St2l拮抗剂及使用方法
【专利摘要】本发明涉及ST2L拮抗剂、编码所述拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用前述物质的方法。
【专利说明】ST2L拮抗剂及使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国申请序列号13/798, 204、2013年3 月13日提交的美国申请序列号13/798,226、2012年4月30日提交的美国临时申请号 61/640, 407以及2012年4月30日提交的美国临时申请号61/640, 238的权益，所述申请的 全部内容以引用方式并入本文。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及ST2L拮抗剂、编码所述拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用 前述物质的方法。
【背景技术】
[0004]ST2L(IL-1RL1或IL-33Ra)是Toll/IL-Ι受体家族成员，在多种免疫细胞的细胞 表面上表达，所述免疫细胞包括T细胞、NK/NKT细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细 胞及新发现的非B/非T的2型先天性淋巴细胞、nuocytes和自然辅助细胞。也可在树突状 细胞（DC)、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上诱导ST2L表达。ST2L能够下调Toll样受体TLR2、 TLR4和TLR9的响应性，但也能经由被其配体IL-33活化及与辅助蛋白IL-IRAcP缔合而诱 导2型细胞因子释放。IL-33已被描述为"警报素"，因为在内稳态过程中其以全长形式存 在于上皮细胞和内皮细胞的细胞核中，但在细胞坏死过程中可被裂解并释放。
[0005]ST2L信号传导需要辅助蛋白IL-IRAcP缔合于预先形成的ST2L/IL-33复合 物。IL-la/β信号传导复合物也共用辅助蛋白IL-lRAcP。已提出了ST2L、IL-33和 IL-IRAcP相互作用以及IL-IRl与IL-IRAcP之间相互作用的模型（Lingel等人，Cell 17 :1398-1410,2009;Wang等人，NatImmunolll:905-11，2010)。近来发现，ST2L/IL-33/ IL-IRAcP与肥大细胞上的c-Kit(干细胞因子（SCF)的受体）形成信号传导复合物。IL-33 以SCF依赖方式在原代肥大细胞中诱导细胞因子产生（Drube等人，Blood115 :3899-906， 2010)。
[0006]ST2L的活化导致过度的2型细胞因子响应（尤其是IL-5和IL-13)、肥大细胞和 嗜酸性粒细胞活化，以及气道过度反应，并且据报道还可通过诱导来自NKT细胞的IFNγ和 来自肥大细胞的IL-Iβ及IL-6放大Thl和Thl7响应。ST2L/IL-33途径失调已表明与多 种免疫介导的疾病有关，包括哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、 鼻息肉以及全身性硬化症（综述于Palmer和Gabay，NatRevRheumatol7 :321_9, 2011和 Lloyd,CurrOpinTmmunol22 :800_6, 2010;Shimizu等人，HumMolecGen14 :2919-27, 2005,Kamekura等人，ClinExpAllergy42 :218_28,2012;Manetti等人，AnnRheumDis 69 :598-605,2010)。
[0007] 因此，需要适合用于治疗ST2L介导的疾病和失调的ST2L拮抗剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1示出在与同种型对照CNT05516相比时，在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症 模型中，通过ST2L域I结合单克隆抗体CNT03914抑制气道过度响应。当乙酰甲胆碱（MCH) 以升高的剂量（mg/ml)施用时，测量到气道阻力的峰值。CNT03914/IL-33相对于CNT05516/ IL-33,#p< 0· 05 ;以及CNT03914/IL-33 相对于经IL-33 处理的PBS组，< 0· 001。
[0009] 图2示出在与同种型对照CNT05516相比时，在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症 模型中，通过ST2L域I结合单克隆抗体CNT03914抑制支气管肺泡灌洗（BAL)细胞募集。 ***p< 0· 001。
[0010] 图3示出在经鼻内施用IL-33而诱导的肺炎症模型中，通过ST2L域I结合单克隆 抗体CNT03914在无细胞的BAL液中剂量依赖性抑制小鼠肥大细胞蛋白酶I(MMCP-I)的释 放。相对于经IL-33处理的CNT05516 (同种型对照），#p< 0· 01，< 0· 001。
[0011] 图4示出在体外通过ST2L域I结合单克隆抗体CNT03914,抑制小鼠骨髓源性肥大 细胞的IL-33诱导的GM-CSF(图4A)、IL-5(图4B)和TNFa(图4C)释放。在括号中，所使 用的CNT03914浓度示出为μg/ml，并且IL-33浓度示出为ng/ml。
[0012] 图5示出在指定IL-33和C2494浓度，通过ST2L域I结合单克隆抗体 C2494(STLM62)，抑制IL-33所诱导的人脐带血源性肥大细胞的前列腺素D2(POT2)释放。 MOX-PDG2 :甲氧胺-POT2。
