一种伊立替康纳米脂束制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种伊立替康纳米脂束制剂及其制备方法。所述伊立替康纳米脂束制剂包含磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康，及注射用水性溶剂。所述伊立替康纳米脂束制剂粒径均匀，作为脂束制剂能降低伊立替康的毒性、具有长循环效果、能增强肿瘤靶向富集作用和增加病人顺应性；所述制备方法工艺简单、具高重复性且可工业化生产。
【专利说明】一种伊立替康纳米脂束制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物纳米脂束制剂【技术领域】，尤其涉及一种伊立替康纳米脂束制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]伊立替康(Irinotecan,CPT-1I), 1998年获FDA批准用于标准化疗方案，治疗转移性结肠直肠癌的复发和恶化，是40多年来美国FDA继五氟尿嘧啶(5-FU)以后再次批准用于转移性结直肠癌一线治疗的化疗药。它是喜树碱的衍生物，选择性地结合抑制拓扑异构酶I，与Topo-DNA复合物共价结合形成稳定Topo-药物-DNA复合物，从而抑制DNA重连步骤，以致导致DNA链的断裂，出现细胞凋亡。对拓扑异构酶I高表达的小细胞肺癌、百小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌等具有更高的疗效。同其它有效抗肿瘤药物一样，CPT-1l具有明显的毒性，在抑制癌细胞的同时，对正常细胞亦有影响。目前市场上提供的剂型为盐酸伊立替康静脉滴注射浓缩液，药物名称为开普拓(Campto)。主要用于晚期大肠癌患者的治疗，作为单一用药，治疗经含5-氟尿嘧啶化疗方案治疗失败的患者。同时,伊立替康应用于胃癌和食管癌的多种临床试验正在进行中，就已得出的阶段性观察结果来看，有很好的临床应用前景，值得密切关注。但其静脉滴注浓缩液给药存在着严重的毒副作用，如:迟发性腹泻、恶心与呕吐、中性粒细胞减少症合并发热、外周血小板减少症、结膜炎、鼻炎、低血压、 血管舒张、出汗、寒战、全身不适、头晕、视力障碍、瞳孔缩小、流泪、呼吸困难、肌肉收缩、痉挛及感觉异常等。为了降低药物骨髓抑制、胃肠道反应(严重腹宵)以及肝肾毒性等毒副作用，研究人员从两方面入手:一是合成药物的衍生物；二是建立新的给药途径。第一种方法从开始到应用于临床周期长，耗费大量的人力、物力；第二种方法则大大缩短了进入临床的周期，节省了人力、物力。因此选用适当的药物载体来达到高效低毒即降低毒性的目的就显得十分重要。
[0003]纳米尺寸的药物可在一定程度上提高化疗药物的靶向性并大幅度地降低化疗药物的毒副作用，与目前的其它抗肿瘤药物剂型相比，纳米药物具有独特的优点。动物实验表明，纳米尺寸的药物，经静脉注射后在某些肿瘤中的药物浓度高于邻近正常组织。这为扩大抗肿瘤药物的应用提供了一条良好的途径。纳米脂束，粒径在IOOnm左右，可以将药物包封于脂束内部形成超微型球状载体。纳米脂束具有以下优点:①靶向性:静脉注射给药后集中于网状内皮系统，80%-90%集中于肝、脾必缓释性:减少肾排泄和体内的代谢，延长药物的作用时间；③降低药物的毒性:由于纳米药物主要集中于内皮网状内皮细胞丰富的器官如肝脏中，而在心脏、肾、骨髓的药物的浓度低，因此减少了药物对其它器官的毒副作用；(!)提高药物的稳定性:脂束的分子层保护药物，提高稳定性。将伊立替康包载于纳米尺寸的脂束是降低其毒副作用重要选择之一。目前市场上没有伊立替康纳米脂束的报道和产品应用，其研究开发具有重要意义。
[0004]脂束在血液循环中的稳定性是发挥药物载体作用的关键。普通磷脂组成的脂质体在体内的半衰期仅为十几分钟。原因很多:血液中高密度脂蛋白是破坏脂质体的主要成分；由于能激活补体系统，脂质体易于被渗透和裂解；磷脂酶能够降解磷脂；血清白蛋白能够与磷脂结合形成复合物，从而降低磷脂组成纳米组装体的稳定性。研究发现表面聚乙二醇(PEG)化能延长纳米组装体的体内循环时间。原因在于PEG化能够实现立体阻碍和提高膜表面的亲水性。PEG表面化的纳米脂束能够兼具长循环、隐形和立体稳定的特点，对减少巨唾细胞吞噬、提高药物靶向性、阻碍血液蛋白成分与磷脂的结合等具有重要的作用。因此，借助传统的磷脂和FDA批准的新型聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯(Solutol HS15)实现伊立替康的包载和纳米化，对于满足临床应用的各种需求，造福于广大的癌症患者具有重大意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种伊立替康纳米脂束制剂及其制备方法，所述伊立替康纳米脂束制剂粒径均匀，作为脂束制剂能降低伊立替康的毒性、具有长循环效果、能增强肿瘤靶向富集作用和增加病人顺应性；所述制备方法工艺简单、具高重复性且可工业化生产。
[0006]为实现本发明的目的，采用以下技术方案:
[0007]在第一方面，本发明提供一种伊立替康纳米脂束制剂，包含磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康，及注射用水性溶剂。
[0008]本发明的伊立替康纳米脂束制剂中，注射用水性溶剂是主要基质为水的含溶质或不含溶质的能够用于注射的溶剂，不作特别地限定。
[0009]作为本发明的优 选，所述注射用水性溶剂选自生理盐水、葡萄糖注射液和注射用水中的一种或多种。
[0010]作为本发明的优选，所述制剂包含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇和I~4重量份伊立替康。
[0011]具体实施中，所述制剂中磷脂的含量可以是5重量份、6重量份或7重量份；聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；甘油的含量可以是7重量份、9重量份、11重量份或13重量份；乙醇的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；伊立替康的含量可以是1.5重量份、2重量份、3重量份或
3.5重量份。
[0012]作为本发明的优选，所述注射用水性溶剂的体积是所述磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康总体积的5-100倍，例如6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、70倍、80倍或90倍，优选5_80倍，更优选10-20倍。
