一种h3n2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用，本发明还公开了用于制备该灭活疫苗的H3N2亚型犬流感病毒株以及制备该灭活疫苗的方法，其中所述的H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC?NO.8760。对本发明制备得到的犬流感灭活疫苗进行安全性和免疫原性评价，试验结果表明，该疫苗对犬具有良好的安全性，并可以诱导犬体产生理想免疫保护效果。因此，本发明的提出为H3N2亚型犬流感疾病防治提供了一种有效的手段。
【专利说明】一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种犬流感灭活疫苗，其制备方法及由其制备得到的疫苗。属于生物制品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]犬流感(Canine influenza, Cl)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的犬流感病毒(Canine influenza virus, CIV)引起的犬的一种呼吸道急性高度接触性传染病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。2005年，国内首次有Cl的报道，有研究者对广东地区Cl流行病学调查结果显示，抗体平均阳性率为7.92% (ELISA)和6.25% (HI)，
[0003]目前流行的Cl V主要有H3N8亚型犬流感病毒和H3N2亚型犬流感病毒。国内目前尚无H3N8亚型马流感病毒感染犬的报道。自2006年以来，在我国江苏、广东、北京、浙江和辽宁等地相继发生了禽源H3N2亚型流感病毒感染犬并导致犬发生严重呼吸道疾病的事件，血清学调查发现犬群中禽源H3N2亚型犬流感病毒导致的犬流感的阳性率达到10%以上。禽源H3N2CIV不仅可以感染犬，而且可以感染雪貂和猫，表明该病毒已经跨越种间障碍，具备了感染哺乳动物的能力。而犬作为人类主要的伴侣动物之一，与人之间的接触非常密切，这也增加了人感染CIV的风险。
[0004]鉴于此，为避免犬流感在犬群暴发流行及对人类的健康造成威胁，需要切实有效的防治措施。疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效犬流感疫苗具有重要的公共卫生学意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活的保藏号为CGMCC N0.8760的H3N2亚型犬流感病毒。
[0006]本发明的目的之二是提供所述H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的制备方法。
[0007]本发明的目的之三是提供所述H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗在制备防治由H3N2亚型犬流感病毒引起的犬流感疾病药物中的应用。
[0008]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0009]H3N2亚型犬流感病毒的分离与鉴定:2013年，病料采集自黑龙江省某宠物医院呼吸道症状发病死亡犬，肺脏组织病料经过研磨后，接种9-11日龄SPF鸡胚分离病毒，对分离毒进行血凝、血凝抑制、特异性鉴定及生物学鉴定，证明分离的病毒为H3N2亚型犬流感病毒，本发明所分离得到的病毒全称为A/Canine/Heilongjiang/Ll/2013 (H3N2)株,简称为CIV-HLJ 株。
[0010]本发明的一 种H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，分类命名为犬流感病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCN0.8760 ;保藏时间是:2014年1月13日；保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。[0011]进一步的，本发明还提出了所述的H3N2亚型犬流感病毒在制备H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中的应用。
[0012]本发明的一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的本发明所述的H3N2亚型犬流感病毒株。
[0013]优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中还含有药学上可接受的载体或佐剂。
[0014]一种制备所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0015](I)将保藏编号为CGMCC N0.8760的H3N2亚型犬流感病毒株按照体积比进行500-1500倍稀释，得到稀释后的病毒液；
[0016](2)将步骤⑴得到的稀释后的病毒液接种9-11日龄SPF鸡胚，72h收获鸡胚尿囊液，置-20°C保存，不超过6个月；
[0017](3)鸡胚尿囊液中加入灭活剂，灭活后，再加入佐剂，乳化，即得。
[0018]其中，优选的，所述的灭活剂为丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL Α。
[0019]更优选的，具体操作步骤为:向鸡胚尿囊液加入终浓度为质量百分比0.2%的β-丙内酯，灭活48h，再加入终浓度为质量百分比8%的Montanide PET GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下,乳化IOmin,即得。
[0020]对本发明制备得到的犬流感灭活疫苗进行安全性和免疫原性评价，试验结果表明，该疫苗对犬具有良好的安全性，并可以诱导犬体产生理想免疫保护效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1CIV-HLJ株HA基因PCR扩增结果；
[0022]1、阴性对照；2:HA 扩增产物；M:DL2000DNA Marker
[0023]图2CIV-HLJ株NA基因PCR扩增结果。
[0024]1、阴性对照；2:NA 扩增产物；M:DL2000DNA Marker
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026]实施例1本发明犬流感病毒A/Canine/Heilongjiang/Ll/2013(H3N2)株的分离鉴定
[0027]材料与方法
[0028]1、病料和鸡胚
[0029]病料采集自黑龙江省某宠物医院呼吸道症状发病死亡犬的肺脏组织；9_11日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
[0030]2、病毒增殖及HA试验
[0031] 肺脏组织研磨后5000rpm离心10min,取上清,加入1000U双抗,接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.2ml/枚，37°C培养72h，4°C过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，分装后，_70°C保存备用。并测定其HA效价。
[0032]3、分子生物学试剂
[0033]RNA提取试剂TRIzol、cDNA反转录试剂禽源反转录酶AMV购自Invitrogen公司；PCR扩增所用的Ex Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
[0034]4、载体和菌种
[0035]pMD18-T克隆载体和DH5 α大肠杆菌感受态细胞，购自宝生物工程(大连)公司。
[0036]5、病毒RNA的提取与cDNA的制备
[0037]采用TRIzol试剂从鸡胚尿囊液提取病毒RNA ；以Uni_12: 5’ -AGCAAAAGCAGG-3’为引物，采用禽源反转录酶AMV，按试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。
[0038]6、引物设计
[0039]利用01igo6.0软件设计合成扩增流感病毒的HA和NA基因的特异性引物，如下表I所示。
[0040]表1扩增CIV HA和NA基因的特异性引物
[0041]
【权利要求】
1.一种H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC N0.8760。
2.权利要求1所述的H3N2亚型犬流感病毒在制备H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中的应用。
3.—种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的H3N2亚型犬流感病毒株。
4.如权利要求3所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于还含有药学上可接受的载体或佐剂。
5.一种制备权利要求3或4所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将保藏编号为CGMCCN0.8760的H3N2亚型犬流感病毒株按照体积比进行500-1500倍稀释，得到稀释后的病毒液； (2)将步骤(1)得到的稀释后的病毒液接种9-11日龄SPF鸡胚，72h收获鸡胚尿囊液，置-20°C保存，不超过6个月； (3)鸡胚尿囊液中加入灭活剂，灭活后，再加入佐剂，乳化，即得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的灭活剂为β-丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL A0
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于加入向鸡胚尿囊液加入终浓度为质量百分比0.2%的β -丙内酯，灭活48h，再加入终浓度为质量百分比8%的Montanide PET GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下,乳化lOmin。
【文档编号】A61K39/145GK103937752SQ201410074928
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】刘大飞, 刘春国, 程景, 张洪英, 曲连东 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所