抗神经变性的益生菌和多酚的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含与多酚组合的益生菌菌株约氏乳杆菌CNCM I-1225的组合物，其用于治疗或预防认知和/或神经变性病症、特别是阿尔茨海默病。CNCM I-122519920630
【专利说明】抗神经变性的益生菌和多酚
[0001] 本发明涉及包含与多酚组合的益生菌菌株约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii)CNCM 1-1225的组合物，其用于治疗或预防认知和/或神经变性病症、特别是阿 尔茨海默病。
[0002] 在几乎每个国家，年龄超过60岁的人群比例增长得比任何其它组都快，其至少部 分归因于较长的预期寿命。这种人口老龄化可因此被视为一个健康意识增加以及公共医疗 卫生的可用性和性能改善的成功故事。根据WHO,目前世界上超过60岁的人口为6. 50亿。 2050之前，"头发花白（greying) "人口预计达到20亿。
[0003] 然而，老龄化增加患上某些疾病的风险，并且让人口以身体健康的方式老龄化今 天仍然是我们社会的目标。生活质量的中心，特别是对于老龄化人口，是正确的认知性能及 其维持。
[0004] 最常见的精神障碍影响认知功能，主要是记忆处理、感知和解决问题。最直接的认 知障碍是健忘症、痴呆和谵妄。阿尔茨海默病（AD)是最常见的痴呆形式。这种目前不能治 愈的、退行性的绝症首先由Alois Alzheimer于1906年描述。一般在超过65岁的人中诊 断出阿尔茨海默病，尽管较少见的早发型阿尔茨海默病可出现得更早。在2006年估计全世 界有2660万人患有阿尔茨海默病；这个数字将在2050年之前翻两番。
[0005] 数种年龄相关的病症可通过适当营养来治疗或预防。然而，关于认知障碍，对可用 来防止它们发生的营养措施了解甚少。因此，自从淀粉样蛋白斑块形成已被鉴定为一种有 助于阿尔茨海默病中认知衰退进展的可能因子，鉴定对抗淀粉样蛋白斑块形成具有活性的 天然化合物已成为科研目的。
[0006] 例如WO 2006/138349公开了存在于迷迭香和鼠尾草中的天然化合物展现出有效 的抗_ 0 A肽活性。此外，来自红酒的白藜芦醇（reservatrol)、绿茶儿茶素和姜黄提取物姜 黄素用于AD的潜在疾病预防或治疗已受到特别关注。
[0007] 然而，仍对发现可用于获得正确的认知功能、以及治疗或预防认知和/或神经变 性病症的新的更好的组合物存在巨大需求。
[0008] 因此，本发明的目的是改进技术发展水平，特别是提供可用于保持认知功能以及 预防认知和/或神经变性病症的组合物。
[0009] 令人惊讶的是，发明人发现他们可通过独立权利要求的主题实现这个目的。
[0010] AD患者展示形成老年斑。老年斑是主要由￠-淀粉样蛋白（0A)的不溶性聚集体 组成的胞外沉积物。这些斑块或ea原纤维沉积物据信负责许多神经变性疾病（包括但不 限于阿尔茨海默病）的病理学。它们还涉及脑淀粉样血管病、神经元丧失和导致痴呆的脑 萎缩。所有这些病症可通过使用本发明来治疗和/或预防。
[0011] 发明人已进行两种不同测定来测试分子沿着Ae 42的淀粉样蛋白形成途径靶向 不同状态的能力。发明人发现，与多酚组合的益生菌菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225 (Lal)能 够以协同方式预防和/或抑制A0低聚化和/或原纤维生成，并且因此已鉴定与多酚组合 的约氏乳杆菌CNCM 1-1225 (Lal)为可抑制、延迟和/或逆转例如AD相关神经病理学、记忆 丧失和/或认知衰退的食品级组合物。
[0012] 图1示出所进行测定的示意图。
[0013] 图2示出在测定I(LMW)中和在测定2(PF)中的ThT荧光测量的结果。测试品为 商购可得的迷迭香萃取物（NPl)和与约氏乳杆菌CNCMI-1225 (Lal)组合的商购可得的迷迭 香萃取物（NP2)。清楚地，Lal能够增强迷迭香萃取物的作用。
[0014] 图3示出在测定I(LMW)中和在测定2(PF)中的ThT荧光测量的结果。测试品为 菊苣酸（NP5)和与Lal组合的菊苣酸（NP6)。清楚地，Lal能够增强菊苣酸的作用。
[0015] 图4示出在测定I(LMW)中和在测定2(PF)中的ThT荧光测量的结果。测试品为 咖啡酰酒石酸（caftaric acid) (NP7)和与Lal组合的咖啡酰酒石酸（MP8)。清楚地，Lal 能够增强咖啡酰酒石酸的作用。