[0013]作为本发明的优选，所述制剂配方中可增加主动靶向材料。所述主动靶向材料能够增强所述制剂在肿瘤中的富集作用。优选地，所述主动靶向材料为X-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(X-PEG-DSPE)，其中X可以是叶酸、五肽CRGDK (其中C表示半胱氨酸、R表示精氨酸、G表示甘氨酸、D表示天冬氨酸、K表示赖氨酸)或胆酸中的一种或多种，PEG表示聚乙二醇，DSPE表示二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。需要说明的是:所述主动靶向材料并不局限于上述几种，任何能够增强所述制剂在肿瘤中的富集作用并且药学上可以接受的主动靶向材料均可用于本发明。
[0014]优选地，所述制剂中主动靶向材料X-PEG-DSPE的含量为0.01_2重量份，例如0.02重量份、0.05重量份、0.1重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.8重量份、1.2重量份、1.5重量份或1.8重量份,更优选0.1-1重量份，最优选0.1-0.4重量份。
[0015]本发明示出一个典型的含有主动靶向材料的制剂例子如下:含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇、I~4重量份伊立替康和0.1-0.4重量份主动靶向材料X-PEG-DSPE，其中X表示叶酸、五肽CRGDK或胆酸；以及相当于上述原料总体积的10-20倍的注射用水性溶剂。
[0016]作为本发明的优选，所述制剂配方中可增加防冻剂和/或pH调节剂，其中所述防冻剂选自丙二醇和山梨糖醇等；所述PH调节剂选自柠檬酸、乳酸、Na2CO3^ NaOH, NH4Cl,NaHCO3 和 Ca(OH)2 等。
[0017]作为本发明的优选，所述伊利替康纳米脂束制剂可通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射等常规给药方式给药。 [0018]在第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的伊立替康纳米脂束制剂的方法，包括:
[0019](I)将磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或pH调节剂混合，配成澄清透明溶液；
[0020](2)用注射用水性溶剂稀释所述澄清透明溶液，自乳化得到所述伊立替康纳米脂束制剂。
[0021]本发明利用聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯的成胶束功能和对伊立替康的增溶功能，以及磷脂对聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯胶束的尺寸调节作用，经自乳化过程后，实现伊立替康纳米脂束的制备。
[0022]本发明制备伊立替康纳米脂束制剂的方法中，步骤(1)配制澄清透明溶液的方法有多种，可以将磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康混合在一起，借助磁力搅拌、机械搅拌、超声、加热、匀浆器匀浆或其组合等外力作用得到澄清透明溶液。具体实施中，可以将上述配方中的成分一次性全部加入容器中进行混合处理，也可以先加一部分配方中的物质，搅拌均匀后，再加另一部分并混合处理得到澄清透明溶液。本发明优选的两种配制澄清透明溶液的方法如下:
[0023]第一种方法具体为:
[0024]( Ia)将磷脂与乙醇混合溶解，配成第一溶液；
[0025](Ib)将聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或PH调节剂混合溶解，配成第二溶液；
[0026](Ic)将所述第一溶液与所述第二溶液混合，搅拌混匀得到所述澄清透明溶液。
[0027]第二种方法具体为:
[0028]将磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或PH调节剂混合，搅拌混匀配成澄清透明溶液。
[0029]本发明中，澄清透明溶液是一般意义上的概念，即肉眼不可见颗粒物或析出物的存在，激光照射下，没有丁达尔现象的发生，紫外吸收光谱中不会有源于颗粒散射所导致的消光。
[0030]本发明配制的澄清透明溶液即伊立替康纳米脂束制剂前体，可以在氮气保护条件下密封保存。如果配制的澄清透明溶液马上进行自乳化也可以不密封保存。
[0031]本发明中，步骤(2)的自乳化过程，根据需要可借助外力，比如轻柔或剧烈震荡均可。
[0032]本发明制备伊立替康纳米脂束制剂的方法中，注射用水性溶剂是主要基质为水的含溶质或不含溶质的能够用于注射的溶剂，不作特别地限定。
[0033]作为本发明的优选，所述注射用水性溶剂选自生理盐水、葡萄糖注射液和注射用水中的一种或多种。
[0034]作为本发明的优选，所述澄清透明溶液含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇和I~4重量份伊立替康。
[0035]具体实施中，所述澄清透明溶液中磷脂的含量可以是5重量份、6重量份或7重量份；聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；甘油的含量可以是7重量份、9重量份、11重量份或13重量份；乙醇的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；伊立替康的含量可以是1.5重量份、2重量份、3重量份或3.5重量份。
[0036]作为本发明的优选，所述澄清透明溶液还含0.01-2重量份主动靶向材料X-PEG-DSPE，其中X表示叶酸 、五肽CRGDK或胆酸中的一种或多种。
[0037]作为本发明的优选，所述澄清透明溶液含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇、I~4重量份伊立替康和0.1-0.4重量份主动靶向材料X-PEG-DSPE，其中X表示叶酸、五肽CRGDK或胆酸。
[0038]具体实施中，所述澄清透明溶液中磷脂的含量可以是5重量份、6重量份或7重量份；聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；甘油的含量可以是7重量份、9重量份、11重量份或13重量份；乙醇的含量可以是12重量份、14重量份、16重量份或18重量份；伊立替康的含量可以是1.5重量份、2重量份、3重量份或3.5重量份；主动靶向材料X-PEG-DSPE的含量可以是0.02重量份、0.05重量份、
0.1重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.8重量份、1.2重量份、1.5重量份或1.8重量份。
[0039]需要说明，本发明述及“重量份”的地方一般是指除注射用水性溶剂以外的其它原料的重量比例关系。
[0040]本发明中，“任选的”的含义是指“包含或不包含”其所指的对象，例如“任选的主动靶向材料”意指“包含或不包含主动靶向材料”，“任选的防冻剂和/或PH调节剂”意指“包含或不包含防冻剂和/或PH调节剂”。