[0013] 图6示出在StemPro-34培养基中的lng/mlIL-33+100ng/mlSCF(干细胞因子） 存在下，通过指定浓度（μg/ml)的ST2L域I结合单克隆抗体C2244和C2494,抑制人脐带 血源性肥大细胞（hCBMC)中的GM-CSF(图 6A)、IL-8 (图 6B)、IL-5 (图 6C)、IL-13 (图 6D) 和IL-10 (图6E)释放。
[0014] 图7示出在StemPro-34培养基中的lng/mlIL-33+100ng/mlSCF存在下，通过指 定浓度（yg/ml)的ST2L域III结合单克隆抗体C2519或C2521，对人脐带血源性肥大细胞 中的GM-CSF(图 7A)、IL-8 (图 7B)、IL-5 (图 7C)、IL-13 (图 7D)和IL-10 (图 7E)释放的 影响。
[0015]图 8 示出在RPMI/10 %FCS培养基中 3ng/mlIL-33+100ng/mlSCF存在下， 通过ST2L域I结合单克隆抗体C2494和ST2L域III结合单克隆抗体ST2M48 (M48)、 ST2M49(M49)、ST2M50(M50)和ST2M51 (M51)，对人脐带血源性肥大细胞（hCBMC)中的A) GM-CSF;B)IL-8 ;C)IL-5 ;D)IL-13 以及E)IL-10 释放的影响。
[0016] 图9示出结合5了21^的域1(01)或域111(03)的抗-5了21^抗体，如所指示使用 50μg/ml或2μg/ml的每种被测抗体时，抑制人脐带血源性肥大细胞在受IL-33和SCF诱 导时的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10和IL-13释放的平均百分比（％ )。负值指示活化％。
[0017] 图10示出抗-ST2L抗体的重链可变区（VH)和重链⑶R序列，其来源于噬菌体展 示文库，且后续经亲和力成熟筛选（affinity-maturationcampaign)。
[0018] 图11示出抗-ST2L抗体的轻链可变区（VL)和轻链CDR序列，其来源于噬菌体展 示文库，且后续经亲和力成熟筛选。
[0019] 图12示出抗-ST2L抗体STLM208VHST2H257HCDR3变体的VH和VL区，以及重链 ⑶R的序列。
[0020] 图13示出抗-ST2L抗体的A)VH和B)VL序列，其来源于噬菌体展示文库，且后续 经亲和力成熟筛选。
[0021] 图14示出转移到人框架（被转移部分标记为HFA"humanframework adaptation"（人框架适应性））的C2494VH和VL抗原结合位点的划分。KabatCDR带有 下划线，并且ChothiaHV在所示转移HFA区的上方以虚线指示。VH和VL残基的编号根据 Chothia。VH中以灰色突出显示的残基在一些HFA变体中未被转移。C2494VH:SEQIDNO: 48 ；C2494VH：SEQIDNO：52〇
[0022] 图15示出来源于C2494的人框架适应性（HFA)抗体的⑶R序列。
[0023] 图16A)抗-ST2L抗体CNT03914的血清水平；B)支气管肺泡灌洗（BAL)细胞募集 的抑制；C)被IL-33刺激的全血细胞的IL-6分泌的抑制；D)在经鼻内施用IL-33而诱导 肺炎症6小时模型中，给药后24小时通过CNT03914抑制用IL-33刺激的全血细胞的MCPl 分泌。*ρ<(λ05，**p< 0· 01，***p< 0· 001;NQ=低于检出限；@ = 一个数据点低于检出 限。
[0024] 图17各种抗-ST2L抗体之间的竞争。A) 30nM经标记的C2244Fab与指定抗体竞争 结合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2244与C2494竞争，但不与C2539竞争。B)IOnM经标记 的C2494与指定抗体竞争结合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2494与STLM208和STLM213竞 争，但不与C2539竞争。
[0025] 图18示出与C2244Fab复合的人ST2-ECD(SEQIDN0:119)的简化Η/D交换图。 被抗体保护的区域以所示不同的灰度显示。包含第18-31位残基（虚线方框内） IDNO:1的全长ST2L的第35-48位残基）的片段由Fab保护。包含第71-100位残基（实 线方框内）（对应SEQIDNO:1的第88-117位残基）的区域被重度糖基化且未被肽覆盖。
[0026] 图19示出ST2L域I结合抗体对图中所示ST2L变体的动力学和亲和力常数。
[0027] 图20示出抗-ST2L抗体STLM208对原代人肺肥大细胞的A)GM-CSF;B)IL-5 ;〇 IL-8 ;D)IL-13分泌的抑制。
【发明内容】
[0028] 本发明提供一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L 的域I(SEQIDNO:9)。
[0029] 本发明还提供特异性结合具有下列序列的人ST2L的人适应性抗体拮抗剂：特定 轻链和重链可变区序列，或特定重链和轻链互补决定序列。
[0030] 本发明还提供在限定表位区特异性结合人ST2L和/或具有如本文所述特定特征 的人或人适应性抗体拮抗剂。
[0031] 本发明还提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的重链可变区（VH)或轻链可 变区（VL)。
[0032] 本发明还提供一种载体，其包含本发明的分离的多核苷酸。
[0033] 本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
[0034] 本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞 以及从所述细胞回收抗体。
[0035] 本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的分离抗体以及配药学上可接受的 媒介物。
