具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于药物【技术领域】，公开了一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其制备方法和用途。该细辛总多糖提取物是用极性溶剂提取细辛的根与/或根茎，乙醇沉淀，减压干燥，得到细辛总多糖，得率为15wt%，总多糖含量为60wt%-80wt%。发明人通过大量的药效学试验首次证明细辛总多糖提取物具有显著抑制咳嗽的作用，接近可待因的治疗效果，延长咳嗽潜伏期的作用强于可待因，而且还首次发现细辛总多糖提取物具有降低咳嗽的敏感性、抑制气道炎症的作用，对各型咳嗽具有良好的预防和治疗作用，可以用于制备治疗咳嗽相关疾病的药物。本发明活性明确、实验材料来自原植物，成本低。
【专利说明】具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物【技术领域】，更具体而言，涉及一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物及其提取方法和应用。
【背景技术】
[0002]由于工作压力、空气环境污染等诸多因素影响，人类呼吸系统疾病的发病率居高不下，而咳嗽是呼吸系统常见病、多发病，是呼吸科门诊的常见主诉。咳嗽本身是呼系统受到刺激时产生的一种防御性反射活动，是一种有益的动作，有时亦见于健康人群。一般情况下，对于轻度而不频繁的咳嗽无须应用止咳药便可自然缓解。此外，咳嗽对人体健康的影响亦是辩证的，也是一种病理性的反应，长期频繁或过于激烈的咳嗽不仅会增加患者的痛苦，影响休息和睡眠，增加体力消耗，严重时还会促进疾病的发展，产生其他并发症。
[0003]根据病程的不同，咳嗽可分为急性、亚急性与慢性咳嗽。急性咳嗽〈3周，亚急性咳嗽3-8周，慢性咳嗽>8周。I)急性咳嗽:目前一般认为急性上呼吸道病毒感染是最常见的病因，其他包括鼻炎、鼻窦炎、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管哮喘等。上呼吸道感染最常见的病原体是鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和肠病毒等，其中以鼻病毒最常见。急性咳嗽也可能与哮喘、支气管炎以及其他呼吸系统疾病的急性发作有关。临床上，常可见到不少以急性咳嗽为前驱表现的传染病或其他一些疾患；2)亚急性咳嗽:最常见原因 是感染后咳嗽(又称感冒后咳嗽)、细菌性鼻窦炎和哮喘等。作为病原体的病毒以鼻病毒多见，约占30%~50% ;其次为冠状病毒和流感病毒，分别为10%~15%和5%~15%。除了呼吸道病毒外，肺炎支原体和肺炎衣原体等亦可导致感染后咳嗽；3)慢性咳嗽:临床上通常将慢性咳嗽定义以咳嗽为唯一症状或主要症状、时间大于8周、胸部X线检查无明显异常者，称为不明原因慢性咳嗽，简称慢性咳嗽。在专科门诊中，慢性咳嗽的比例高达10%-38%。欧美各国的问卷调查显示慢性咳嗽发生率也高达9%-33%。常见病因为嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)、上气道咳嗽综合征(UACS，原称鼻后滴流综合征(PNDS))、胃食管反流性咳嗽(GERC )、咳嗽变异性哮喘(CVA )等。
[0004]广州呼吸疾病研究所2006年一项针对1087名大学生咳嗽的现场调查显示，该群体咳嗽总发生率为10.9%，其中慢性咳嗽总发生率为3.3%，可以推测社区人群的咳嗽发生率将更高，这类患者的平均病程较长，有的甚至长达数十年。有资料显示，全世界每年约有15%的成年人和10%的未成年人受到不同程度咳嗽的影响。因此，开发安全有效的止咳药物将在满足巨大市场需求的同时，创造出较好的社会效益和经济效益。
[0005]根据药物作用机理的不同可将止咳药物分为两大类:第一类为中枢性镇咳药，这类药物能直接选择性的抑制延髓呼吸中枢而产生镇咳作用，如吗啡、可待因等，这类药物镇咳效果较好，但副作用明显，可导致成瘾性及呼吸抑制，甚至诱发幻觉、妄想或其它精神病症状等；第二类为外周性镇咳药，这类药物通过抑制肺-迷走神经反射而阻断咳嗽反射的传入冲动，起到镇咳作用，如苯丙哌林、磷酸苯丙哌林、莫吉斯坦等，多数为生物碱类药物，可能会产生恶心、心悸、头晕等不良反应。虽然临床上用于镇咳的药物繁多，但很多慢性咳嗽患者用这些药物治疗并不能获得有效的缓解。
[0006]中医药学是中华民族几千来防病治病丰富实践经验的结晶，中医能辨西医不明之症，中药能治西药难治和不治之症，中医中药对咳嗽的治疗有着悠久的历史与丰富的经验，可以与西医西药互为补充。虽然目前国内有很多治疗咳嗽的中药和中成药，但这些药物的有效组分、适应症并不清楚。另外，对于不明原因且伴有气道炎症的慢性咳嗽患者，还没有很好的治疗药物，因而研发副作用更小且能有效治疗咳嗽的纯天然中药是从事呼吸系统疾病领域药学工作者的首要任务。
