丹酚酸a在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于制药【技术领域】，具体涉及丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病及HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。本发明用HIV-1Tat蛋白损伤类神经细胞系PC12和小鼠脑片上的神经细胞，用不同浓度的丹酚酸A进行保护，分别用MTT实验、LDH检测和Tunel实验检测丹酚酸A减少Tat蛋白所致神经细胞死亡的效果；用Dil金颗粒散射标记树突棘，检测丹酚酸A减少Tat蛋白损伤神经突触连接功能的效果。通过实验结果的统计学分析，发现丹酚酸A对Tat蛋白所致的神经细胞损伤具有很好的保护效果，可用于制备预防和治疗Tat蛋白所致神经损伤及艾滋病脑病的药物。
【专利说明】丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于制药【技术领域】，涉及传统中药丹参的水溶性成分丹酚酸A的一个新用途，即丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用，尤其是在预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。
【背景技术】
[0002]艾滋病脑病，现又称为HIV相关神经认知功能紊乱(HAND，HIV-assotiatedneurocognitive disorders),以运动、行为和认知障碍为特征，近期根据病情严重程度被分为三种形式:无症状神经认知功能损伤(Asymptomatic neurocognitiveimpairment, ANI),轻度神经认知功能紊乱(mild neurocognitive disorder, MND)和HIV相关痴呆(HIV associated dementia, HAD)。
[0003]HIV-1造成神经损伤的详细机制有待深入研究，但可以肯定的是HIV-1具有神经毒性的蛋白通过直接或间接的形式损伤神经元，是HAND发病的根本原因。HIV在感染15天后就可进入CNS (central nervous system, CNS),穿越血脑屏障的单核细胞释放病毒颗粒，然后感染脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞。与CNS病毒载量相比，HAD症状与神经兀丢失、损伤关系更紧密(Kaul M, HIV-1 infection and AIDS: consequencesfor the central nervous system.[J].Cell Death Differ 2005; 12 (Suppl I))，其损伤可分为直接损伤和间接损伤。直接损伤指HIV蛋白可以直接诱导神经元凋亡，减少神经树突和树突棘数量、损伤突触连接；间接损伤指由HIV感染的小胶质细胞或星形胶质细胞损伤神经兀功 能和神经再生(Kathryn A.HIV-Associated NeurocognitiveDisorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities.J neurimmune pharamac,2010,5:294-309; Hazleton JE.Novel mechanisms of central nervous systemdamage in HIV infection.HIV AIDS (Auckl).2010，2:39-49)。神经再生与 HAND 发生也有关系；宿主因素对HAND发生也有影响。
[0004]Tat是HIV-1基因组编码的蛋白，具有神经毒性，是诱导HAND发生的重要因素。Tat可以通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体诱导神经元凋亡(Eugenin EA.HIV-tatinduces formation of an LRP-PSD-95-NMDAR-nN0S complex that promotes apoptosisin neurons and astrocytes.Proc Natl Acad Sc1.2007,104(9):3438 - 3443) ;Tat 还可以诱导星形胶质细胞凋亡，而星形胶质细胞对神经元有支持、营养和保护作用，其丢失和无能对神经损伤有重要作用；另外，Tat和HIV编码的Gpl20蛋白还能够刺激小胶质细胞和星形胶质细胞释放TNF-a、IL-1 β破坏血脑屏障使更多的病毒或感染细胞进入脑内。Gpl20且能通过神经元表面的CXCR4和CCR5直接诱导其凋亡；HIV的LTR、Nef、Vpr都有神经毒性，但现有研究结果表明其神经毒性可能远小于Tat和Gpl20 (Jayadev S.Host and viral factors influencing the pathogenesis of HIV-associatedneurocognitive disorders.J Neuroimmune Pharmacol.2009,4(2):175-89)。