[0041]作为本发明的优选，所述注射用水性溶剂的体积是所述澄清透明溶液的5-100倍，例如6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、70倍、80倍或90倍，优选5-80倍，更优选10-20倍。
[0042]注射用水性溶剂的温度是本领域的技术人员可以根据经验确定的，一般室温即可，本发明所用的注射用水性溶剂的温度可以是0-80°C范围内的任意温度，优选0-40°C范围内的任意温度。
[0043]在第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的方法制备得到的伊立替康纳米脂束制剂，所述制剂通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给药。
[0044]为储存的方便，本发明制备得到的伊立替康纳米脂束制剂，可以选择冻干等再加工工艺进行后续处理，并不影响纳米脂束药物的再分散和使用，所涉及工艺可产业化生产，并直接应用于大批量药物生产开发。
[0045]本发明的有益效果为:本发明利用聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯的成胶束功能和对伊立替康的增溶功能，以及磷脂对聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯胶束的尺寸调节作用，结合简单的脂束前体制备工艺，配制出伊立替康纳米脂束制剂前体(即澄清透明溶液)；经自乳化过程后，实现伊立替康纳米脂束的制备；本发明制备的伊立替康纳米脂束的粒径分布均匀，作为脂束制剂能降低伊立替康的毒性、具有长循环效果、能增强肿瘤靶向富集作用和增加病人顺应性；本发明填补了伊立替康纳米脂束药物的空白，所发展的配方工艺简单、具高重复性可直接应用于伊立替康纳米药物的产业化生产。此外，在本发明的制剂加入主动靶向材料能够显著增强其在肿瘤中的富集效果。
【专利附图】
【附图说明】 [0046]图1为本发明伊立替康纳米脂束前体的制备及经自乳化过程后得到伊立替康纳米脂束制剂的过程示意图。
[0047]图2为本发明实施例1所得伊立替康纳米脂束制剂前体的光学照片，显示其为澄清透明溶液。
[0048]图3从左到右依次为经生理盐水、注射用水、葡萄糖注射液自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的光学照片，显示其为乳状液。
[0049]图4为本发明实施例1经生理盐水自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的动态光散射结果，显示其粒径均匀。
[0050]图5为本发明实施例1经生理盐水自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的透射电镜照片。
[0051]图6为本发明实施例9经注射用水自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的动态光散射结果，显示其粒径均匀。
[0052]图7为本发明实施例9经注射用水自乳化过程后冻干，再稀释后得到的伊立替康纳米脂束制剂的透射电镜照片。
[0053]图8为本发明实施例10经葡萄糖注射液自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的动态光散射结果，显示其粒径均匀。
[0054]图9为本发明实施例10经葡萄糖注射液自乳化过程后得到的伊立替康纳米脂束制剂的透射电镜照片。
[0055]图10为表面CRGDK靶向脂束药物在肿瘤部位的聚集情况，小动物成像显示与游离药物(荧光分子模拟(上))比较，脂束药物(实施例1制备)在肿瘤部位有明显的聚集(中间)，比较显示，CRGDK靶向脂束药物(实施例17制备)具有更加明显的肿瘤富集作用(下)。
[0056]图11为表面叶酸靶向脂束药物在的肿瘤药效学研究，光学照片显示，经30天治疗后，实施例18制备的叶酸靶向的脂束药物(右)治疗组的肿瘤与实施例1制备的脂束药物组(中)和游离药物组(左)相比最小，这表明叶酸靶向能增强脂束药物的治疗效果，原因在于叶酸靶向脂束药物具有更加增强的肿瘤富集效果。
【具体实施方式】
[0057]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0058]本发明制备伊立替康纳米脂束制剂的工艺过程示意图如图1所示，将伊立替康与磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油和乙醇(助剂)混合均匀配制成伊立替康纳米脂束药物前体，然后加入注射用水性溶剂进行自乳化得到伊立替康纳米脂束制剂。
[0059]实施例1
[0060]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0061]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0062]2、称取 0.5g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、1.8g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0063]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。图2显示:伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0064]二、伊立替康脂束制剂的制备[0065]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。图3中左侧试管显示伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0066]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0067]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。伊立替康脂束制剂的平均粒径为103.3nm。图4显示:伊立替康脂束制剂粒径分布均匀。
[0068]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜照片如图5所示，显示制备的伊立替康脂束制剂为粒径均匀的纳米颗粒。
[0069]实施例2
[0070]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0071]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0072]2、称取 0.2g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、1.8g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0073]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0074]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0075]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0076]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0077]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0078]实施例3
