVM的感染。
[0015] 在本发明的另一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特 异地结合RSV融合前F蛋白而不是RSV融合后F蛋白。在再一个实施方式中，本发明包括 分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融合后F 蛋白。在再一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV、 MPV和PVM的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。
[0016] 在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括至少 一个互补决定区（CDR)序列，所述序列与SEQ ID N0:l-6、19-23、35、39-42或53-54中任一 个具有至少95%的序列同一性，其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
[0017] 在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括具有 SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 19 的氨基酸序列的重链CDRl ;具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID N0:39 的氨基酸序列的重链 CDR2;和具有 SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:40或SEQ ID N0:53的氨基酸序列的重链CDR3,其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感 染。在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的轻链CDRl ;具有SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:22或SEQ ID N0:41的氨基 酸序列的轻链 CDR2;和具有 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:42 或 SEQ ID NO: 54的氨基酸序列的轻链CDR3,其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
[0018] 在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体包括：（i)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 中列出的重链 CDR1、CDR2 和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:35中列出的轻链CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列；（ii)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 中列出的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 中列出的 轻链 CDRl、CDR2 和 CDR3 序列；（iii)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO:40 中列出的重链CDRUCDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:42 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（iv)分别在 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40 中列出的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（V)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:42中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述抗体中和 RSV、MPV和PVM的感染。
[0019] 在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体包括：（i)分别在 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21 中列出的重链 CDR1、 CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:22和SEQ ID N0:23中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（ii)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:53 中列 出的重链 CDRUCDR2 和 CDR3 序列，和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:54 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（iii)分别在 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:53中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:22和 SEQ ID N0:23 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；或（iv)分别在 SEQ ID NO: 19、SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:21中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、 SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:54中列出的轻链⑶RU⑶R2和⑶R3序列，并且其中所述抗体 中和RSV、MPV和PVM的感染。
