人源化抗人表皮生长因子受体抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人源化抗人表皮生长因子受体（EGFR）抗体及其应用。通过对一株EGFR鼠单克隆抗体LA22人源化，使抗体中人源氨基酸序列达到90％以上，筛选出抗人EGFR的单克隆抗体。本发明的抗体与人EGFR结合的亲和力为2.3nM，与鼠源抗体相当，其结合到肿瘤细胞表面的EGFR后，能够迅速地诱导肿瘤细胞表面的EGFR内吞，成为非常理想的生物靶向治疗抗体。本发明为针对EGFR靶标的抗肿瘤及其他疾病如炎症及自身免疫性疾病的预防和治疗提供了特异性抗体药物。能显著降低该抗体药将来在病人体内产生人抗鼠源抗体（HAMA）的风险，延长抗体药的半衰期，提高疗效。
【专利说明】人源化抗人表皮生长因子受体抗体及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对人表 皮生长因子受体（epidemic growth factor receptor, EGFR)的抗体及其应用。 【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（EGFR)是表皮生长因子基因（erbB)家族的一员，在多种肿瘤 如乳腺癌，结肠癌，头颈肿瘤，肾癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌的发展中均具有重要影响。国内 外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信 号转导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤有较好的疗效。 表皮生长因子受体是目前研究得较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程手 段研制抗EGFR的单克隆抗体，是目前肿瘤治疗的研究热点。
[0003] EGFR分子是广泛分布于人肿瘤细胞表面的膜抗原，在细胞内信息传递过程中起着 重要的作用。使用人源抗体或人源化抗体是克服人抗鼠源抗体反应（(HAMA反应）的两种 可能的方法。由于特异性强、亲和力高的人源抗体不易得到，目前主要采取鼠源单克隆抗体 人源化的方法。2005年美国ImClone生产的EGFR单克隆抗体Erbitux在美国上市，在和化 疗一起用的时候可以延长直肠癌病人的生命。由古巴和中国百泰合作的治疗鼻咽癌的泰欣 生单抗也是针对EGFR同一靶点，于2009年上市。
[0004] 目前已经上市的Erbitux单抗药就是人源化的鼠抗EGFR单抗，但是本发明的单抗 LA22针对的是EGFR完全不同位点，抑瘤机理与Erbitux不同，与Erbitux同时使用可以提 高疗效。更主要的是它结合到肿瘤细胞表面的EGFR后，能够迅速地诱导肿瘤细胞表面的 EGFR内吞，成为非常理想的生物靶向治疗抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种人源化抗EGFR抗体。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体的基因。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供上述抗体在制备治疗高表达/过度表达EGFR的恶 性肿瘤和自身免疫性疾病药物中的应用。
[0008] 本发明提供的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其轻链恒定区、重链恒定区分别为人 全抗体免疫球蛋白IgGl的轻链恒定区、重链恒定区；其轻链可变区、重链可变区分别为人 源化改造的EGFR鼠源单抗LA22的轻链可变区和重链可变区，所述EGFR鼠源单抗LA22的 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 所述的人源化改造在可变区的FR区进行。
[0009] 在本发明的一个实施例中，将EGFR鼠源单抗LA22重链恒定区和轻链恒定区分别 用人IgGl的重链恒定区和轻链恒定区取代，通过将EGFR鼠源单抗LA22重链、轻链可变区 的框架区FR的人源化改造，获得具有良好生物活性和抗原亲和力的人源化抗人EGFR单克 隆抗体。
[0010] 本发明提供的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其人源化改造的轻链可变区含有如 SEQ ID N0. 12?14所示的任一个氨基酸序列，重链可变区含有如SEQ ID N0. 7?11所示 的任一个氨基酸序列。
[0011] 进一步地，其人源化改造的轻链可变区含有如SEQ ID N0. 14所示的氨基酸序列， 重链可变区含有SEQ ID N0. 7?11所示的氨基酸序列的任一个。
[0012] 进一步地，其人源化改造的轻链可变区含有如SEQ ID N0. 12?14所示的氨基酸 序列任一个，重链可变区含有如SEQ IDN0. 10所示的氨基酸序列。