[0007]中药细辛，始载于《神农本草经》，列为上品。2010版《中国药典》规定细辛来源为马3?铃科植物北细辛 Asarum Heterotropoids Fr.Schmidt var.mandshuricum (Maxim.)Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai 或华细辛Asarum sieboldiiMiq.的干燥根与根茎。性温，味辛，归心、肺、肾经。具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮的功效，用于痰饮咳喘、风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛的治疗。古籍有细辛治咳的记载，《本经》谓:“细辛，主咳逆，头痛脑动……利九窍”；《本草纲目》:“辛能泄肺，故风寒咳嗽上气者宜用之”；《日华子本草》:“治咳……胸中结聚”；《长沙药解》:“善降冲逆，专止咳嗽”；《药性论》:“治咳逆上气……”等。目前有关细辛止咳文献的报道大多集中在挥发油中的甲基丁香酚成分(周慧秋.甲基丁香酚药理作用研究.中医药学报.2000，(2): 79-80)。我们前期研究发现:细辛挥发油对柠檬酸激发的急性咳嗽豚鼠模型具有明显的镇咳作用，但对于香烟暴露下咳嗽高敏豚鼠模型镇咳效果则明显没有细辛非挥发性成分细辛总多糖好，且大剂量具有一定的副作用。此外，对于细辛非挥发性成分研究报道也较少，仅有报道从细辛根及根茎中分离得到非挥发性成分卡枯醇、1-细辛脂素、1-芝麻脂素、马兜铃酰胺1、山奈酚-3-0-葡萄糖苷等(蔡少青.北细辛非挥发性化学成分的研究.北京医科大学学报.1996，28(3):228-230;吕帅.辽细辛地下部分的化学成分(II).沈阳药科大学学报.2010，27 (9):707-710 ;魏青春.汉城细辛化学成分的分离与鉴定.时珍国医国药.2010，21 (3):676-677)。已有研究报道细辛多糖的制备方法(李晶晶.细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究.长春师范学院学报(自然科学版).2008，27(1): 54-58)，但这种方法需要提取3次、每次提取周期较长(6h)、制备过程中需要离心处理，因此不适合工业化大生产；且这种制备方法总多糖得率较低(9.56wt%)，糖含量亦较低(48wt%-52wt%);此外，有报道细辛非挥发性成分细辛多糖具有促进小鼠脾T、B淋巴细胞增殖作用(李晶晶.细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究.长春师范学院学报(自然科学版).2008, 27 (I): 54-58)，但目前尚未见有关细辛非挥发性成分细辛总多糖镇咳活性的研究报道。
【发明内容】
[0008]针对以上现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物。
[0009]本发明的又一目的在于提供上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法。
[0010]本发明的再一目的在于提供上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途。
[0011]本发明目的通过以下技术方案实现:[0012]一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，该细辛总多糖提取物中多糖含量在60wt%-80wt%o
[0013]组成所述多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖中的一种以上。
[0014]上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，按照以下操作步骤:将细辛的根与/或根茎用极性溶剂热回流提取，减压浓缩干燥得到细辛总提物；将细辛总提物溶于水中，采用体积百分数为40%-100%的乙醇进行沉淀，减压过滤，用乙醇洗涤，减压干燥即得细辛总多糖提取物。
[0015]所述极性溶剂优选为水。
[0016]所述极性溶剂的重量优选为细辛的根与/或根茎重量的5-20倍。
[0017]所述沉淀是优选采用体积百分数为60%_90%的乙醇进行沉淀。
[0018]所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛，更加优选为北细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为60%-100%的乙醇进行洗涤，更加优选用乙醇洗涤是采用体积百分数为80%-100%的乙醇进行洗涤。
[0019]所述用乙醇洗涤的次数优选为两次。
[0020]本发明具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，总多糖得率15wt%。
[0021]上述具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途，所述细辛总多糖提取物单独或与其他药物组合制备治疗咳嗽药物。
[0022]所述细辛总多糖提取物与可用药物载体制成各种剂型。
[0023]所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