[0020] 在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体包括包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列 的轻链可变区；或包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 14的 氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:49的氨基酸序列的重链可变区和包 含SEQ ID N0:50的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:49的氨基酸序列的重链 可变区和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸 序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:50的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中 和RSV、MPV和PVM的感染。
[0021] 在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体包括包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列 的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的 氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:60的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链可变区和包 含SEQ ID N0:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列的重链 可变区和包含SEQ ID N0:60的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和RSV、MPV 和PVM的感染。
[0022] 本发明进一步包括抗体或其抗原结合片段，其在本文中描述为HMB3210(或 3210);或HMB2430(或2430)。在另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段， 其中和RSV、MPV和PVM的感染，其中所述抗体或其片段由产生HMB3210或HMB2430的无限 增殖化B细胞克隆表达。
[0023] 另一方面，本发明包括核酸分子，其包括编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷 酸。再一方面，本发明包括载体，其包括本发明的核酸分子。本发明还包括表达本发明的抗 体或其抗原结合片段的细胞。又一方面，本发明包括分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括 与本发明的抗体或抗原结合片段结合的表位。
[0024] 本发明进一步包括药物组合物，所述药物组合物包括本发明的抗体或其抗原结合 片段、本发明的核酸分子、包括本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的 细胞或本发明的免疫原性多肽以及药学上可接受的稀释剂或载体。本发明还包括药物组合 物，其包括第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体是 本发明的抗体，而第二抗体是抗体或其抗原结合片段，其中和RSV或MPV、或RSV和MPV、或 RSV、MPV和PVM所有三种的感染。
[0025] 本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、包括本发明的核酸的载体、表达 本发明的载体的细胞、包括与本发明的抗体或抗体片段结合的表位的分离的或纯化的免疫 原性多肽、或本发明的药物组合物（i)在制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV共 感染的药物中，（ii)在疫苗中，或（iii)在RSV和/或MPV病毒感染的诊断中的应用也被 考虑在本发明的范围内。另外，本发明的抗体或其抗原结合片段用于通过检查所述疫苗的 抗原含有处于正确构象的特异表位而监测针对RSV或MPV、或RSV和MPV的疫苗质量的应用 也被考虑在本发明的范围内。
[0026] 另一方面，本发明包括治疗或减弱RSV和MPV感染或降低RSV和MPV感染的危险 的方法，包括给予需要其的对象治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合抗体片段。
[0027] 在另外的方面，本发明包括多肽，其特异地与本发明的抗体或其抗原结合片段结 合，用⑴在治疗中，（ii)在制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV感染的药物中， (iii)作疫苗，或（iv)在筛选能中和RSV或MPV、或RSV和MPV感染的配体中。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1显示筛选由来自7个供体（供体1至7)的EBV-无限增殖化记忆B细胞产生 的单克隆抗体体外中和RSV或MPV病毒感染的能力的结果。
[0029] 图2显示单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和帕利珠单抗中和RSV和MPV的 结果。
[0030] 图3显示单克隆抗体莫托维珠单抗、234mAb、HMB2430和HMB3210与RSV F或破伤 风毒素蛋白的结合，如通过ELISA所测量的。
[0031] 图4显示在存在大量过量的指示的未标记抗体的情况下标记的单克隆抗体与RSV 感染的H印-2细胞的结合。
[0032] 图5显示在还原或非还原条件下单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和莫托维 珠单抗与来自RSV-Hep-2感染的细胞的溶胞产物的RSV F蛋白的结合，如蛋白印迹分析所 测量的。
[0033] 图6显示在还原或非还原条件下单克隆抗体HMB3210和234mAb与来自 MPV-LLC-MK2感染的细胞的溶胞产物的MPV F蛋白的结合，如蛋白印迹分析所测量的。
