一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架，包括软骨层和软骨下骨层，所述软骨层与软骨下骨层通过光聚合的改性透明质酸凝胶结合为一体，所述软骨层的材料为载有转化软骨细胞的光聚合的改性透明质酸凝胶，所述软骨下骨层的材料为多孔生物玻璃支架。本发明还公开了一种上述组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法：将具有光聚合的改性透明质酸凝胶与体外诱导转化软骨细胞混合均匀后，经紫外聚合形成混合凝胶；将多孔生物玻璃支架放置在混合凝胶上，加入具有光聚合的改性透明质酸凝胶，光照交联后得到组织工程骨软骨修复的双层复合支架。该产品具有良好的生物相容性，可以降解，制备方法简单。
【专利说明】一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于骨软骨组织工程支架【技术领域】，尤其涉及一种用于骨软骨修复的支架结构及其制备方法。
【背景技术】[0002]61%的成人膝盖存在关节软骨缺损；其中，19%是骨软骨缺损。关节软骨自身修复能力有限，一旦受损便难于恢复。目前常规的治疗方式包括自体软骨移植，自体或异体骨软骨移植。这些治疗手段存在一定的局限性，例如软骨移植来源有限，供区功能受损，免疫排斥，植入体松动等。随着组织工程技术的出现，骨软骨修复的研究得到了很大的发展。构建骨软骨组织工程支架需要细胞，软骨细胞外基质和软骨下骨。从自体或异体提取的软骨细胞广泛应用于组织工程软骨修复中，但是软骨数量有限，只占软骨组织的5~10%，因此使用前需要体外繁殖。但是，软骨细胞在体外单层培养时会出现去分化。目前有较多人工合成的高分子材料用作软骨细胞外基质，如聚乙二醇(PEG)，聚-α -羟基酯、聚NiPAAm、聚丙烯-反丁烯二酸、聚丙烯反丁烯二酸、聚氨酯聚氨基甲酸酯等，他们的主要特点是具有可塑性，有一定的强度，但在生物相容性、理化性能、降解速率的控制方面上有许多问题有待解决。软骨下骨层多用多孔钛合金支架，它具有较高的强度，良好的生物相容性，但是在体内不能降解。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术中软骨修复材料生物相容性差、难以降解的缺陷，本发明的目的是提供一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架；具有良好的生物相容性，其中的改性透明质酸具有光聚合性，同时在体内透明质酸分解酶的作用下可以降解，降解产物也不具有生物毒性。改性透明质酸水凝胶可与细胞均匀混合，经紫外光聚合后，形成透明质酸与细胞的混合凝胶；软骨层中的软骨细胞来源广泛。软骨下骨层材料为三维打印的具有高强度的多孔生物玻璃支架，其强度高可用于承重部位的软骨下骨修复。生物玻璃可在体内降解，转化为类骨质羟基磷灰石，具有良好的骨传导性，在骨修复领域已被广泛研究；生物玻璃在降解过程中，释放玻璃组分中的各种元素，可刺激骨软骨修复。
[0004]本发明的另一个目的是提供一种上述组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，该方法简单，支架可根据具体尺寸结构要求进行制作。
[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0006]本发明提供了一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架，包括软骨层和软骨下骨层，所述软骨层与软骨下骨层通过光聚合的改性透明质酸凝胶结合为一体，所述软骨层的材料为载有转化软骨细胞的光聚合的改性透明质酸凝胶，所述软骨下骨层的材料为多孔生物玻璃支架。
[0007]其中，所述转化软骨细胞的密度较佳地为5 X IO6~IX 108/mL。
[0008]其中，所述转化软骨细胞较佳地是由骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或成纤维细胞诱导转化而得。
[0009]所述转化软骨细胞更佳地为体外培养原代至第四代的自体或同种异体骨髓间充质干细胞诱导转化的软骨细胞。
[0010]在本发明的一较佳实施方式中，所述软骨层还可添加或复合骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞、生长因子或转基因成分中的一种或一种以上，以保持软骨细胞和基质合成能力。
[0011]其中，所述多孔生物玻璃支架较佳地包括多孔硅酸盐生物玻璃支架、多孔硼硅酸盐生物玻璃支架或多孔硼酸盐生物玻璃支架；所述多孔生物玻璃支架中更佳地还含有添加微量的Cu、Zn、Ba、Sr、Ag、Fe、F或Mn中的一种或一种以上。所述的多孔生物玻璃支架的强度较佳地为50~lOOMPa，孔隙率较佳地为45~75%，孔径较佳地为100~300 μ m。