[0036] 本发明还提供一种治疗或预防ST2L介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效 量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防ST2L介导的病症的时 间。
[0037] 本发明还提供一种抑制患者体内肥大细胞响应的方法，该方法包括将治疗有效量 的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以抑制肥大细胞响应的时间。
[0038] 本发明还提供一种在受治疗者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，该方法包 括以足以抑制IL-33和ST2L的相互作用的量向该受治疗者施用特异性结合ST2L的域I的 抗体。
【具体实施方式】
[0039] 本说明书中所引用的所有出版物（包括但不限于专利和专利申请）均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整给出。
[0040] 应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例，并非旨在进行限制。除非另 有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通 常所理解的含义相同。
[0041] 虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检 验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使 用以下术语。
[0042] 如本文所用，术语"拮抗剂"意指通过任何机制部分或完全抑制ST2L生物活性的 分子。示例性拮抗剂是抗体、融合蛋白质、肽、模拟肽、核酸、寡核苷酸和小分子。拮抗剂可 使用下述ST2L生物活性测定法鉴定。ST2L拮抗剂可使所测量的ST2L生物活性抑制20%、 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0043] 术语"ST2L"或"huST2L"或"人ST2L"是指具有基因库登录号NP057316中所示 的氨基酸序列的人ST2L多肽。SEQIDNO: 1示出全长人ST2L的氨基酸序列。如本文所用， "ST2L胞外域"、"ST2L-ECD" 或 "huST2L-ECD" 意指具有SEQIDNO:1 的第 19-328 位氨基 酸的多肽。huST2L-ECD具有三个Ig样C2型域，其跨越SEQIDNO:1的第19-122位残基 (域I，SEQIDNO:9)、第 123-202 位残基（域II，SEQIDNO: 10)以及第 209-324 位残基 (域III，SEQIDN0:11)。"域I"或"ST2L域I"或"huST2L域I"或"D1"是指人ST2L上 的第一免疫球蛋白样域，其具有SEQIDNO:9中所示的序列。"域III"或"ST2L域III"是 指人ST2L上的第三免疫球蛋白样域，其具有SEQIDNO: 11中所示的序列。
[0044] 如本文所用，术语"IL-33"包括全长IL-33(基因库登录号NP_254274SEQIDNO: 3)及其变体和活性形式。IL-33变体包括具有基因库登录号NP_001186569和基因库登录号 NP_001186570中所示的氨基酸序列的蛋白质。IL-33活性形式包括"成熟IL-33"，其具有 SEQIDNO:3的第112-270位残基。另外的活性形式包括IL-33片段，其具有SEQIDNO:3 的第 11-270位、第 115-270位、第95-270位、第99-270位或第 109-270位残基（LeFrancais 等人，ProcNatlAcadSci(USA) 109 :1673-8, 2012)，或从内源性表达IL-33的细胞分离的 任何形式或形式的组合。"IL-33活性形式"是诱导ST2L生物活性的SEQIDNO:3的IL-33 的片段或变体。
[0045] 如本文所用，术语"抗体"含义广泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体；单 克隆抗体，包括鼠、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体；抗体片段；由至少两个完整抗 体或抗体片段所形成的双特异性或多特异性抗体；二聚体、四聚体或多聚体抗体；以及单 链抗体。
[0046] 免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1UgA2UgG1UgG2UgGjPIgG4。任 何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定至两种明显不同类 型中的之一，S卩κ(κ)和λ(λ)。
[0047] 术语"抗体片段"是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链和/或轻链抗原结合 位点，诸如重链互补决定区（HCDR) 1、2和3,轻链互补决定区（IXDR) 1、2和3,重链可变区 (VH)或轻链可变区（VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab' ) 2、Fd和Fv片段以及由一个 VH域组成的域抗体（dAb)。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链 抗体设计，其中在VH和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域在分子内或 分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体（diabody);例如在 国际专利公开W098/44001、国际专利公开W088/01649、国际专利公开W094/13804、国际专 利公开W092/01047中所描述的。