[0013] 更进一步地，其人源化改造的轻链可变区含有如SEQ ID N0. 14所示的氨基酸序列 (即轻链h2)，重链可变区含有如SEQ ID N0. 10所示的氨基酸序列（即重链H3)。
[0014] 本发明提供了编码上述抗体的基因。编码上述抗体的基因中，编码轻链可变区的 基因其核苷酸序列为如SEQ ID N0. 20?22任一所示的DNA序列；编码重链可变区的基因 其核苷酸序列为如SEQ ID N0. 15?19任一所不的DNA序列。
[0015] 优选地，编码轻链可变区的基因其核苷酸序列为如SEQ ID N0. 22所示的DNA序 列；编码重链可变区的基因其核苷酸序列为如SEQ ID N0. 18所示的DNA序列。
[0016] 本发明提供了含有上述基因的表达载体。
[0017] 含有所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒在本发明保护范围内。
[0018] 本发明提供了上述人源化抗EGFR单克隆抗体在制备以EGFR为靶标的疾病治疗药 物中的应用。
[0019] 所述的药物为抗肿瘤药、抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药物。
[0020] 本发明提供了含有上述人源化抗EGFR单克隆抗体的药物或检测试剂。
[0021] 本发明提供了用于克隆鼠源单抗LA22重链、轻链可变区的引物，分别为VH1F0R:T GAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG
[0022] VH1BACK:AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG
[0023] VK1F0R:GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC
[0024] VK1BACK:GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA
[0025] 本发明提供了制备上述人源化抗EGFR单克隆抗体的方法，包括：
[0026] (1)提取杂交瘤细胞鼠 LA22肿瘤细胞的总RNA，VH1F0R和VK1F0R为引物分别 将总RNA逆转录成重链可变区和轻链可变区的cDNA ;然后以重链可变区和轻链可变区的 cDNA为模板，分别用VH1F0R+VH1BACK进行PCR扩增合成鼠源单抗LA22抗体重链可变区，用 VK1F0R+VK1BACK进行PCR扩增合成鼠源单抗LA22抗体轻链可变区；回收目的片段，克隆、 转化感受态细胞，筛选阳性克隆；
[0027] (2)测序正确的阳性克隆的轻链可变区设计酶切位点为Kpn I+Xho I，重链可变区 酶切位点KpnI+Agel，分别与表达载体pJH16-H39E3· Llkappa和pJH16连接，转化，得到重 链、轻链嵌合抗体表达载体；
[0028] (3)将鼠源LA22的轻链可变区和重链可变区进行人源化设计，获得5个人源化的 重链可变区氨基酸序列，氨基酸序列分别如SEQ ID N0. 7?11所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 15?19所示；和3个人源化的轻链可变区氨基酸序列，氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 12?14所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20?22所示；
[0029] (4)将人源化轻链可变区编码序列设计酶切位点为Kpn I+Xho I，重链可变区编码 序列设计酶切位点为KpnI+Agel，分别与表达载体pUC57连接，用Kpn I+Age I将重链可变 区编码序列从PUC57载体上切下插入到表达载体pJH16的相应位点；再用Kpn I+Xho I将 轻链可变区从PUC57载体上切下插入到表达载体pJH16-H39E3. Llkappa中相应位点，得到 人源化重组单克隆抗体重链和轻链表达载体；
[0030] (5)将步骤（2)得到的重链、轻链嵌合抗体表达载体与步骤（4)得到的人源化重组 单克隆抗体重链和轻链表达载体排列组合共转染感受态细胞，得到一组嵌合抗EGFR单克 隆抗体和30组人源化抗EGFR单克隆抗体。
[0031] 本发明提供的人源化抗EGFR抗体针对的是EGFR完全不同位点，抑瘤机理与 Erbitux不同，本发明的单抗与Erbitux同时使用可以提高疗效。更主要的是它结合到肿 瘤细胞表面的EGFR后，能够迅速地诱导肿瘤细胞表面的EGFR内吞，成为非常理想的生物靶 向治疗抗体。本发明通过对抗EGFR单抗进行人源化改造，使抗体药中人源氨基酸序列达到 90%以上，将显著降低该抗体药在病人体内产生人抗鼠源抗体反应（HAMA)的风险，本发明 实施例显示本发明的EGFR抗体与人EGFR结合的亲和力为2. 3nM，与鼠源抗体相当，并克服 HAMA效应，延长抗体药的半衰期，提高疗效。 【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为合成嵌合抗体VH和VL编码序列的regular-PCR的示意图。