[0005]在高效抗反转录病毒治疗(highlyactive antiretroviral therapy, HAART)推广前，15%HIV晚期感染者发生HAD，50%以上感染者发生某种形式HANDt5HARRT治疗被广泛应用后，仍有50%感染者发生HAND。2010年针对1555名HIV感染者的调查表明，排除严重复合病例，ANI 发病率为 33%, MND 12%, HAD 2%(Heaton RK.HIV-associated neurocognitivedisorders persist in the era of potent antiretroviral therapy: CHARTERStudy.Neurology.2010，75 (23): 2087-2096)。HAART 治疗降低了 HAD 发生率，但确诊后其死亡率很高(Lescure FX.1ncidence and impact on mortality of severeneurocognitive disorders in persons with and without HIV infection: aDanish nationwide cohort study.Clin Infect Dis.2011，52 (2): 235-43),是艾滋病死亡一个独立的重要危险因素。在澳大利亚的调查表明，1993-1995年，HAD确诊后患者的平均生存期为11.9个月，中国患者HAD确诊后，平均生存期仅为4.7个月。
[0006]HARRT治疗延长了 HIV感染者的生命，但感染者生命的延长以及数量的增加也使HAND患者数量逐步增加。目前，HAND仍没有特异、有效的治疗药物。为了延长HIV感染者生命、改善HIV感染者生活质量,必须针对感染所致神经损伤研发特异性药物。许多学者认为虽然有效HARRT治疗是必需的，但应辅以针对神经功能紊乱的治疗(KathrynA.HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis and TherapeuticOpportunities.J neurimmune pharamac,2010,5:294-309)。虽然已有新药用于HAND临床试验，有的效果令人失望，有的仍在实验进行(Kathryn A.HIV-AssociatedNeurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities.Jneurimmune pharamac,2010,5:294-309)。
[0007]PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株，是一种类神经元细胞系，具有与神经元类似的生长特性，常用于神经退行性疾病的药物筛选、效果评价及机制研究。
[0008]丹酚酸A是传统中药丹参的主要水溶性成分，能够显著清除氧自由基活性。中药丹参(JMvia mi It 1rrhiza )为唇形科鼠尾草属植物干燥的根及根茎，性微苦微寒，主要具有组织再生，活气化瘀、保肝消痛、安神宁心等功效。现代药理学研究表明:丹参具有清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，发挥抗氧化作用。丹参的活性成分包括脂溶性的丹参酮1、丹参酮II A、丹 参酮II B、红根草邻醌及丹参二醇和水溶性成分丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛
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[0009]目前，虽有丹参和丹酚酸C抗HIV效果的报道，但未见丹酚酸A抗HIV的文献。另外，抗HIV是指控制HIV在细胞内的复制以及在细胞间传播，这和本发明专利申请防治HIV所编码蛋白的神经毒性有根本不同。HIV是一种反转录病毒，可以整合到宿主细胞的基因组上，即使在病毒不复制时，甚至不存在具有感染能力的病毒颗粒时，其整合到宿主细胞基因组上的基因依然可以表达具有神经毒性的病毒蛋白，导致不同形式的HAND，而至今人们还没有找到能够清除整合有HIV基因组细胞的药物。由以上分析可以看出，HIV感染和HAND虽然有联系，但HAND有其独立的致病因素和发病机制，是一相对独立的神经识别与记忆障碍疾病，减少HIV Tat蛋白的神经毒性将能够在一定程度上治疗HAND。有关丹参或丹酚酸A对HIV-1 Tat蛋白所致神经损伤的保护或在HAND治疗中的应用至今国内外并无相关报道。
【发明内容】
[0010]本发明目的在于提供一种丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用，尤其是在预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。
[0011]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用。
[0012]进一步优选的，所述丹酚酸A在制备预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。
[0013]本发明的创新点在于发现了传统中药丹参水溶性成分丹酚酸A的一种新用途，其对HIV-1编码Tat蛋白所致神经损伤具有保护作用，可用于制备预防和治疗HAND的药物和保健品。
[0014]本发明用HIV-1Tat蛋白损伤类神经细胞系PC12和小鼠脑片上的神经细胞，用不同浓度的丹酚酸A进行保护，分别用MTT实验、LDH检测和Tunel标记实验检测丹酚酸A减少Tat蛋白所致神经元死亡的效果；用Dil金颗粒散射标记树突棘，检测丹酚酸A减少Tat蛋白损伤神经突触连接功能的效果。通过对对照组、Tat蛋白损伤组和丹酚酸A药物保护组实验结果的统计学分析，发现丹酚酸A对Tat蛋白所致的神经细胞损伤具有很好的保护效果，而丹参酮II A却没有该保护效果。