[0016] 图5示出在测定I(LMW)中和在测定2(PF)中的ThT荧光测量的结果。测试品为 不同浓度的Lai。单独的Lal未显示作用。
[0017] 本发明提供包含与多酚组合的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的组合物，其用于治疗或 预防认知和/或神经变性病症、特别是与脑中蛋白质聚集有关的病症。
[0018] 发明人已发现，益生菌例如约氏乳杆菌CNCM I-1225(Lal)可用于治疗或预防例如 与蛋白质聚集如淀粉样蛋白斑块形成有关的所有病症。与蛋白质聚集有关的病症列表由 Selkoe DJ.，Nature. 2003 年 12 月 18 日；426 (6968) : 900-4.综述；于 Nature. 2004 年 3 月 25 日；428 (6981) :445 中勘误。
[0019] 与蛋白质聚集有关的病症包括下列：
[0020] 系统性胞外淀粉样变性，如原发性系统性淀粉样变性、继发性系统性淀粉样变性、 家族性地中海发热、家族性淀粉样变性多神经病变1、老年性系统性淀粉样变性、家族性淀 粉样变性多神经病变2、血液透析相关淀粉样变性、芬兰遗传性淀粉样变性、溶菌酶淀粉样 变性、胰岛素相关淀粉样蛋白、和/或纤维蛋白原a _链淀粉样变性；
[0021] 器官局限性胞外淀粉样变性，如阿尔茨海默病、海绵状脑病、具有淀粉样变性的遗 传性脑出血、II型糖尿病、甲状腺髓样癌、和/或心房淀粉样变性；
[0022] 特征在于进行性蛋白质错折叠和聚集的人脑疾病，如阿尔茨海默病、具有路易 氏小体的额颞叶痴呆、克雅氏疾病、多聚谷氨酰胺扩增疾病（polyglutamine expansion disease)(例如亨廷顿氏疾病脊髓小脑共济失调）、和/或肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
[0023] 例如，可通过使用本发明进行治疗或预防的认知病症可选自神经变性病症、认知 衰退及其组合。在这点上，典型的神经变性病症是阿尔茨海默病、克雅氏病、亨廷顿氏病和 帕金森病。
[0024] 此外，在AD、痴呆和/或认知损害中通常观察到的病症可通过使用本发明来治疗。 此类病症包括例如睡眠障碍、心境障碍和/或抑郁症。
[0025] 多酚可选自下组：3-(3' -甲氧基-4'羟基苯基）丙烯酸4 " _(3' 〃-甲氧 基-4'"-羟基苯基）-2"-氧代-3"-烯丁酯（calebin-A)、l，7-双（4-羟基-3-甲氧基 苯基）-1，4, 6-庚三烯-3-酮、1，7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1，6-庚二烯-3, 5-二酮 (姜黄素）、1- (4-羟基-3-甲氧基苯基）-7- (4-羟基苯基）-1，6-庚二烯-3, 5-二酮（去甲 氧基姜黄素）、1，7-双（4-羟基苯基）-1，6-庚二烯-3, 5-二酮（双去甲氧基姜黄素）、1-羟 基-1，7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-6-庚烯-3, 5-二酮、1，7-双（4-羟基苯基）-1-庚 烯-3, 5-二酮、1，7-双（4-羟基苯基）-1，4, 6-庚三烯-3-酮、1，5-双（4-羟基-3-甲氧基 苯基）_1，4-戊二烯-3-酮、2-姜烯酚、4-姜烯酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、2-姜醇、4-姜醇、 6-姜醇、8-姜醇、银杏酷酸、迷迭香酷（rosmanol)、异迷迭香酷、迷迭香双醛（rosmadial)、 鼠尾草酚、鼠尾草酸（carnosic acid)、表迷迭香酚、迷迭香酸、咖啡酰酒石酸、菊苣酸、白藜 芦醇、和/或儿茶素。
[0026] 然而，在本发明的一个优选实施方案中，多酚选自迷迭香酸、咖啡酰酒石酸和菊苣 酸、或其组合。
[0027] 由于这些多酚均是植物中天然存在的化合物，它们可以例如作为植物或呈植物提 取物提供。可用于提供多酷的典型植物可以是例如姜黄属（Curcuma sp.)、姜属（Zingiber sp.)、银杏科（Ginkgo biloba)、鼠尾草属（Salvia sp.)、迷迭香属（Rosmarinus sp.)、或其 组合。
[0028] 在一个优选的实施方案中，提供了呈迷迭香萃取物形式的迷迭香酸。
[0029] 在替代实施方案中，提供了呈药学上可接受的盐形式的多酚。