[0033] 图2为本发明中使用的表达载体pJH16-H39E3· Llkappa表达轻链的图谱。其中， Ck表示人抗体kappa轻链的恒定区编码序列。
[0034] 图3为本发明中使用的表达载体pJH16载体，用于表达人源化LA22重链，其中， Exon by j00228部分序列表示人抗体IgGl的重链恒定区编码序列。
[0035] 图4为嵌合抗体合成基因和载体酶切的电泳图；图4a中1，2 :pUC57_LA22轻链的 KpnI-XhoI酶切，切下的条带大小在450bp左右，上层条带为载体片段；3, 4 :pUC57-LA22重 链的KpnI-Agel酶切，切下的条带大小在550bp左右，上层条带为载体片段；图4b中，9, 10 : 为 pJH16-H39E3Ll，KpnI-XhoI 酶切，切下的条带在 450bp 左右；ll:pJH16 质粒，KpnI-Agel 酶切，切下的条带大小为550bp左右，MARKER为Trans2K Plus II DNA Marker。
[0036] 图5为轻链人源化合成基因酶切；其中1，2:pUC57-h〇-LA22轻链的Kpn I-Xho I 酶切；3:pUC57-hl-LA22 轻链的 Kpn I-Xho I 酶切；4:pUC57-h2-LA22 轻链的 Kpn I-Xho I 酶切；M:Trans2K Plus II DNA Marker
[0037] 图6为载体酶切的电泳图。1 :为pJH16-H39E3Ll，KpnI-XhoI酶切，切下的条带在 8. 5kbp左右；2 :pJH16质粒，KpnI-Agel酶切，切下的条带大小为7kbp左右。
[0038] 图7为重链人源化基因酶切；l:pJH16载体的Kpn I+Age I酶切；切下的条带大小 为 7kbp 左右；2:pUC57-h〇-LA22 重链的 Kpn I+Age I 酶切；3:pUC57-hl-LA22 重链的 Kpn I+Age I 酶切；4:pUC57-h2-LA22 重链的 Kpn I+Age I 酶切；5:pUC57-h3-LA22 重链的 Kpn I+Age I 酶切；6 :pUC57-h4-LA22 重链的 Kpn I+Age I 酶切。
[0039] 图8为测序结果，BLAST比对100%，验证得到构建质粒成功后举例表示。其中 H2-1CMV表示测序的人源化抗体重链可变区基因测序序列；h2-LA22重链为本发明设计合 成的h2-LA22重链抗体可变区基因序列。
[0040] 图9为三个轻链可变区人源化突变位点，其中灰度部分为突变位点。
[0041] 图10为五个重链可变区人源化突变位点，其中灰度部分为突变位点。
[0042] 图11为细胞上清纯化得到人源化单克隆抗体SDS-PAGE电泳图，其中Μ为蛋白 ruler II10ul，l为BSA，为5yg，2为纯化抗体2ug非还原20ul，3为纯化抗体2ug还原 20ul。
[0043] 图12为流式细胞术分析结果，NC为阴性对照A431细胞，mLA22表示鼠源的LA22抗 体识别A431细胞表面的EGFR，hLA22表示人源化的LA22抗体识别A431细胞表面的EGFR。
[0044] 图13为细胞ELISA实验检测LA22对A431细胞表面的EGFR的结合。mLA22是鼠 源的LA22, hLA22是人源化的LA22。
[0045] 图14为鼠源的LA22和人源化的LA22的细胞ELISA竞争实验。鼠源LA22和人源 化 LA22 的比例分别是 1:0, 2:1，1:1，1:2,0:1。
[0046] 图15为不同抗体浓度的mLA22和hLA22对肿瘤细胞增殖抑制结果。 【具体实施方式】
[0047] 以下实施实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。
[〇〇48] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 实施例1抗EGFR鼠源单抗mLA22的重链、轻链可变区的克隆
[0050] 米用 5'RACE (Rapid amplification of cDNA ends)的方法来获取抗 EGFR 鼠源单 抗m LA22的可变区编码序列。设计并合成以下引物：
[0051] VH1F0R:TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG
[0052] VH1BACK:AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG
[0053] VK1F0R:GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC
[0054] V K1BACK:GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA
[0055] 其中，VH1F0R和VK1F0R用于合成cDNA,然后用VH1F0R+VH1BACK做PCR扩增合成 抗体重链，用VK1F0R+VK1BACK做PCR扩增合成抗体轻链，然后测序。
[0056] 用Qiagen公司的Qiagen RNeasy试剂盒分别提取1X107杂交瘤细胞鼠 LA22肿瘤 细胞（由美国专利拥有者Denry Sato博士提供)的总RNA。按照5'-RACE试剂盒（Transgen 公司产品）说明书以VH1F0R和VK1F0R为引物分别将总RNA逆转录成重链和轻链的cDNA， cDNA 合成第一条链反应条件为：42°C，30min ;85°C，5min。然后用 VH1F0R+VH1BACK 做 PCR 扩增合成抗体重链可变区，用VK1F0R+VK1BACK做PCR扩增合成抗体轻链可变区，两次反应 均采用热启动，PCR反应条件：94°C 5分钟；94 °C 30秒，58 °C 45秒，72 °C 2分10秒，37循 环：72°C7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段（轻链长度约 320bp，重链长度约360bp)。克隆到pEASY-Tl (Transgen)载体中，转化大肠杆菌DH5。细胞后 在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取8个白色菌斑接种于含有氨节青霉素的LB液体培养基 中扩增.筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了鼠 LA22 的重链和轻链可变区的DNA序列。
[0057] 测序得到的鼠源LA22重链可变区（VH)的DNA序列如SEQ ID N0. 3所示，轻链可 变区（VL)的DNA序列如SEQ ID勵.4所示，并据此推断得到鼠源1^22重链可变区氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0058] 实施例2嵌合单克隆抗体表达载体的构建
[0059] 根据实施例1测序得到的鼠 LA22重链、轻链可变区碱基序列，设计轻链酶切 位点为Kpn I+Xho I，送金唯智公司合成全基因序列，合成时连接的载体为pUC57。以 PJH16-H39E3. Llkappa【购自回而生医药科技(北京)有限公司，含人IgGl为表达载体；设计 重链酶切位点为Kpn I+Age I，以pJH16【购自回而生医药科技(北京)有限公司，含人IgGl】 为表达载体，将它们分别与金唯智公司合成的鼠 LA22重链、轻链可变区编码基因酶切后， 16°C过夜连接。PUC57-LA22轻链和重链的酶切结果见图4a、图4b。将酶切后得到的目的 基因和表达载体（PJH16-H39E3. Llkappa 和 pJH16)切胶用 Qiagen Gel Extraction Kit 回 收，按T4DNA连接体系连接过夜，然后转化大肠杆菌DH5 α，测序验证BLAST比对100%，说明 嵌合抗体表达载体构建成功。获得的嵌合抗体重链序列如SEQ ID N0. 5所示，嵌合抗体轻 链序列如SEQ ID N0. 6所示。
[0060] 实施例3人源化重组单克隆抗体VL和VH的设计
[0061] 对抗EGFR单克隆抗体m LA22的VL和VH进行了人源化设计，人源化改造应遵从 以下方法，将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得 鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。该方法的原则是仅替换与人抗体FR差别 明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基 酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键 从而影响到抗体互补决定区（CDR)构象的残基尽量不替换。
[0062] 经过人源化改造，本发明提供5个人源化改造的抗体LA22的重链可变区分别为： H0-LA22重链、H1-LA22重链、H2-LA22重链、H3-LA22重链、H4-LA22重链，其氨基酸序列与 信号肽序列分别如SEQ ID N0. 7?11所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0. 15?19所 示；提供3条人源化改造的轻链可变区分别为：h〇-LA22轻链、hl-LA22轻链、h2-LA22轻链， 其氨基酸序列与信号肽序列分别如SEQ ID N0. 12?14所示，其核苷酸序列分别如SEQID N0. 20?22所示。
[0063] 实施例4人源化重组单克隆抗体表达载体的构建