[0015]中国专利“丹酚酸A冻干粉针用于制备抑制脑组织神经元损伤或死亡药物的用途”(申请号201210488012.4)中提到:丹参的水溶性成分丹酚酸A能够对脑血栓或脑血栓再灌注所致神经元的凋亡具有保护功能，然而该专利主要以人为制造脑血栓及脑血栓再灌注为模型，其所致神经损伤的机制在于脑血栓所致缺血、缺氧和出血。本专利申请与其不同在于:I) Tat蛋白所致神经损伤机制及HAND发病机制与脑血栓所致神经损伤机制不同。脑血栓的诱因很多，形成栓塞的机制复杂，但其损伤神经的机制却较为明确，如同其申请书所述在于缺血、缺氧与出血；而Tat蛋白神经损伤及HAND发病机制非常复杂，至今未明，但显然和缺血缺氧所致神经损伤不同，如HAND发病与HIV蛋白影响神经元再生有关，与诱导胶质细胞凋亡也有关系。2)中国专利申请201210488012.4针对的是多因素导致的一种共同病理现象；本专利申请所述丹酚酸A的新用途具有明确的作用靶点和疾病种类。3)至今没有证据证明，HIV Tat蛋白或其他HIV蛋白能够导致脑血栓并进而损伤脑神经。4)本专利申请发现丹酚酸A可以增加被Tat蛋白减少的树突棘数量，保护突触连接功能；而中国专利申请201210488012.4仅仅以脑血栓缺血和再灌注所致神经损伤为模型，检测对其所致神经元凋亡的保护，没有对增加树突棘数量和保护突触连接功能进行分析。基于以上分析，可以发现虽然本发明专利申请与中国专利申请书201210488012.4均与丹酚酸A有关，但本申请却是丹酚酸A另外一个完全不同的新药用功能。
[0016]艾滋病脑病(HAND)是世界公认的一个重大医学课题，其发病机制、诊断和治疗的研究都具有重要意义。本发明发现我国传统中药丹参的水溶性成份丹酚酸A对该病具有较好的治疗效果，将有可能在一定程度上解决这一重大问题，具有国际意义。如能公开并授权，将再次显示我国传统中药的优势和独特之处。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为丹酚酸A、丹参酮II A对PC12细胞存活的影响(无士S，/?=3);
图2为不同浓度丹酚酸A、丹参酮II A对Tat蛋白所致PC12细胞损伤的保护作用；图中:##P<0.01与对照组相比;*P〈0.05 ;* *Ρ〈0.01与Tat蛋白损伤组相比(文士 S，/?=3)；
图3为PC12细胞培养上清中的乳酸脱氢酶活性检测(Z±S，/?=3);图中01与对照组相比;* */^<0.01与Tat蛋白损伤组相比；
图4为Tunel检测丹酚酸A对Tat蛋白损伤脑片神经细胞的保护；图中A为对照组，B为Tat蛋白损伤组，C为药物保护组；标尺=100 μ m ；
图5为Tunel检测丹酚酸A对Tat蛋白损伤脑片神经细胞的保护(f±S,n=3);图中:##P<0.01与对照组相比;* *P〈0.01与Tat蛋白损伤组相比；
图6为DiI金颗粒散射标记树突棘的数量；图中:A为对照组；Β为Tat蛋白损伤组；C为药物保护组；标尺=4 μ m ;
图7为DiI金颗粒散射标记树突棘单的数量(S，/?=3);图中:##P<0.01与对照组相比;* */^<0.01与Tat蛋白损伤组相比。
【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。
[0019]实施例1
(一)主要试剂、细胞和仪器
HIV-1Tat蛋白购自深圳柏万森生物贸易有限公司(美国Prospec公司生产，批号:212PCLADEB28)。丹酚酸A (批号:96574-01-5)、丹参酮II A (批号:568-72-9)购自郑州丰耀农业有限公司。大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)购自中国科学院上海细胞所。MTT购自Sigma公司(批号:MTBF7873V);LDH (乳酸脱氢酶)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Tunel检测试剂盒购于美国promega公司(批号:0000073091 )。灭活胎牛血清(批号:111023)购于杭州四季青生物工程材料有限公司；马血清(批号:841843)和DMEM培养基(批号:823186)及MEM培养基(批号:793870)均购自购于Gibco公司；其它试剂均为分析纯。酶标仪(美国BIOTEK公司)；奥林巴斯显微成像系统(Olympus，FVI O) ;Mcllwain组织自动切片机(CAMPDEN，220-240);震荡切片机(LR59590，USA)。
[0020](二)实验方法
1、实验设计与分组
实验共分为对照组、Tat蛋白损伤组、药物作用组、药物保护组四个组，具体见表1。
[0021]表1、实验分组与设计
【权利要求】
1.丹酚酸A在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述丹酚酸A在制备预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。`
【文档编号】A61P25/00GK103860537SQ201410068605
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】刘红亮, 王靖凯, 史朝晖, 胡磊, 刘彬, 邓锦波, 徐括喜 申请人:河南大学