[0079]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0080]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。[0081]2、称取 0.8g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、1.8g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0082]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0083]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0084]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0085]三、伊立替康纳米制剂的粒径测定
[0086]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0087]实施例4
[0088]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0089]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0090]2、称取 0.5g 伊立替康、1.7g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、3.0g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0091]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0092]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0093]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0094]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0095]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0096]实施例5
[0097]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0098]称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)、0.5g伊立替康、2.8g无水乙醇、3.0g SolutolHS15 (德国BASF公司)和1.8g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0099]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0100]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0101]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定 [0102]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康纳米制剂的粒径。结果与图4类似。
[0103]实施例6
[0104]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0105]称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)、0.2g伊立替康、2.8g无水乙醇、3.0g SolutolHS15 (德国BASF公司)和1.8g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。[0106]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0107]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0108]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0109]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0110]实施例7
[0111]一、伊立替康脂束制剂前体的制备 [0112]称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)、0.8g伊立替康、2.8g无水乙醇、3.0g SolutolHS15 (德国BASF公司)和1.8g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0113]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0114]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0115]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0116]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0117]实施例8
[0118]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0119]称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)、0.5g伊立替康、1.7g无水乙醇、3.0g SolutolHS15 (德国BASF公司)和3.0g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0120]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0121]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0122]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0123]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康纳米制剂的粒径。伊立替康纳米制剂的平均粒径为105.9nm。结果与图4类似。