[0012]本发明还提供了一种上述组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，包括以下步骤:将具有光聚合的改性透明质酸凝胶与体外诱导转化软骨细胞混合均匀后，经紫外聚合形成混合凝胶；将多孔生物玻璃支架放置在混合凝胶上，加入具有光聚合的改性透明质酸凝胶，光照交联后得到组织工程骨软骨修复的双层复合支架。
[0013]其中，所述光聚合的改性透明质酸凝胶较佳地由下述制备方法制得:将质量浓度为I~5%的透明质酸钠水溶液在冰点进行搅拌溶解后再与甲基丙烯酸酐混合，所述甲基丙烯酸酐的浓度为透明质酸钠摩尔浓度的20倍，调节pH使pH值始终大于8，冰点搅拌反应24小时，放入透析膜内用50倍体积的去离子水透析3天，冷冻干燥48小时后再与生理盐水和交联剂12959混合得到光聚合的改性透明质酸凝胶。
[0014]其中，所述透明 质酸钠的浓度较佳地为2wt%。
[0015]其中，所述透明质酸钠的分子量较佳地为66~90千道尔顿。
[0016]其中，所述具有光聚合的改性透明质酸凝胶中改性透明质酸的浓度较佳地为
0.05wt%o
[0017]其中，所述交联剂12959的浓度较佳地为0.05wt%。
[0018]其中，所述转化软骨细胞或所述光聚合的改性透明质酸凝胶的个数体积比例较佳地为 40X107mL。
[0019]其中，所述紫外聚合的方法较佳地为紫外灯照射，波长较佳地为320~400nm，强度较佳地为8900 μ W / cm2~21700 yff / cm2,照射高度较佳地为5~25cm，时间较佳地为5~15分钟。
[0020]其中，所述光照交联的方法较佳地为紫外灯照射，波长较佳地为320~400nm，强度较佳地为8900 μ W / cm2~21700 yff / cm2,照射高度较佳地为5~25cm，时间较佳地为5~15分钟。
[0021]本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果:
[0022]本发明的组织工程骨软骨修复的双层复合支架具有良好的生物相容性，其中的改性透明质酸具有光聚合性，同时在体内透明质酸分解酶的作用下可以降解，降解产物也不具有生物毒性；改性透明质酸凝胶可与细胞均匀混合，经紫外光聚合后，形成透明质酸与细胞的混合凝胶；软骨层中的软骨细胞来源广泛；软骨下骨层材料为三维打印的具有高强度的多孔生物玻璃支架，其强度高可用于承重部位的软骨下骨修复；生物玻璃可在体内降解，转化为类骨质羟基磷灰石，具有良好的骨传导性，在骨修复领域已被广泛研究；生物玻璃在降解过程中，释放玻璃组分中的各种元素，可刺激骨软骨修复。
[0023]本发明制备组织工程骨软骨修复的双层复合支架的方法简单，支架可根据具体尺寸结构要求进行制作。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为实施例1所示的组织工程骨软骨修复的双层复合支架的结构示意图。
[0025]图2为实施例4所示的组织工程骨软骨修复的双层复合支架体外培养4周后的死活细胞图。
[0026]图3为实施例4所示的组织工程骨软骨修复的双层复合支架体外培养4周后的Safranin O 染色图。
[0027]图4为实施例4所示的组织工程骨软骨修复的双层复合支架体外培养4周后的Picrosirius red 染色图。
[0028]图5为实施例7所示的组织工程骨软骨修复的双层复合支架在体内12周后的甲苯胺蓝染色照片。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图所示实施例对本发明作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中，所用的交联剂 12959 购自于 Ciba, Tarrytown, NY。
[0030]下述实施例中，硅酸盐生物玻璃，硼硅酸盐玻璃生物玻璃，硼酸盐生物玻璃，微量元素添加的硅酸盐生物玻璃，微量元素添加的硼硅酸盐生物玻璃和微量元素添加的硼酸盐生物玻璃均可通过传统熔融法制备获得。多孔生物玻璃支架可选用利用现有多孔支架制备技术制备获得的多孔生物玻璃支架，硅酸盐生物玻璃多孔支架更优选制备步骤可参考文献“Fu, Q.，E.Saiz, and A.P.Tomsia, Direct ink writing of highly porous and strongglass scaffolds for load-bearing bone defects repair and regeneration.ACTA BIOMATERIALIA, 2011.7(10):p.3547-3554.”。具体步骤如下:用湿磨法将硅酸盐生物玻璃颗粒磨成粒径为I~3 μ m的玻璃粉末。将40% (体积百分比)的玻璃粉末充分分散在20% (重量百分比)的Pluronic F-127溶胶中，形成玻璃粉混料。将玻璃粉混料装入3mL针筒中，安装入三维打印机中(3D Inks，A3200-Npaq, Sti I lwater, OK)，在电脑软件(RoboCAD3.0 )中设计好支架的三维尺寸、孔径大小后进行打印。