[0030] 约氏乳杆菌菌株Lal由Nestec S. A?根据布达佩斯条约（Budapest Treaty)于 1992年6月30日保藏在法国国立微生物保藏中心（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM), Institut Pasteur, 25rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedex 15, France，其归属于保藏号CNCM 1-1225。该菌株于EP 0577904中描述并且在此期 间由于细菌分类学的变化已被重新分类为约氏乳杆菌。
[0031] 本发明涉及组合物，其中约氏乳杆菌CNCM 1-1225呈活细菌、非复制性细菌的形式 和/或作为细菌培养所处的培养基或培养基的部分。因此，在本发明的一个实施方案中，益 生菌用作活微生物。在本发明的另一个实施方案中，益生菌用作非复制性微生物。例如，至 少95%存在于组合物中的益生菌可以是非复制性的。在本发明的又一个实施方案中，提供 了作为培养基提取物的益生菌，所述提取物含有由在该培养基中培养的约氏乳杆菌生成的 代谢物的至少一部分。然后，约氏乳杆菌自身可在施用组合物之前被除去。因此，如果约 氏乳杆菌与多酚一起使用，则多酚可与乳杆菌属在允许乳杆菌属为代谢活性的培养基中组 合。然后，当制备本发明中描述的组合物时可从培养基去除约氏乳杆菌。
[0032] 在治疗性应用中，组合物以足以至少部分治愈或阻止病症和/或其并发症的症状 的量施用。足以完成这个的量被定义为"治疗有效剂量"。对于此目的有效的量将取决于本 领域技术人员已知的许多因素，如病症的严重性以及患者的重量和一般状况。在预防性应 用中，将根据本发明的组合物以足以至少部分减少患上病症风险的量施用至易受特定病症 影响或处于特定病症风险的患者。这种量被定义为"预防性有效剂量"。此外，准确量取决 于许多患者具体因素如患者的健康状态和重量。
[0033] 因此，约氏乳杆菌CNCM 1-1225以治疗有效剂量和/或以预防性有效剂量施用。通 常，约氏乳杆菌CNCM 1-1225可以以相当于IO2至10 ncfU/g组合物干质量之间的量存在于 组合物中。这种表述包括细菌为活的、灭活的或死的或甚至以片段如DNA或细胞壁材料形 式存在的可能性。换句话说，依据所述量细菌的集落形成能力表达组合物所含的细菌的量， 犹如所有细菌为活的，不管它们是否实际上为活的、灭活的或死的、片段的或者任何或所有 这些状态的混合物。优选约氏乳杆菌CNCM 1-1225以相当于IO3至10 9cfu/g组合物干质量 之间的量、甚至更优选以相当于IO4至10 8cfu/g干组合物之间的量存在。
[0034] 同样地，多酚以治疗有效剂量和/或以预防性有效剂量施用。通常，多酚以范围为 I - lOOmg/g组合物干质量的量存在于组合物中。
[0035] 在另一个实施方案中，约氏乳杆菌CNCM 1-1225为封囊的。在又一个实施方案中， 与多酚组合的约氏乳杆菌CNCM 1-1225为封囊的。封囊技术为本领域熟知且可在此处应用 于约氏乳杆菌自身或整个本发明组合物。条件为，一旦由需要其的患者或个体摄取，封囊就 释放其封闭的物质。
[0036] 可将本发明中所述的组合物施用至宠物以及农场动物例如奶牛以防止它们患上 淀粉样蛋白斑块相关病症，如克雅氏病。
[0037] 在另一个实施方案中，要将组合物施用至人。处于患上淀粉样蛋白斑块相关病症 的症状风险的人通常大于60岁。因此，在本发明的一个实施方案中，要将组合物施用至大 于60岁的人。然而，考虑到本发明中所述的组合物还可用于预防认知障碍的事实以及进一 步考虑到同时已知淀粉样蛋白斑块形成可以在淀粉样蛋白斑块相关疾病的第一症状变得 明显之前开始较长时间，本发明的更优选的实施方案是要将组合物施用至大于50岁、甚至 更优选大于40岁的人。
[0038] 本发明中所述的组合物可以呈食品、动物食品、药物组合物、营养制剂、保健品、 饮料、食品补充剂或食品添加剂的形式。因此，其可例如还包含蛋白质源、脂质源、和/ 或碳水化合物源。例如，如果组合物为营养配方时，其可以包含所有三种主要营养成分 (macro-nutrient)。优选组合物呈适用于口服或肠内施用的形式。
[0039] 如果提供了呈干燥形式例如作为粉末的组合物，则可能需要提供呈实现较长贮藏 时间的形式的组合物。发现，可以获得货架稳定性，例如通过提供水分活度小于〇. 2,例如 0. 19-0. 05范围，优选小于0. 15的组合物。这种低水分活度例如将实现活乳杆菌属微生物 将保持活力较长时间段。水分活度或awS系统中水的能量状态的量度。这被定义为水的 蒸汽压除以在相同温度下纯水的蒸汽压；因此，纯蒸馏水的水分活度恰好为1。