[0048] 抗体可变区由插入有三个"抗原结合位点"的"框架"区组成。使用不同术语来定 义抗原结合位点：（丨）三个在州0?1?1、!《1?2、!《1?3)中且三个在￥1^(1^〇)1?1、1^〇)1?2、1^〇)1?3)中的互补决定区（CDR)，是基于序列变异性（Wu和Kabat，JExpMed132:211-50,1970; Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,1991)。（ii)三个在VH(H1、H2、 H3)中且三个在VL(LI、L2、L3)中的"超变区"、"HVR"或"HV"，是指抗体可变域中的在结构 上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义（Chothia和Lesk，MolBiol196 :901-17,1987)。 其他术语包括"頂GT-CDR"（Lefranc等人，DevComparatImmunol27:55-77,2003)和"特 异性决定残基用途"（SDRU) (Almagro，MolRecognitl7 :132_43, 2004)。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库（http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编 号和定义。⑶R、HV与IMGT划分之间的对应性描述于Lefranc等人，DevComparatImmunol 27 :55-77,2003〇
[0049] 如本文所用，"Chothia残基"是抗体VL和VH残基，其根据Al-Lazikani来编号 (Al-Lazikani等人，JMolBiol273 :927-48,1997)。
[0050] "框架"或"框架序列"是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的 其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的不同术语定义，所以框架的精确氨基酸序 列取决于如何定义抗原结合位点。
[0051] "人抗体"或"完全人抗体"是指包含来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区 序列的抗体。本发明的人抗体可包括置换，因此其可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基 因序列的精确拷贝。然而，"人抗体"的定义并不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
[0052] "人适应性"抗体或"人框架适应性（HFA)"抗体是指根据美国专利公开 No.US2009/0118127中所描述的方法适应化的抗体，并且也指将来源于非人物种的抗原结 合位点序列移植到人框架的抗体。
[0053] "人源化抗体"是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免 疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括置换，因此该框架可能不是表达的人 免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。
[0054] 如本文所用，术语"基本上相同"意指所比较的两个抗体可变区氨基酸序列是相 同的或具有"非实质差异"。非实质差异是在抗体或抗体可变区序列中不会不利地影响 抗体特性的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸的置换。与本文所公开的可变区序 列基本上相同的氨基酸序列在本申请范围内。在一些实施例中，所述序列同一性可以为 约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。可使用￥6(^(^阶1 V. 9. 0· 0(Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置，例如通过逐对比对来测定 百分比同一性。本发明的蛋白质序列可用作执行公共或专利数据库检索的查询序列，以例 如识别相关序列。用于执行此类检索的示例性程序为使用默认设置的XBLAST或BLASTP程 序（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)、或GenomeQuest?(GenomeQuest,Westborough，MA)套 件。
[0055] 如本文所用，术语"表位"是指抗体特异性结合的抗原的一部分。表位通常由化学 活性的（诸如极性、非极性或疏水性）表面部分组而组成，诸如氨基酸或多糖侧链，并且可 具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/ 或不连续氨基酸构成。对于不连续表位而言，抗原线性序列不同部分的氨基酸，通过蛋白质 分子的折叠，在三维空间中紧密靠近。示例性表位是以SEQIDNO:9示出的huST2L的域I。
[0056] 如本文所用，术语"互补位"意指抗原特异性结合的抗体的一部分。互补位可以是 线状特征的或可以是不连续的，通过抗体的非连续性氨基酸之间的空间关系所形成，而非 氨基酸的线型系列。"轻链互补位"和"重链互补位"或"轻链互补位氨基酸残基"和"重链 互补位氨基酸残基"分别是指与抗原相接触的抗体轻链和重链残基。