[0034] 图7显示单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和帕利珠单抗中和RSV长株和 PZ-MARM6隔离群的结果。
[0035] 图8显示在存在（+)或缺少（-)N-糖苷酶PNG-ase F的情况下温育之后还原的 SDS-PAGE凝胶上HMB3210v2的分析结果。用黑框突出显示的是被糖基化的HMB3210轻链的 小的部分。
[0036] 图 9 显示单克隆抗体 HMB3210v2 和 HMB3210v3 中和 MPV I-PV 03/01-6621 和 RSV A2的结果。
[0037] 图10显示单克隆抗体HMB3210v2和HMB3210v3中和一组MPV和RSV株的结果。
[0038] 图11显示HMB3210和HMB2430单克隆抗体种系化的变体中和MPV I-PV 03/01-6621 和 RSV A2 的结果。
[0039] 图12显示与HMB3210或帕利珠单抗共同温育或不与其共同温育的RSV F融合后 重组蛋白的尺寸排阻层析分析的结果。
[0040] 图13显示与HMB3210或帕利珠单抗共同温育或不与其共同温育的RSV F融合前 重组蛋白的尺寸排阻层析分析的结果。
[0041] 图14显示HMB3210V3或帕利珠单抗（PVZ)与融合前和融合后RSV F蛋白的结合， 如通过表面等离子体共振（SPR)所测量的。
[0042] 图15显示人单克隆抗体HMB3210v3和D25的病毒中和和病毒播散的抑制。
[0043] 图16显示RSV或MPV感染中HMB3210v3和帕利珠单抗的预防效力。
[0044] 图17显示用RSV感染的STATl缺陷小鼠中HMB3210的治疗效力。
[0045] 图18显示用致死剂量的PVM感染的小鼠中HMB3210的预防和治疗效力。
[0046] 图19显示在用PVM致死感染之后第3、4或5天用HMB3210v3处理的小鼠中肺病 毒滴度增加的阻断。
[0047] 图20显示在用致死剂量的PVM感染的小鼠中带有野生型Fc或LALA突变的 HMB3210v3变体的预防和治疗效力。
[0048] 图21显示突出显示与副流感病毒5(PIV5)相比RSV、BRSV、PVM和MPV序列中 HMB3210识别的YLSALR肽的高度保守的比对。
[0049] 图22显示融合前RSV F蛋白的模型，其显示YLSALR肽和邻近的帕利珠单抗（PVZ) 位点的位置和突出显示RSV F蛋白的融合前和融合后构象中PVZ和HMB3210v3位点重排的 带图。
[0050] 图23显示364RSV、162MPV、8BRSV和5PVM株中HMB3210核心表位的高度保守。
[0051] 图24显示多种HMB3210重链和轻链变体的序列。
[0052] 图25显示多种HMB2430重链和轻链变体的序列。
【具体实施方式】
[0053] 本发明部分基于交叉中和RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM的抗体以及本发明的抗 体结合的表位的发现和分离。这样的抗体是期望的，因为只需要一个或很少的抗体来中和 RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM。另外，交叉中和抗体以高滴度产生，从而减少生产包括用于 治疗RSV和/或MPV感染的抗体的药物的成本。此外，这样的抗体识别的表位可以是能引 起针对RSV和MPV的宽的保护的疫苗的部分。
[0054] 虽然本发明的抗体中和RSV、MPV和PVM，但是在本发明的一些实施方式中，例如与 疾病治疗、疫苗开发等相关的那些，目前的公开内容只涉及RSV和MPV，因为这些病毒是人 病原体，而PVM是小鼠病原体。如本文所用，术语"RSV和MPV"和"RSV、MPV和PVM"基于上 下文可互换地使用。
[0055] 因此，一方面，本发明提供分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段，其中和RSV 和MPV、或RSV、MPV和PVM。在一个实施方式中，RSV是人RSV。在另一个实施方式中，RSV 是牛RSV。本发明的抗体中和人RSV(hRSV)和牛RSV(bRSV)。在另一个实施方式中，MPV是 人 MPV。
[0056] 在一个实施方式中，本发明还提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中和A群和B 群RSV的感染。在另一个实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中和A 群和B群MPV的感染。在再一个实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其 中和A群和B群RSV以及A群和B群MPV的感染。
[0057] 如更早所讨论的，RSV、MPV和PVM的基因结构具有一些相似性。RSV和MPV中的G 和F蛋白的氨基酸序列被分成A和B群；MPV进一步分成4个亚群：A1、A2、Bl和B2。PVM 没有再分成群或亚群。RSV、MPV或PVM F蛋白是I型跨膜表面蛋白，其具有N-端分裂的信 号肽和C-端附近的膜锚着点。RSV和MPV F蛋白被合成为无活性的R)前体，其装配成同型 三聚体和通过分裂来活化。F蛋白由三个结构域（DI至Dili)、融合肽（FP)和三个七价重 复区（HR-A、-B和-C)形成。RSV和MPVF糖蛋白通过病毒粒子包膜和宿主细胞质膜之间的 融合来指导病毒穿入。在两种情况中，F亚基的N-端--其通过溶蛋白性裂解而产生并含 有融合肽--直接插入靶膜以启动融合。与靶细胞结合和随后的活化之后，相对稳定的融 合前F蛋白经历一系列结构重排，其导致融合肽插入靶细胞膜，之后形成稳定的螺旋束-- 当病毒和细胞膜放在附近时螺旋束形成。这些结构改变导致稳定的融合后F蛋白的形成。 后来在感染中，感染的细胞表面上表达的F蛋白可介导与邻近非感染的细胞的融合，形成 大的合胞体。
[0058] 帕利珠单抗和莫托维珠单抗的表位已被绘制在残基255-275形成的融合后RSV F 蛋白抗原位点II (也称作A位点）上。MAB19和IOlF靶向残基422-438形成的RSV的融 合后RSV F蛋白抗原位点IV (也称作C位点）。MAB19在临床试验中被测试，但是没有显示 显著的效力（Johnson et al.，l"9, The Journal of Infectious Diseases 18〇:35_4〇; Meissner et al. , 1999, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:1183-1188)。
