一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用，本发明的针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白，为含有人乳头瘤病毒16亚型E7原癌蛋白(HPV16E7)的蛋白，本发明还进一步公开了一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的基因组中整合有密码子优化的HPV16E7的编码基因。本发明的融合蛋白或其编码基因或重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌可用于制备宫颈癌疫苗。
【专利说明】一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种针对宫颈癌具有免疫原性的融合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]宫颈癌居于全球女性癌症发病率的第二位，是重要的公共健康问题。全球每年新发宫颈癌病例约50万，有27.3万人死于宫颈癌，其中约85%死亡病例发生在发展中国家，中国每年新增宫颈癌病例约有13.5万，占全球新发病例的1/3，因此中国也是宫颈癌高发国之一。当前，人乳头瘤病毒(HPV)已被证实是引起宫颈癌的主要病原，至少在99%宫颈癌患者组织内检测到HPV DNA。
[0003]依据HPV的致癌危险性，分类为低危型和高危型。高度致癌危险的病毒主要包括HPV16、18、26、31、33、35、45、51、52、56、66等亚型，通常在高度鳞状上皮内病变(CIN2~3)中发现。其中HPV16、18可在绝大多数宫颈癌中发现，并且50%以上的宫颈癌患者由HPV16引起。2008年6月，历时5年的《中国妇女人乳头瘤病毒感染和宫颈癌流行病学调查》结果显示，HPV16和HPV18是导致中国妇女患子宫颈癌的最主要类型。
[0004]E7蛋白可以抑制Rb (retinoblastoma gene)的抑癌功能,从而以多种方式扰乱正常细胞周期，引起细胞周期的失控，导致细胞的过度增殖，细胞转化及恶变。E7是维持细胞转化和恶性癌变所必需的，因此E7常作为HPV血清学诊断抗原和宫颈癌治疗性疫苗研究的革巴抗原。
[0005]单核细胞增生性李斯特菌(Lm)是一种宿主谱广泛的兼性胞内菌。Lm被巨噬细胞和其它吞噬细胞吞噬后，既能存在于吞噬体内，又能定居在细胞胞浆中，使Lm运送的外源抗原可以同时进入MHC I类和MHC II类抗原提呈途径，从而诱导强烈的⑶4+T细胞和⑶8+T细胞免疫应答。这种独特的胞内生活史，使单增李斯特菌成为研究宿主和细菌相互作用及宿主免疫应答的模式细菌，尤其诱导强烈的CD8+T细胞免疫应答，其作为传染性疾病和肿瘤疾病疫苗载体具有广阔应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有宫颈癌免疫原性的融合蛋白及其应用。
[0007]本发明一方面提供了一种密码子优化的HPV16E7蛋白。
[0008]所述密码子优化的HPV16E7蛋白的氨基酸序列如SEQID.1所示:编码HPV16E7蛋白的基因序列为李斯特菌密码子偏好的基因序列，如SEQ ID.6所示。
[0009]本发明还公开了一种含有所述HPV16E7蛋白的融合蛋白
[0010]进一步的，所述融合蛋白为单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO与密码子优化的HPV16E7的融合蛋白。
[0011]所述单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列如SEQ ID.2所示:[0012]所述融合蛋白中，密码子优化的HPV16E7蛋白插入于前述单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸残基之间，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。
[0013]所述融合蛋白针对宫颈癌具有较强的免疫原性。
[0014]本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。
[0015]本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0016]本发明第三方面提供了一种载体，其含有所述多核苷酸。
[0017]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。
[0018]较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体PMD-20T、穿梭质粒pKSV7
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[0019]本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。
[0020]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0，COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0021]其中，特别优选单核细胞增生性李斯特细菌(Listeria monocytogenes,以下简写为 LM),如 yzuLM4 等。
[0022]本发明第五方面提供了一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的基因组中，整合有密码子优化的HPV16E7基因，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌能融合表达单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO与HPV16E7融合蛋白。
[0023]进一步的，所述编码HPV16E7蛋白的基因重组整合于野生型单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中hly基因的111位与154位碱基之间。
[0024]进一步的，相比野生型单核细胞增生李斯特菌，本发明将野生型单核细胞增生李斯特菌hly基因的第112-153位碱基替换为HPV16E7基因SEQ ID.6。亦即，本发明的重组减毒单核细胞增生李斯特菌中，野生型的hly编码基因被替换成了序列为3的融合蛋白的编码基因。
[0025]本发明第六方面公开了所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的构建方法，包括下列步骤:
[0026]I)从公司合成密码子优化的HPV16E7蛋白编码基因片段；从单核细胞增生李斯特菌株中扩增出待插入位点的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ；