[0124]实施例9
[0125]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0126]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，加入3.0g Solutol HS15(德国BASF公司)，得到溶液A。
[0127]2、称取0.5g伊立替康、2.5g乙醇、1.8g甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0128]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0129]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0130]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的注射用水稀释，得到伊立替康脂束制剂。图3中中间试管显示伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0131]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定[0132]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。伊立替康脂束制剂的平均粒径为107.0nm。图6显示:伊立替康脂束制剂粒径分布均匀。
[0133]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜照片如图7所示，显示制备的伊立替康脂束制剂为粒径均匀的纳米颗粒。
[0134]实施例10
[0135]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0136]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0137]2、称取 0.5g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、3.0g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0138]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0139]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0140]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的葡萄糖注射液稀释，得到伊立替康脂束制剂。图3中右侧试管显示伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0141]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0142]用英国Malven仪器 公司的ZS90仪器检测伊立替康纳米制剂的粒径。图8显示:伊立替康脂束制剂粒径分布均匀。
[0143]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜照片如图9所示，显示制备的伊立替康脂束制剂为粒径均匀的纳米颗粒。
[0144]实施例11
[0145]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0146]1、称取Ig磷脂(德国Lipoid公司)和0.5g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0147]2、称取 0.25g 伊立替康、2g 乙醇、2.5g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、L 25g 甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0148]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0149]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0150]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用10倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0151]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0152]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图4类似。
[0153]实施例12
[0154]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0155]称取2g磷脂(德国Lipoid公司)、Ig伊立替康、5g无水乙醇、5g Solutol HS15(德国BASF公司)和3.75g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0156]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0157]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用80倍体积的注射用水稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中中间试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0158]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0159]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图6类似。
[0160]实施例13