[0057] 如本文所用，术语"特异性结合"或"特异性地结合"是指抗体以比针对其他抗原 或蛋白质更高的亲和力结合于预定的抗原。通常，抗体以IXKT7M或更小的解离常数（Kd) 结合于预定的抗原，例如IXKT8M或更小、IXKT9M或更小、IXKTkiM或更小、IXKT11M或更 小、或IXKT12M或更小，通常Kd为其结合于非特异性抗原（例如BSA、酪蛋白或任何其他特 定多肽）的Kd的至少十倍。可以使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合于预定 抗原的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如对于来自其他物种（同源）的相 同预定抗原，诸如人或猴，例如食蟹猴（Macacafascicularis)(食蟹称猴（cynomolgus))。
[0058] 如本文所用，"双特异性"是指结合两个不同抗原或抗原内的两个不同表位的抗 体。
[0059] 如本文所用，"单特异性"是指结合一个抗原或一个表位的抗体。
[0060] 如本文所用，术语"进行组合"是指所描述药剂可以在混合物中、作为单一药剂同 时地或作为单一药剂以任何顺序先后地共同向动物施用。
[0061] 如本文所用，"炎性病症"是指对于有害刺激诸如病原体、受损细胞、物理伤害或 刺激物的急性或慢性局部或全身性响应，所述响应部分由细胞因子、趋化因子或炎性细胞 (如，嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）的活性介导，并且所述炎性病症在多 数情况下的特征在于疼痛、发红、肿胀和组织功能损伤。
[0062] 如本文所用，术语"ST2L介导的炎性病症"是指至少部分由于不适当的ST2L信号 传导途径活化而造成的炎性病症。示例性ST2L介导的炎性病症是哮喘和过敏。
[0063] 如本文所用，术语"ST2L介导的病症"涵盖ST2L在疾病和医学病症中直接或间接 发挥作用的所有疾病和医学病症，包括疾病或病症的引发、发展、进程、持续或病变。
[0064] 如本文所用，术语"ST2L生物活性"是指由于ST2L配体IL-33结合于ST2L所出现 的任何活性。示例性ST2L生物活性导致NF-κB响应于IL-33而活化。NF-κB活化可在用IL-33诱导ST2L时使用报告基因测定法测定（Fursov等人，Hybridoma30 :153-62, 2011)。 其他示例性ST2L生物活性导致Th2细胞的增殖，或促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，例 如IL-5、GM-CSF、IL-8、IL-10或IL-13。细胞因子和趋化因子从细胞、组织中或在循环中的 释放可使用熟知的免疫测定法来测量，诸如ELISA免疫测定法。
[0065] 术语"载体"是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。 载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是 促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动 物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA 或RNA分子或这些分子的杂交体。
[0066] 术语"表达载体"是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载 体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
[0067] 术语"多核苷酸"是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连 接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例 子。
[0068] 术语"多肽"或"蛋白质"是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基 的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作"肽"。
[0069] 本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码：
[0070]
[0071]
【权利要求】
1. 一种分离的人或人适应性抗体拮抗剂或其片段，其特异性结合人ST2L的域I (SEQ ID NO: 9)。
2. 根据权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体阻断IL-33/ST2L相互作用。
3. 根据权利要求2所述的分离抗体，其具有介于约5 X 1(T12M至约7 X 10^1之间的对 人ST2L的解离常数（KD)，介于约ZXKfM-is-1至约IXIO^^s-1之间的对人ST2L的结合速 率常数（KJ，或介于约1 X K^s-1至约1 X lO-Y1之间的对人ST2L的解离速率常数（KJ。
4. 根据权利要求3所述的分离抗体，其具有介于约3X1(T12M至约2X10,之间的 对食蟹猴（ifecaca /kscicw/aris (cyno)) ST2L (SEQ ID NO: 2)的解离常数（KD)，介 于约4X lOlY1至约1 X lOlY1之间的对cyno ST2L的结合速率常数（KJ，或介于约 7X lO、-1至约1 X lO、-1之间的对cyno ST2L的解离速率常数（Koff)。