[0059] 为了有效，抗体应识别融合前F蛋白--其是阻断病毒进入的有关构造，并优选避 免大量可充当诱饵的融合后F蛋白的识别，因此消耗抗体和减少其效力。到目前为止识别 RSV融合前而不是RSV融合后F蛋白的抗体尚未被分离。
[0060] 在本发明的一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异 地结合RSV融合前F蛋白而不是RSV融合后F蛋白。在另一个实施方式中，本发明包括分 离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融合后F蛋 白。在另一个实施方式中，本发明提供抗体，其特异地结合到RSV、MPV和PVM的融合前F蛋 白而不是融合后F蛋白。
[0061] 本发明提供抗体，其与RSV、MPV和PVM的F蛋白结合。尽管RSV和MPV、或RSV和 PVM F蛋白之间分别只有大约33%和40%的氨基酸序列同一性的事实，但是本发明的抗体 识别存在于RSV、MPV和PVM F蛋白上的共享表位。该表位不同于迄今已知的抗体如帕利珠 单抗、莫托维珠单抗、mAb 101F等识别的所有那些表位。本发明的抗体不，例如，结合抗原 位点II (莫托维珠单抗和帕利珠单抗所识别的）、抗原位点IV(mAb 101F所识别的），也不 结合抗原位点UmAb 131-2A所结合的）。本发明的抗体识别的RSV F蛋白上的表位也不 同于mAb D25--只对RSV特异的抗体--识别的表位。此外，本发明的抗体识别的MPV F 蛋白上的表位不同于mAb 234 (其识别MPV F蛋白上的表位，其对应RSV F蛋白上的抗原位 点II)识别的表位。一般而言，本发明的抗体识别构象表位。在一个实施方式中，构象表位 只在非还原条件下存在。在另一个实施方式中，构象表位依赖F蛋白上氨基酸残基之间二 硫键的存在。
[0062] 如本文所示，本发明的抗体或抗原结合片段特异地与RSV和MPV的几个不同株结 合并中和RSV和MPV。另外，本发明的抗体或抗原结合片段特异地结合并交叉中和A群和B 群RSV以及A群和B群MPV，包括所有相应的MPV亚群（即Al、A2、Bl和B2)。
[0063] 本发明的抗体和抗原结合片段具有高的中和能力。RSV、MPV和PVM的50%中和 需要的本发明的抗体的浓度是，例如，约500ng/ml或更少。在一个实施方式中，RSV、MPV 和PVM的50%中和需要的本发明的抗体的浓度是约500、450、400、350、300、250、200、175、 150、125、100、90、80、70、60或约5〇1^/1111或更少。这意味着1?￥、]\0^和？￥]\1的50%中和 所需要的只是低的抗体浓度。特异性和能力可利用如本领域技术人员所知的标准检测来测 量。
[0064] 本发明的抗体可以是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、重组抗体或纯化的抗 体。本发明还提供本发明的抗体的片段，特别是保留抗体的抗原结合活性的片段。这样的 片段包括，但不限于，单链抗体、Fab、Fab'、F (ab'）2、Fv或scFv。虽然说明书，包括权利要 求书，在一些地方可能明确地指抗原结合片段（或多个）、抗体片段（或多个）、抗体的变体 (或多个）和/或衍生物（或多个），但是应当理解术语"抗体"或"本发明的抗体"包括所 有类型的抗体，即，抗原结合片段（或多个）、抗体片段（或多个）、抗体的变体（或多个） 和衍生物（或多个）。
[0065] 已确定了本发明的几种抗体的重链和轻链的序列，每个包括重链上的三个⑶R和 轻链上的三个⑶R。⑶R氨基酸的位置根据MGT编号系统确定。⑶R、重链、轻链的序列以及 编码本发明的抗体的CDR、重链、轻链的核酸分子的序列公开在序列表中。抗体重链的CDR 分别称作CDRHl (或HCDR1)、CDRH2 (或HCDR2)和CDRH3 (或HCDR3)。相似地，抗体轻链的 CDR分别称作CDRLl (或LCDR1)、CDRL2 (或LCDR2)和CDRL3 (或LCDR3)。表1分别提供本 发明的示例性抗体的重链和轻链的六个CDR的氨基酸序列的SEQ ID编号。
[0066] 表L中和RSV、MPV和PVM的抗体的CDR多肽的SEQ ID编号。
【权利要求】
1. 分离的抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染。
2. 分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融 合后F蛋白。
3. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段中和 A群和B群RSV以及A群和B群MPV的感染。
4. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段中和 MPV亚群A1、A2、B1和B2的感染。
5. 权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段中和RSV、 MPV和PVM的感染。
6. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不在 重叠抗原位点I、抗原位点II或抗原位点IV的位点结合RSV的所述F蛋白。
7. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合 包括SEQ ID NO :64-69中任一个所示的氨基酸序列的RSV、MPV或PVM的F蛋白的氨基端部 分上的保守区。
8. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中RSV、MPV或PVM的50%中和需 要的所述抗体或片段的浓度是500ng/ml或更少。
9. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括至少一个与SEQ ID NO: 1-6、19-23、 35、39-42或53-54中任一个具有至少95%的序列同一性的互补决定区（⑶R)序列。
10. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 19 的氨基酸序列的重链CDR1 ;具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 39的氨基酸序 列的重链 CDR2;和具有 SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:40 或 SEQ ID N0:53 的氨 基酸序列的重链⑶R3。
11. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的 轻链CDR1 ;具有SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:22或SEQ ID N0:41的氨基酸序列的轻链CDR2 ; 和具有 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42 或 SEQ ID NO:54 的氨 基酸序列的轻链⑶R3。
12. 权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，包括包含以下氨基酸序列的重 链：针对〇)冊1的3￡0 10勵：1、针对〇)冊2的5￡0 10勵:2和针对〇)冊3的5￡0 10勵:3;针对 CDRH1 的 SEQ ID NO: 1、针对 CDRH2 的 SEQ ID N0:39 和针对 CDRH3 的 SEQ ID N0:40 ; 针对 CDRH1 的 SEQ ID NO: 19、针对 CDRH2 的 SEQ ID N020 ;和针对 CDRH3 的 SEQ ID N0:21 ; 或针对〇)冊1的5￡0 10勵：1、针对〇)冊2的5￡0 10勵:39和针对〇)冊3的5￡0 10勵:53。
13. 权利要求10、11或12所述的抗体或其抗原结合片段，包括包含以下氨基酸序列 的轻链：针对〇)虬1的5￡0 10勵:4、针对〇)此2的5￡0 10勵:5和针对〇)虬3的5￡0 10 勵:35;针对〇)虬1的5￡0 10勵:4、针对〇)虬2的5￡0 10勵:5和针对〇)虬3的5￡0 10 勵:6;针对〇)虬1的5￡0 10勵:4、针对〇)虬2的5￡0 10勵:41和针对〇)虬3的5￡0 10 勵:42;针对〇)虬1的5￡0 10勵:4、针对〇)虬2的5￡0 10勵:22和针对〇)虬3的5￡0 10 勵:23;或针对〇)虬1的5￡0 10勵:4、针对〇)虬2的5￡0 10勵:41和针对〇)虬3的5￡0 10 NO:54。
14. 分离的抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染，包括⑴分别在SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID勵:3中列出的重链0?1、0)1?2和0)1?3序列，和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:35 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（ii) 分别在 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:3 中列出的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列， 和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序 列；（iii)分别在 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40 中列出的重链 CDR1、CDR2 和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:42中列出的轻链CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列；（iv)分别在 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:39 和 SEQ ID N0:40 中列出的重 链001?1、〇)1?2和〇)1?3序列，和分别在5￡0 10冊:4、5￡0 10勵:5和5￡0 10勵:6中列出的 轻链0?1、0)1?2和0)1?3序列；（￥)分别在5￡〇10勵：1、5￡〇10勵:2和5￡〇10勵:3中列 出的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，和分别在 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:42 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（vi)分别在 SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20 和 SEQ ID N0:21中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:22和 5￡0 10勵:23中列出的轻链001?1、〇)1?2和〇)1?3序列；卜11)分别在5￡0 10勵：1、5￡0 10 N0:39和SEQ ID N0:53中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:54 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；（viii)分别在 SEQ ID 勵：1、5￡〇10勵:39和5￡〇10勵:53中列出的重链0?1、0)1?2和0)1?3序列，和分别在5￡〇 ID N0:4、SEQ ID N0:22 和 SEQ ID N0:23 中列出的轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；或（ix) 分别在 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21 中列出的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，和分别在SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:41和SEQ ID N0:54中列出的轻链CDR1、CDR2和 CDR3序列。
15. 权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重 链可变区与SEQ ID勵：13、17、29、33、49或51中任一个的氨基酸序列具有至少80%的序 列同一,I"生。
16. 权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区，所述轻 链可变区与SEQ ID勵：14、30、37、50或60的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性。