[0040] 本发明的组合物还可进一步包含至少一种益生元，例如以0. 3至IOwt %的量。"益 生元"意指促进益生菌在肠内生长的食物。它们未在摄取它们的人的胃和/或上肠道中 分解或未在GI道中吸收，但是它们由胃肠微生物丛和/或由益生菌发酵。益生元例如由 Glenn R. Gibson 和 Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995125 :1401-1412 定 义。益生元的实例包括某些低聚糖，如低聚果糖（FOS)和半乳低聚糖（GOS)。可以使用益生 元的组合，如90 % GOS和1〇 %短链低聚果糖，如以商标Raftilose?'销售的产品，或1〇 %菊 粉，如以商标Raftiline?销售的产品。
[0041] 本领域技术人员应理解，它们可自由地组合本文公开的本发明的所有特征。本发 明的其它优势和特征由附图和实施例明显可见。
[0042] 实施例1 :
[0043] 本研宄目标是鉴定可抑制、延迟和/或逆转AD相关神经病理学、记忆丧失和认知 衰退的生物活性组分。为实现这一目标，鉴定了可在牵涉例如阿尔茨海默病的发病机理的 淀粉样蛋白级联上扰乱单独步骤的生物活性化合物。
[0044] 更具体地，鉴定了可用于预防和/或抑制A 0低聚化和/或原纤维生成的化合物。 进行了两种不同测定。
[0045] 测定1 :靶向单体A 0测定（时帧24-48小时）（参见图1，1)):
[0046] 在该测定中，以经尺寸排阻纯化的单体A 0 42 (LMW)开始。将其与所考察的化合物 (C) 一起在37°C温育。然后通过硫磺素（Thioflavin)T(ThT)荧光在24和48小时评估聚 集的程度。ThT是在结合于淀粉样原纤维时展现出增强荧光的疏水性染料。ThT尤其结合 于淀粉样原纤维，而不是A 0的单体形式。在该测定中ThT荧光的减少或缺乏指示所测试 的分子降低和/或阻断了淀粉样原纤维的形成。然而，很难单独从这种测定推断，化合物沿 着淀粉样蛋白形成途径在哪一点起作用，即干扰单体向初原纤维转变或阻断初原纤维向原 纤维转变。
[0047] 测定2 :靶向初原纤维A 0测定（时帧24-48小时）（参见图1，2)):
[0048] 在该测定中，以经尺寸排阻纯化的A042初原纤维混合物（PF)开始。将其与所考 察的化合物（C) 一起在37°C温育。然后通过硫磺素 T(ThT)荧光在24和48小时评估聚集 的程度。初原纤维的ThT荧光信号增加的减少或缺乏指示所测试的分子降低和/或阻断 了淀粉样原纤维的形成。这可能经由至少两种机制发生；i)阻断初原纤维至原纤维转变或 ii)诱导初原纤维的解离/解聚。初原纤维的ThT信号的减少表明初原纤维的解离正在发 生，而ThT信号未改变则表明通过稳定初原纤维来抑制原纤维形成。
[0049] A0 42LMW和PF以10 yM的最终浓度使用，并且单独地或与化合物以1:0. 5或1:2 的比率一起温育。
[0050] 对下列化合物进行测试：
[0051] NPl :迷迭香萃取物
[0052] NP2 :迷迭香萃取物+Lal
[0053] NP5 :菊苣酸
[0054] NP6 :菊苣酸 +Lal
[0055] NP7 :咖啡酰酒石酸
[0056] NP8 :咖啡酰酒石酸+Lal
[0057] NP27 ：LallOmg/ml
[0058] NP28 ：Lal90mg/ml
[0059] NP29 ：Lal60mg/ml
[0060] 它们如下制备：
[0061] NPl :将IOmg来自Robertet (法国）的迷迭香萃取物（Robertet P31)溶解于Iml 磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.0)中，将混合物在37°C温育6h (恒温混匀仪）
[0062] NP2 :将IOmg来自Robertet (法国）的迷迭香萃取物（Robertet P31)溶解于Iml 磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.0)中。向该溶液加入IOmg经喷雾干燥的Lal制剂，将混合物在 37°C温育6h (恒温混匀仪）。通过离心（3000g，5min)除去细胞，对上清液进行测试。
[0063] NP5 :将于磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)中的菊苣酸（10mM，通过有机合成内部生成）在 37°C温育 24h。