[0064] 将实施例3获得的3个人源化轻链可变区编码序列设计酶切位点为Kpn I+Xho I， 5个重链可变区编码序列设计酶切位点为KpnI+Agel，分别与表达载体pUC57连接，用Kpn I+Age I将重链可变区编码序列从pUC57载体上切下插入到表达载体pJH16的相应位点；再 用Kpn I+Xho I将轻链可变区从pUC57载体上切下插入到表达载体pJH16-H39E3· Llkappa 中相应位点，得到人源化重组单克隆抗体重链和轻链表达载体。轻链与重链的酶切验证结 果见图5、图6、图7。
[0065] 结果显示，酶切验证均正确，将图5所示的1?4道的基因序列ho/hl/h2-LA22 预计大小为430bp切胶回收；将图6所示的1泳道的载体基因序列pJH16-H39E3. Llkappa 预计大小为8. 5kb和2泳道的载体基因序列pJH16预计7kb，均切胶回收；将图7所示的 2, 3, 4, 5, 6道的基因序列H0/H1/H2/H3/H4-LA22重链预计大小为550bp左右切胶回收，同 时将第1道的PJH16载体大小约为7kb片段切胶回收。将凝胶中切割出来的载体和基因的 DNA片段用Qiagen Gel Extraction Kit回收得到条带。按T4DNA连接体系连接过夜，转化 DH5a。测序，BLAST比对100%，验证构建质粒成功。见图8。
[〇〇66] 实施例5人源化抗EGFR抗体的表达与纯化
[〇〇67] 用实施例2构建的PJH16-LA22重链、轻链嵌合抗体表达载体和实施例4构建的 PJH16-LA22重链、轻链人源化抗体表达载体分别转染大肠杆菌DH5a。接种于lOOmlLB培养 基中，按照常规方法进行培养。收获培养物，用Qiagen公司的UltraPure质粒DNA纯合试 剂盒抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转 染293F或CH0细胞(美国英俊公司），操作参照厂家的说明书进行。
[0068] 首先对293F细胞进行不同轻、重链质粒组合的转染，共20组293F瞬时表达。培 养3天后，取培养上清液，加入预包有EGFR的96孔板中，采用ELISA间接法，初步评价分泌 抗体结合EGFR的活性。上述20组的部分检测结果如下表1所示。NC为以抗体稀释液作为 阴性对照。
[0069] 表1筛选的不同重链、轻链组合的抗体活性评价结果
【权利要求】
1. 一种人源化抗人EGFR单克隆抗体，其特征在于，其轻链恒定区、重链恒定区分别为 人全抗体免疫球蛋白的轻链恒定区、重链恒定区；其轻链可变区、重链可变区分别为人源化 改造的EGFR鼠源单抗LA22的轻链可变区和重链可变区，所述EGFR鼠源单抗LA22的轻链 可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述 的人源化改造在可变区的FR区进行。
2. 如权利要求1所述的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其特征在于，其人源化改造的轻 链可变区含有如SEQ ID NO. 12?14所示的任一个氨基酸序列，重链可变区含有如SEQ ID NO. 7?11所示的任一个氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其特征在于，其人源化改造的轻 链可变区含有如SEQ ID NO. 14所示的氨基酸序列，重链可变区含有SEQ ID NO. 7?11所 示的氨基酸序列的任一个。
4. 如权利要求1所述的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其特征在于，其人源化改造的轻 链可变区含有如SEQ ID NO. 12?14所示的氨基酸序列的任一个，重链可变区含有如SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列。
5. 如权利要求1所述的人源化抗人EGFR单克隆抗体，其特征在于，其人源化改造的轻 链可变区含有如SEQ ID NO. 14所示的氨基酸序列，重链可变区含有如SEQ ID NO. 10所示 的氨基酸序列。
6. 编码权利要求1?5任一项所述抗体的基因。
7. 如权利要求6所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因其核苷酸序列为如 SEQ ID N022所示的DNA序列；编码重链可变区的基因其核苷酸序列为如SEQ ID N018所 示的DNA序列。
8. 含有权利要求7所述基因的表达载体。
9. 权利要求1?5任一所述抗体在制备以EGFR为靶标的疾病治疗药物中的应用。
10. 含有权利要求1?5任一项所述抗体的药物或检测试剂。
【文档编号】A61K39/395GK104059148SQ201410083224
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】孙乐 申请人:回而生医药科技（北京）有限公司