[0161]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0162]称取1.5g磷脂(德国Lipoid公司)、0.6g伊立替康、3.5g无水乙醇、3.5g SolutolHS15 (德国BASF 公司)和2.8g甘油，搅拌溶解，得到溶液澄清透明的伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0163]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0164]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用5倍体积的葡萄糖注射液稀释，得到伊立替康脂束制剂。结果类似图3中右侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0165]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0166]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。结果与图8类似。
[0167]实施例14
[0168]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0169]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0170]2、称取 0.5g伊立替康、2.5g 乙醇、丙二醇 1.8g,朽1 檬酸0.01g, 3.0g Solutol HS15(德国BASF公司)、1.8g甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0171]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0172]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0173]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0174]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0175]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。伊立替康脂束制剂的平均粒径为108nm。伊立替康脂束制剂粒径分布均匀。
[0176]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜照片结果与图5类似，所制备的伊立替康药物脂束制剂粒径均匀。
[0177]实施例15
[0178]—、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0179]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0180]2、称取 0.5g 伊立替康、2.5g 乙醇、丙二醇 1.8g, Na2CO30.01g, 3.0g Solutol HS15(德国BASF公司)、1.8g甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0181]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0182]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0183]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0184]三、伊立替康脂束制剂的粒径测定
[0185]用英国Malven仪器公司的ZS90仪器检测伊立替康脂束制剂的粒径。
[0186]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜照片类似图5所示，制备的伊立替康脂束制剂为粒径均匀的药物颗粒。
[0187]实施例16
[0188]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0189]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0190]2、称取 0.5g伊立替康、2.5g 乙醇、丙二醇 1.8g,乙二胺 0.01g, 3.0g Solutol HS15(德国BASF公司)、1.8g甘油，常温溶解，得到溶液B。
[0191]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0192]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0193]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。结果类似图3中左侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0194]本实施例制备的伊立替康脂束制剂的透射电镜结果与图5类似，均为粒径均匀的纳米颗粒。
[0195]实施例17
[0196]一、伊立替康脂束制剂前体的制备
[0197]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0198]2、称取 0.5g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、1.8g 甘油，0.05g CRGDK-PEG-DSPE，常温溶解，得到溶液B。
[0199]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0200]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0201]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。结果类似图3中右侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0202]三、伊立替康脂束制剂的肿瘤靶向效果验证
[0203]小动物活体成像技术被用于研究表面CRGDK-PEG-DSPE靶向的伊立替康脂束药物在肿瘤部位的靶向聚集效果。具体实验方法如下所示:
[0204]按照实施例1的方法制备不带有CRGDK-PEG-DSPE靶向基团的伊立替康纳米脂束(配方中不含有CRGDK-PEG-DSPE)，配方中加入DiR染料乙醇溶液，用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米脂束注射剂B。
[0205]按照实施例17的方法制备的带有CRGDK-PEG-DSPE靶向基团的伊立替康纳米脂束，配方中加入DiR染料乙醇溶液，用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米脂束注射剂C。
[0206]伊立替康生理盐水溶液为注射剂A，其中加入了 DiR染料的乙醇溶液。
[0207]上述注射剂A、B和C中DiR染料的浓度控制相同。