17. 抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的重 链可变区和包含SEQ ID N0:37的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:13的氨基酸 序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO: 17 的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:50的氨基酸序列的轻链可变区；或 包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链 可变区；或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸 序列的轻链可变区；包含SEQ ID N0:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:30 的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链可变区 和包含SEQ ID N0:60的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:59的氨基酸序列的 重链可变区和包含SEQ ID N0:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID N0:33的氨 基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:60的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述抗体或 抗原结合片段中和RSV、MPV和PVM的感染。
18. 在前权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是HMB3210 变体 3、HMB3210 变体 1、HMB3210 变体 2、HMB3210 变体 4、HMB3210 变体 5、HMB3210 变体 6、 HMB2430 变体 1、HMB2430 变体 2、HMB2430 变体 3、HMB2430 变体 4 或 HMB2430 变体 5。
19. 在前权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体、单 克隆抗体、人单克隆抗体、纯化的抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv。
20. 抗体或其抗原结合片段，其结合与前权利要求任一项所述的抗体相同的表位，其中 所述抗体或其抗原结合片段中和RSV和MPV的感染。
21. 在前权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或减弱RSV或 MPV，或RSV和MPV的感染。
22. 核酸分子，其包括编码前权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷 酸。
23. 权利要求22所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:7-12、15、16、 18、24-28、31-32、34、36、38、43-48、51-52、55-58或61-62中任一个的核酸序列至少75%相 同。
24. 载体，其包括权利要求22或23所述的核酸分子。
25. 细胞，其表达权利要求1-21任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或包括权利要 求24所述的载体。
26. 分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括结合权利要求1-21中任一项所述的抗体或 其抗原结合片段的表位。
27. 药物组合物，其包括权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利 要求22或权利要求23所述的核酸分子、权利要求24所述的载体、权利要求25所述的细胞、 或权利要求26所述的免疫原性多肽，以及药学上可接受的稀释剂或载体。
28. 药物组合物，其包括第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段， 其中所述第一抗体是权利要求1-21中任一项所述的抗体，并且所述第二抗体中和RSV或 MPV，或RSV和MPV的感染。
29. 权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求22或权利要求 23所述的核酸、权利要求24所述的载体、权利要求25所述的细胞、权利要求26所述的免疫 原性多肽、或权利要求27或权利要求28所述的药物组合物（i)在制备用于治疗或减弱RSV 或MPV、或RSV和MPV的感染的药物中，（ii)在疫苗中，或（iii)在RSV或MPV感染的诊断 中的应用。
30. 权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于通过检查所述疫苗的 抗原含有处于正确构象的特异表位而监测抗RSV或抗MPV疫苗的质量的应用。
31. 减少RSV或MPV感染、或降低RSV或MPV感染的危险的方法，其包括：给需要其的 对象施用治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
32. 分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括特异地结合权利要求1-21中任一项所述的 抗体或其抗原结合片段的表位，用（i)在治疗中，（ii)在用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV 和MPV感染的药物制备中，（iii)作疫苗，或（iv)在筛选能中和RSV或MPV、或RSV和MPV 感染的配体中。
【文档编号】A61P31/14GK104350069SQ201380026218
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年3月20日
【发明者】D·柯蒂 申请人:胡默波斯生物医学公司, D·柯蒂