5. 根据权利要求4所述的分离抗体，其包含： a) SEQ ID NO: 160 (XAX^XJ 的重链互补决定区（HCDR) 1 (HCDR1);其中 Xi 为 S、F、D、I、G 或 V ; X2为Y或D ; &为A、D或S ;并且 父4为S、F或I ; b) SEQ ID NO: 161 (X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)的 HCDR 2 (HCDR2);其中 X5 为 A、S、T、Y或D ; X6 为 S、R、E、K、G 或 A ; 父7为S、E或N; X8 为 S、R、E、G、T、D 或 A ;并且 x9Sy、d、n、a*s;#& c) SEQ ID NO: 162 (X1(lXnWSTEGSFFVLDY)的 HCDR 3 (HCDR3);其中 Xn*P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V、*I;#& d) SEQ ID NO: 163 (RASQSVDDX12LA)的轻链互补决定区（LCDR) 1 (LCDR1);其中 X12为A或D ; e) SEQ ID NO: 90 (DASNRAT)的 LCDR 2 (LCDR2);以及 f) SEQ ID NO: 164 (QQX13X14X15X16X17X 18T)的 LCDR 3 (LCDR3);其中 X13为F或Y ; X14 为 Y、I 或 N ; X15SN、G、D 或 T ; X16为W或A ; X17为P或缺失；并且 X18为L或I。
6. 根据权利要求5所述的分离抗体，其包含： a) SEQ ID NO: 97 的 HCDR1 ; b) SEQ ID NO: 114 的 HCDR2 ; c) SEQ ID NO: 84 的 HCDR3 ; d) SEQ ID NO: 130 的 LCDR1 ; e) SEQ ID NO: 90 的 LCDR2 ;以及 f) SEQ ID NO: 134 的 LCDR3 ;或 g) SEQ ID NO: 191 的 VH 和 SEQ ID NO: 209 的 VL。
7.根据权利要求5所述的分离抗体，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDR1、 LCDR2 和 LCDR3 : a) 分别为 SEQ ID NO: 78、81、84、87、90和92; b) 分别为 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90 和 131 ; c) 分别为 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和132; d) 分别为 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和133; e) 分别为 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和134; f) 分别为 SEQ ID NO: 95、109、84、130、90 和 131 ; g) 分别为 SEQ ID NO: 96、110、84、130、90 和 131 ; h) 分别为 SEQ ID NO: 97、111、84、130、90 和 131; i) 分别为 SEQ ID NO: 96、110、84、130、90 和 134; j) 分别为 SEQ ID NO: 97、111、84、130、90 和 134; k) 分别为 SEQ ID NO: 97、112、84、130、90 和 134; l) 分别为 SEQ ID NO: 98、113、84、130、90 和 134; m) 分别为 SEQ ID NO: 97、114、84、130、90和134; n) 分别为 SEQ ID NO: 97、115、84、130、90 和 134; 〇)分别为 SEQ ID NO: 99、116、84、130、90和133; 口）分别为3￡〇10勵：100、117、84、130、90和133; 9)分别为3￡〇10勵：101、118、84、130、90和133; 1〇分别为3￡〇10勵：102、120、84、130、90和132; 8)分别为3￡〇10勵：103、121、84、130、90和132; t) 分别为 SEQ ID NO: 103、122、84、130、90 和 131 ; u) 分别为 SEQ ID NO: 103、123、84、130、90 和 131 ; ￥)分别为3￡〇10勵：104、124、84、130、90和131; w) 分别为 SEQ ID NO: 105、125、84、130、90 和 131 ; x) 分别为 SEQ ID NO: 106、126、84、130、90 和 131 ; y) 分别为 SEQ ID NO: 95、127、84、130、90 和 131 ; z) 分别为 SEQ ID NO: 107、128、84、130、90 和 131 ; aa)分别为 SEQ ID NO: 108、129、84、130、90 和 131 ; bb) 分别为 SEQ ID NO: 97、114、165、130、90 和 134; cc)分别为 SEQ ID NO: 97、114、166、130、90 和 134; dd)分别为 SEQ ID NO: 97、114、167、130、90 和 134; ee)分别为 SEQ ID NO: 97、114、168、130、90 和 134; ff)分别为 SEQ ID NO: 97、114、169、130、90 和 134; gg)分别为 SEQ ID NO: 97、114、170、130、90 和 134; hh)分别为 SEQ ID NO: 97、114、171、130、90 和 134; ii)分别为 SEQ ID NO: 97、114、172、130、90 和 134; jj)分别为 SEQ ID NO: 97、114、173、130、90和134; kk)分别为 SEQ ID NO: 97、114、174、130、90和134; 11)分别为 SEQ ID NO: 97、114、175、130、90 和 134; mm)分别为 SEQ ID NO: 97、114、176、130、90 和 134; nn)分别为 SEQ ID NO: 97、114、177、130、90 和 134; 〇〇)分别为 SEQ ID NO: 97、114、178、130、90 和 134; PP)分别为 SEQ ID NO: 97、114、179、130、90 和 134; qq)分别为 SEQ ID NO: 97、114、180、130、90 和 134; rr)分别为 SEQ ID NO: 97、114、181、130、90 和 134; ss)分别为 SEQ ID NO: 97、114、182、130、90 和 134; tt)分别为 SEQ ID NO: 97、114、183、130、90 和 134; uu)分别为 SEQ ID NO: 97、114、184、130、90 和 134;或 vv)分别为 SEQ ID NO: 97、114、185、130、90和134。