[0031]硼酸盐生物玻璃和硼硅酸盐生物玻璃支架优选采用如下方法制备得到:将30~50% (体积百分比)的玻璃粉末充分分散在含5%~6% (体积百分比)乙基纤维素和8%~10% (体积百分比)PEG300的乙醇混合液中，混合均匀形成玻璃粉混料。将玻璃粉混料装入3mL针筒中，安装入三维打印机中(3D Inks, A3200-Npaq, Stillwater, OK),在电脑软件(RoboCAD3.0)中设计好支架的三维尺寸、孔径大小后进行打印。
[0032]打印的支架在60°C干燥过夜，依据表1的升温制度在空气炉进行预烧，随后在560~710°C烧结I小时，得到多孔生物玻璃支架。
[0033]表1升温制度
[0034]
【权利要求】
1.一种组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:包括软骨层和软骨下骨层，所述软骨层与软骨下骨层通过光聚合的改性透明质酸凝胶结合为一体，所述软骨层的材料为载有转化软骨细胞的光聚合的改性透明质酸凝胶，所述软骨下骨层的材料为多孔生物玻璃支架。
2.根据权利要求1所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:所述转化软骨细胞的密度为5 X IO6~I X 108/mL。
3.根据权利要求1所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:所述转化软骨细胞是由骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞和/或成纤维细胞诱导转化而得。
4.根据权利要求1所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:所述转化软骨细胞为体外培养原代至第四代的自体和/或同种异体骨髓间充质干细胞诱导转化的软骨细胞。
5.根据权利要求1所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:所述软骨层可添加或复合骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞、生长因子或转基因成分中的一种或一种以上。
6.根据权利要求1所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架，其特征在于:所述多孔生物玻璃支架包括多孔硅酸盐生物玻璃支架、多孔硼硅酸盐生物玻璃支架或多孔硼酸盐生物玻璃支架；在组成中添加微量的Cu、Zn、Ba、Sr、Ag、Fe、F或Mn中的一种或一种以上； 或所述多孔生物玻璃支架采用水基和/或有机相进行制备； 或所述多孔生物玻璃支架的强度为10~lOOMPa，孔隙率为45~75%，孔径为100~500 μ m。`
7.—种权利要求1至6任一所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:将具有光聚合的改性透明质酸凝胶与体外诱导转化软骨细胞混合均匀后，经紫外聚合形成混合凝胶；将多孔生物玻璃支架放置在混合凝胶上，加入具有光聚合的改性透明质酸凝胶，光照交联后得到组织工程骨软骨修复的双层复合支架。
8.根据权利要求7所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，其特征在于:所述光聚合的改性透明质酸凝胶的制备方法包括以下步骤:将质量浓度为I~5%的透明质酸钠水溶液在冰点进行搅拌溶解后再与甲基丙烯酸酐混合，所述甲基丙烯酸酐的浓度为透明质酸钠摩尔浓度的20倍，调节pH使pH值始终大于8，冰点搅拌反应24小时，放入透析膜内用50倍体积的去离子水透析3天，冷冻干燥48小时后再与生理盐水和交联剂12959混合得到光聚合的改性透明质酸凝胶。
9.根据权利要求8所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，其特征在于:所述透明质酸钠的浓度为2wt%。
10.根据权利要求8所述的组织工程骨软骨修复的双层复合支架的制备方法，其特征在于:所述透明质酸钠的分子量为66~90千道尔顿； 或所述具有光聚合的改性透明质酸凝胶中改性透明质酸的浓度为0.05wt% ； 或所述交联剂12959的浓度为0.05wt% ； 或所述转化软骨细胞或所述光聚合的改性透明质酸凝胶的个数体积比例为40X IO6/mL ；或所述紫外聚合的方法为紫外灯照射，波长320~400nm，强度为8900 μ W / cm2~.21700 μ W / cm2,照射高度5~25cm，时间为5~15分钟； 或所述光照交联的方法为紫外灯照射，波长320~400nm，强度为8900 μ W / cm2~.21700 μ W / cm2,照射高度5~25cm，时间为5~15分钟。
【文档编号】A61L27/38GK103877614SQ201410066627
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】黄文旵, 顾刈非, 周萘, 王德平 申请人:同济大学