[0027]2)将步骤I)获得的密码子优化的HPV16E7编码基因及上下游同源臂片段拼接成hIya-HPV16E7-hIyb融合片段并连接入穿梭质粒获得重组穿梭质粒；
[0028]3)将步骤2)获得的重组穿梭质粒转化单核细胞增生性李斯特细菌，经过抗性和温度双压力筛选，再通过无抗性传代得到无抗性基因的重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌。
[0029]进一步的，步骤I)中，扩增获得的上游同源臂片段hlya的序列为SEQ ID.4:[0030]下游同源臂片段hlyb的序列为SEQ ID.5:HPV16E7基因为SEQ ID.6:
[0031]进一步的，步骤I)和3)中所述单核细胞增生李斯特菌株为单核细胞增生李斯特菌株 yzuLM4。
[0032]进一步的，步骤2)可采用重叠衍生PCR技术(SOEing PCR)拼接各片段，再利用酶切位点将拼接片段插入穿梭载体中。
[0033]进一步的,步骤2)中，穿梭质粒可为pKSV7。拼接成的hlya-E7_hlyb融合片段的序列为SEQ ID.7。
[0034]本发明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因或所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌在制备宫颈癌疾病疫苗上的用途。
[0035]进一步的,所述重组细菌疫苗为针对宫颈癌疾病的治疗性疫苗。
[0036]本发明第七方面，提供了一种疫苗，包括所述融合蛋白或所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌。
[0037]所述疫苗中还可进一步包括佐剂。
[0038]本发明利用单核细胞增生李斯特菌能在细胞吞噬体内存活，同时也能从细胞吞噬体中“逃逸”出来,进入细胞质繁殖,诱发机体产生强烈的CD8+T细胞免疫应答的特性。利用同源重组技术，将外源融合蛋白基因定点插入到载体生物基因组中。由此提供的融合表达HPV16E7抗原的疫苗能有效提高宿主对宫颈癌疾病的免疫保护效应，为宫颈癌疫苗提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1 是 pKSV7-hlya-E7-hlyb 的 Xba I 与 Kpn I 双酶切及 PCR 电泳图；
[0040]Μ: λ -14Marker
[0041]L:DL2000Marker
[0042]I:PCR 结果
[0043]2:pKSV7-E7_hly 双酶切结果。
[0044]图2是重组细菌的鉴定结果；
[0045]1:DL2000Marker
[0046]2:LM4Ahly:: E7-1PCR 产物。
[0047]图3是蛋白水平检测目的基因的表达
[0048]M:预染 marker
[0049]123:Lm4 Ahly:: E7-1 的分泌蛋白
[0050]4:LM4的分泌蛋白。
[0051]图4是分泌融合蛋白LL0-HPV16E7的溶血活性检验
[0052]PBS = PBS 对照组
[0053]LM4:单核细胞增生李斯特菌yzuLM4组
[0054]Lm4 Δ hly::E7_1:重组减毒菌组。
[0055]图5是重组菌对C57BL/6小鼠诱导产生的细胞因子的结果。
[0056]PBS:阴性对照组
[0057]rLm4:重组减毒菌 LM4Ahly:: E7-1 组。[0058]图6是二次免疫后小鼠肿瘤大小。
[0059]PBS:阴性对照组
[0060]实验组:LM4Λ hly:: E7-1 组
[0061]LM4 组。
【具体实施方式】
[0062]本发明实施例采用了下列技术方案:
[0063]首先，从公司合 成密码子优化的HPV16E7基因序列，从单核细胞增生李斯特菌株yzuLM4中扩增出hly上游片段和下游片段，经胶回收后得到的hIya-HPV16E7_hIyb融合片段与PMD-20T (TaKaRa公司)载体连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确的阳性克隆送至南京金斯瑞公司并测序；将测序正确的阳性克隆进行提取质粒，进而双酶切，回收目的片段，再与穿梭载体PKSV7连接，转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确，将阳性质粒电转化至yzuLM4感受态细胞，通过抗性和温度双压力筛选，再通过无抗性传代得到无抗性基因的同源重组单核细胞增生李斯特菌。该菌为一种重组减毒菌LM4Ahly:: E7_l。该菌可在正常生活情况下表达E7-LL0蛋白。
[0064]构建重组减毒菌具体方法主要包括下列步骤:
[0065]1.用PCR技术扩增出目的基因E7以及hly基因待插入位点的上下游同源片段hlya、hlyb。所用到的引物如下:
[0066]
【权利要求】
1.一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白，为在减毒重组李斯特菌中分泌表达的HPV16E7的蛋白。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，为李斯特菌密码子偏好的基因序列，其序列如SEQ ID.6所示。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO与HPV16E7的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。
4.一种重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，其特征在于该重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌的基因组中，整合有HPV16E7的基因，所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌能融合表达单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO与HPV16E7的融合蛋白。
5.如权利要求4所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌，其特征在于，编码HPV16E7的基因重组整合于野生型单 核细胞增生李斯特菌基因组DNA中hly基因的111位与154位碱基之间。
6.一种疫苗，包括权利要求3所述融合蛋白或权利要求4或5所述重组减毒单核细胞增生性李斯特细菌。
【文档编号】A61K39/02GK103739682SQ201410017908
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】焦新安, 殷月兰, 段斐斐, 潘志明, 陈祥, 孙林, 黄金林 申请人:扬州大学