8. 根据权利要求4所述的分离抗体，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDR1、 LCDR2 和 LCDR3 : a) 分别为 SEQ ID NO: 23、27、31、35、39和43; b) 分别为 SEQ ID NO: 24、28、32、36、40和44; c) 分别为 SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和147;或 d) 分别为 SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和44。
9. 根据权利要求2所述的分离抗体，其中所述抗体与包含SEQ ID NO: 47的重链可变 区（VH)和SEQ ID NO: 51的轻链可变区（VL)的分离抗体竞争结合于人ST2L (SEQ ID NO: 1)。
10. 根据权利要求9所述的分离抗体，其中所述抗体在SEQ ID NO: 1的第35-48位氨 基酸残基（rcprqgkpsytvdW;SEQ ID NO: 210)处结合人 ST2L。
11. 根据权利要求10所述的分离抗体，其中所述抗体还在SEQ ID NO: 1的氨基酸残 基T93和F94处结合人ST2L。
12. 根据权利要求1所述的分离抗体，其包含具有来源于人IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158)、IGHV1_24*01 (SEQ ID NO: 148)或 IGHVl-f*01 (SEQ ID NO: 149)框架序列的 VH框 架的重链可变区（VH)、以及具有来源于人IGKV3-11 (L6) (SEQIDNO: 159)、IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150)、IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151)、IGKV1_5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152)、IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153)、IGKV1_39*01 (012) (SEQ ID NO: 154)、 IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155)或 IGKV1-33*01 (018) (SEQ ID NO: 156)框架序 列的VL框架的轻链可变区（VL)。
13. 根据权利要求1所述的分离抗体，其为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4型。
14. 根据权利要求13所述的分离抗体，其在Fc区中具有置换。
15. 根据权利要求14所述的分离抗体，其中所述置换包括置换M252Y/S254T/T256E、 V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S 或 P238S/L234A/L235A，其中残基编号根据 EU编号。
16. 根据权利要求12所述的分离抗体，其包含与SEQ ID NO: 191的VH具有至少90% 同一性的VH和与SEQ ID NO: 209的VL具有至少94%同一性的VL。
17. 根据权利要求16所述的分离抗体，其包含SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、 188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205 的711 和 SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208 或 209 的乂1。
18. 根据权利要求17所述的分离抗体，其包含如下序列的VH和VL : a) 分别为 SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 206; b) 分别为 SEQ ID NO: 187 和 SEQ ID NO: 206; c) 分别为 SEQ ID NO: 197 和 SEQ ID NO: 206; d) 分别为 SEQ ID NO: 198 和 SEQ ID NO: 206; e) 分别为 SEQ ID NO: 199 和 SEQ ID NO: 206; f) 分别为 SEQ ID NO: 200 和 SEQ ID NO: 206; g) 分别为 SEQ ID NO: 201 和 SEQ ID NO: 206 ; h) 分别为 SEQ ID NO: 202 和 SEQ ID NO: 206; i) 分别为 SEQ ID NO: 203 和 SEQ ID NO: 206; j) 分别为 SEQ ID NO: 204 和 SEQ ID NO: 