[0064] NP6 :向于磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)中的菊苣酸（10mM，通过有机合成内部生成）加 入60mg经喷雾干燥的Lal制剂。然后将混合物在37°C温育24h (恒温混匀仪）。通过离心 (3000g，5min)除去细胞，对上清液进行测试。
[0065] NP7 :将于磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)中的咖啡酰酒石酸（10mM，通过有机合成内部生 成）在37°C温育24h。
[0066] NP8 :向于磷酸盐缓冲液（pH 7. 0)中的咖啡酰酒石酸（10mM，通过有机合成内部生 成）加入90mg经喷雾干燥的Lal制剂。然后将混合物在37°C温育24h (恒温混匀仪）。通 过离心（3000g，5min)除去细胞，对上清液进行测试。
[0067] NP27、NP28和NP29 :将10mg、90mg或60mg经喷雾干燥的Lal制剂溶解于Iml磷酸 盐缓冲液（10mM，pH 7. 0)中，在37°C温育24h (恒温混匀仪）。通过离心（3000g，5min)除 去细胞，对上清液进行测试。
[0068] 结果示于图2-5以及表1和2中。
[0069] 表 1 :
[0070] NPl :迷迭香萃取物
[0071] NP2 :迷迭香萃取物+Lal
[0072] LMW (化合物相较于不含化合物的对照的作用）-信号强度
【权利要求】
1. 包含与多酚组合的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的组合物，用于治疗或预防认知和/或 神经变性病症。
2. 权利要求1的组合物，其中所述病症与脑中蛋白质聚集有关。
3. 权利要求1或2的组合物，其中所述病症选自阿尔茨海默病、克雅氏病、亨廷顿氏病 和帕金森病。
4. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述多酚选自迷迭香酸、菊苣酸和咖啡酰酒 石酸或其组合。
5. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述多酚以植物提取物形式提供。
6. 权利要求5的组合物，其中所述迷迭香酸以迷迭香萃取物形式提供。
7. 权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述多酚以药学上可接受的盐形式提供。
8. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述约氏乳杆菌CNCM 1-1225呈活细菌、非 复制性细菌形式和/或作为所述细菌培养所处的培养基或培养基的部分。
9. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含约氏乳杆菌CNCM 1-1225的 量为102至10 ncfu/g组合物干质量、优选103至10 9cfu/g组合物干质量。
10. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述约氏乳杆菌CNCM 1-1225为封囊的。
11. 上述权利要求中任一项的组合物，其施用至人或宠物，特别是大于50岁的人。
12. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物选自食品、动物食品、药物组合 物、营养制剂、保健品、饮料、食品补充剂和食品添加剂。
13. 上述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物的水分活度小于0. 2,例如为 0. 19-0. 05范围，优选小于0. 15。
14. 包含与多酚组合的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的组合物的用途，用于制备用于治疗 或预防认知和/或神经变性病症的药物。
【文档编号】A61K35/741GK104427989SQ201380032471
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2012年6月22日
【发明者】R·贝尔-赖利德, J·杜尔加, T·昆茨, J·A·J·施密特 申请人:雀巢产品技术援助有限公司