[0208]取三只皮下荷瘤小鼠， 分别注射等体积的注射剂A、B和C，24小时后取出实体瘤，用多光谱小动物活体成像系统(CRI Maestro2)观察肿瘤处药物富集效果。图10显示了表面CRGDK-PEG-DSPE靶向脂束药物在肿瘤部位的聚集情况，小动物成像显示与游离药物(注射剂A)比较，脂束药物(注射剂B)在肿瘤部位有明显的聚集(中间)，比较显示，CRGDK-PEG-DSPE靶向脂束药物(注射剂C)具有更加明显的肿瘤富集作用(下)。图10说明:CRGDK-PEG-DSPE靶向功能的伊立替康脂束药物在肿瘤部位有更加明显的聚集，从而能够起到更好的治疗效果。
[0209]实施例18
[0210]一、伊立替康脂束制剂前体的制备 [0211]1、称取1.2g磷脂(德国Lipoid公司)和0.3g乙醇，溶解，得到溶液A。
[0212]2、称取 0.5g 伊立替康、2.5g 乙醇、3.0g Solutol HS15 (德国 BASF 公司)、1.8g 甘油，0.05g叶酸-PEG-DSPE，常温溶解，得到溶液B。
[0213]3、将溶液A和溶液B混合，室温搅拌、混匀，得到澄清透明伊立替康脂束制剂前体，氮气保护，密封保存。结果类似图2，伊立替康脂束制剂前体为澄清透明液体。
[0214]二、伊立替康脂束制剂的制备
[0215]将步骤一制备的伊立替康脂束制剂前体用20倍体积的生理盐水稀释，得到伊立替康纳米制剂。结果类似图3中右侧试管，伊立替康脂束制剂呈乳状液。
[0216]三、伊立替康脂束制剂的肿瘤靶向效果验证
[0217]药效学研究显示，叶酸-PEG-DSPE靶向的伊立替康脂束药物具有更好地肿瘤抑制效果。图11显示了表面叶酸-PEG-DSPE靶向脂束药物在的肿瘤药效学研究，光学照片显示，经30天治疗后，实施例18制备的叶酸-PEG-DSPE靶向的脂束药物(右)治疗组的肿瘤与实施例I制备的脂束药物组(中)和游离药物组(左)相比最小，这表明叶酸-PEG-DSPE靶向能增强脂束药物的治疗效果，原因在于叶酸-PEG-DSPE靶向脂束药物具有更加增强的肿瘤富集效果。图11说明:同样的时间治疗后，具有叶酸-PEG-DSPE靶向功能的伊立替康脂束药物能更好的的抑制肿瘤生长，即具有更好的治疗效果。
[0218]本发明通过上述实施例制备得到伊立替康纳米脂束制剂，作为脂束制剂它能降低伊立替康的毒性、具有长循环效果、能增强肿瘤靶向富集作用和增加病人顺应性。
[0219]以上详细描述了本发明的实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0220]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0221]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1.一种伊立替康纳米脂束制剂，包含磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康，及注射用水性溶剂。
2.根据权利要求1所述的伊立替康纳米脂束制剂，其特征在于，所述注射用水性溶剂选自生理盐水、葡萄糖注射液和注射用水中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的伊立替康纳米脂束制剂，其特征在于，所述制剂包含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇和I~4重量份伊立替康； 优选地，所述注射用水性溶剂的体积是所述磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康总体积的5-100倍，进一步优选5-80倍，更进一步优选10-20倍。
4.根据权利要求1-3任一项所述的伊立替康纳米脂束制剂，其特征在于，所述制剂还包含主动靶向材料； 优选地，所述主动靶向材料为X-PEG-DSPE，其中X表示叶酸、五肽CRGDK或胆酸中的一种或多种，PEG表示聚乙二醇，DSPE表示二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺； 优选地，所述制剂中主动靶向材料X-PEG-DSPE的含量为0.01-2重量份，更优选0.1-1重量份，最优选0.1-0.4重量份； 优选地，所述制剂还包 含防冻剂和/或PH调节剂；其中所述防冻剂选自丙二醇和山梨糖醇；所述PH调节剂选自柠檬酸、乳酸、Na2CO3^ NaOH, NH4C1、NaHCO3和Ca(0H)2。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的伊立替康纳米脂束制剂的方法，包括: (1)将磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或PH调节剂混合，配成澄清透明溶液； (2)用注射用水性溶剂稀释所述澄清透明溶液，自乳化得到所述伊立替康纳米脂束制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为: (Ia)将磷脂与乙醇混合溶解，配成第一溶液； (Ib)将聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或PH调节剂混合溶解，配成第二溶液； (Ic)将所述第一溶液与所述第二溶液混合，搅拌混匀得到所述澄清透明溶液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为: 将磷脂、聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、甘油、乙醇和伊立替康以及任选的主动靶向材料、任选的防冻剂和/或PH调节剂混合，搅拌混匀配成澄清透明溶液。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述注射用水性溶剂选自生理盐水、葡萄糖注射液和注射用水中的一种或多种。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述澄清透明溶液含4~8重量份磷脂、10~20重量份聚乙二醇-十二羟基硬脂酸酯、5~15重量份甘油、10~20重量份乙醇和I~4重量份伊立替康； 优选地，所述澄清透明溶液还含0.01-2重量份主动靶向材料X-PEG-DSPE，其中X表示叶酸、五肽CRGDK或胆酸中的一种或多种； 优选地，所述注射用水性溶剂的体积是所述澄清透明溶液的5-100倍，优选5-80倍，更优选10-20倍。
10.一种根据权利要求5-9任一项所述的方法制备得到的伊立替康纳米脂束制剂，其特征在于，所述制剂通过静脉注射、肌肉注射或皮下注射给药。
【文档编号】A61K31/4745GK103735504SQ201410014128
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】梁兴杰, 赵元元, 柳娟, 李盛亮, 薛向东, 陈飞, 金叔宾, 张吉梅, 李鸿基, 甘雅玲, 姜永刚 申请人:国家纳米科学中心