206; k) 分别为 SEQ ID NO: 205 和 SEQ ID NO: 206; l) 分别为 SEQ ID NO: 195 和 SEQ ID NO: 207; m) 分别为 SEQ ID NO: 196 和 SEQ ID NO: 207; n) 分别为 SEQ ID NO: 188 和 SEQ ID NO: 208; 〇)分别为 SEQ ID NO: 189 和 SEQ ID NO: 208; P)分别为 SEQ ID NO: 190 和 SEQ ID NO: 208; q) 分别为 SEQ ID NO: 187 和 SEQ ID NO: 209; r) 分别为 SEQ ID NO: 191 和 SEQ ID NO: 209; s) 分别为 SEQ ID NO: 192 和 SEQ ID NO: 209; t) 分别为 SEQ ID NO: 193 和 SEQ ID NO: 209;或 u) 分别为 SEQ ID NO: 194 和 SEQ ID NO: 209。
19. 一种分离的多核苷酸，其编码 SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、197、198、199、 200、201、202、203、204或205 的￥11，或者5￡0 1〇吣：135、136、137、138、139、140、141、142、 206、207、208 或 209 的 VL。
20. -种载体，其包含权利要求19所述的分离多核苷酸。
21. -种宿主细胞，其包含权利要求20所述的载体。
22. -种制备权利要求18所述的抗体的方法，该方法包括培养权利要求21所述的宿 主细胞以及从所述细胞回收所述抗体。
23. -种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求6所述的分离抗体以及配药学上 可接受的媒介物。
24. -种治疗或预防ST2L介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的权利要求1 或权利要求6所述的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防所述ST2L介导的 病症的时间。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述ST2L介导的病症是哮喘、气道过度反 应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病（COPD)、特发性肺纤维化（IPF)、囊性纤维化、炎性肠病、 (IBD)、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻 疹、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病（GVHD)，或与肺中的 炎性细胞募集、杯状细胞增生、增加的粘液分泌或肥大细胞响应相关联。
26. -种抑制患者体内肥大细胞响应的方法，该方法包括将治疗有效量的权利要求1 所述的分离抗体向对其有需求的患者施用足以抑制所述肥大细胞响应的时间。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述抑制肥大细胞响应包括用50|ag/ml抗体使 人脐带血源性肥大细胞释放的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13的水平抑制至少50%。
28. -种在受治疗者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，该方法包括以足以抑制 IL-33和ST2L的相互作用的量向所述受治疗者施用特异性结合ST2L的域I的抗体。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述受治疗者患有ST2L介导的病症。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述ST2L介导的病症是哮喘、气道过度反 应、结节病、慢性阻塞性肺部疾病（COPD)、特发性肺纤维化（IPF)、囊性纤维化、炎性肠病、 (IBD)、嗜酸细胞性食道炎、硬皮病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、大疱性类天疱疮、慢性荨麻 疹、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、间质性膀胱炎或移植物抗宿主病（GVHD)，或与肺中的 炎性细胞募集、杯状细胞增生、或增加的粘液分泌、或肥大细胞响应相关联。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体包含： a) SEQ ID NO: 97 的 HCDR1 ; b) SEQ ID NO: 114 的 HCDR2 ; c) SEQ ID NO: 84 的 HCDR3 ; d) SEQ ID NO: 130 的 LCDR1 ; e) SEQ ID NO: 90 的 LCDR2 ;以及 f) SEQ ID NO: 134 的 LCDR3 ;或 g) SEQ ID NO: 191 的 VH 和 SEQ ID NO: 209 的 VL。
32. 用于治疗的权利要求1、权利要求6或权利要求9所述的抗体。
【文档编号】A61K39/395GK104411333SQ201380035058
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年4月29日 优先权日:2012年4月30日
【发明者】K.达菲, C.希利, R.拉姆布, R.马拉维亚, M.普拉塔, N.富索夫, J.罗, M.纳索, M.托内塔, J.惠勒, S-J.吴, L.哈尔 申请人:詹森生物科技公司