[0024]药学上可接受的载体如:填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。填充剂包括乳糖、蔗糖、玉米淀粉、山梨醇；粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂包括硬脂酸镁；崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚维酮、微晶纤维素；润湿剂如十二烷基硫酸钠。
[0025]本发明具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的有效剂量按照人的体重60kg来计算,为 2.5g-ll.0g/ 人.天。
[0026]本发明可采用紫外分光光度法，以无水葡萄糖为对照品，在490nm波长处以苯酚-硫酸法和/或在620nm处以蒽酮法测定细辛总多糖提取物中细辛有效总多糖含量。
[0027]本发明的原理:
[0028] 药理实验证明，本发明的细辛总多糖提取物具有良好的减轻和/或抑制咳嗽的活性，可用于预防或治疗各型咳嗽。
[0029]药效学试验结果表明，对于豚鼠急性咳嗽模型，柠檬酸激发后细辛总多糖提取物低、中、高剂量组与空白对照组相比可延长动物的咳嗽潜伏期，降低豚鼠的咳嗽次数；与细辛总挥发油相比细辛总多糖对豚鼠的急性镇咳活性相对较弱；而对于慢性咳嗽敏感性增高并伴有气道炎症的豚鼠模型(香烟暴露14天)，柠檬酸激发后细辛总多糖提取物低、中、高剂量组与模型组相比可明显延长动物的咳嗽潜伏期，降低豚鼠的咳嗽次数，同时可以降低豚鼠BALF中的炎症细胞总数及中性粒细胞的比例，抑制气道炎症，达到或接近可待因的效果；与细辛总提取物及细辛总挥发油相比，细辛总多糖提取物高剂量组镇咳率均具有显著性差异(p〈0.05)，显示细辛总多糖提取物对于长期香烟暴露下的咳嗽高敏豚鼠模型具有更好的镇咳活性。
[0030]急性毒性试验结果表明，细辛总多糖提取物经灌胃给药途径，SPF级NIH小鼠的食量、体重未见异常，LD50 > 10.0g/kg，表明毒性低，具有良好的用药安全性。
[0031]本发明的有益效果是:
[0032](I)本发明为目前镇咳药物提供了一种全新的选择和思路，拓展了镇咳药物的选择领域，也为该【技术领域】的发展做出了贡献。
[0033](2)本发明首次证明细辛总多糖提取物具有显著的镇咳效果，可以降低咳嗽敏感性和抑制气道炎症的作用，且无成瘾性。
[0034](3)急性毒性试验表明细辛总多糖提取物的毒性低，具有很好的用药安全性。
[0035](4)本发明提供的细辛总多糖提取物的制备工艺能有效的富集并去除杂质，其细辛总多糖得率及含量高，优于现有的方法，质量控制可以通过紫外分光光度法进行含量测定分析，该方法简单易行可控。
[0036](5)本发明提供的提取物制备方法简单、快捷、重现性好；所选用的溶剂低廉、无
毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1细辛总多糖对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响(I 士S，》= 8)，其中A:空白组；B:溶剂组(质量分数0.5%CMC-Na) ;C:硫酸可待因30mg/kg组；D:细辛总多糖200mg/kg组；E:细辛总多糖400mg/kg组；F:细辛总多糖800mg/kg组；G:细辛总提物1600mg/kg组；H:细辛总挥发油 200mg/kg组；与空白组相比:*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001。
[0038]图2细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型咳嗽次数的影响(J士S，Π = 8)，其中A:空白组；B:模型组；C:溶剂组(质量分数0.5%CMC-Na) ；D:硫酸可待因30mg/kg组；E:细辛总多糖200mg/kg组；F:细辛总多糖400mg/kg组；G:细辛总多糖800mg/kg组；H:细辛总提物1600mg/kg组；1:细辛总挥发油200mg/kg组；与模型组相比:**ρ〈0.01，***ρ〈0.001 ;与细辛总提物组相比:ΑΡ〈0.05 ;与细辛总挥发油组相比:#ρ〈0.05。
[0039]图3细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型肺组织病理代表图(HE染色，X 200)，其中A:空白组；Β:模型组；C:溶剂组(质量分数0.5%CMC-Na) ；D:硫酸可待因30mg/kg组；E:细辛总多糖200mg/kg组；F:细辛总多糖400mg/kg组；G:细辛总多糖800mg/kg组；H:细辛总提物1600mg/kg组；1:细辛总挥发油200mg/kg组。
[0040]图4细辛总多糖对慢性咳嗽高敏豚鼠模型气管组织病理代表图(HE染色，X 200)，其中A:空白组；B:模型组；C:溶剂组(质量分数0.5%CMC-Na) ；D:硫酸可待因30mg/kg组；E:细辛总多糖200mg/kg组；F:细辛总多糖400mg/kg组；G:细辛总多糖800mg/kg组；H:细辛总提物1600mg/kg组；1:细辛总挥发油200mg/kg组。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0042]实施例1
[0043]细辛总多糖提取物的制备[0044]干燥的细辛根与/或根莖Ikg,粉碎成粗粉,过80目筛,用药材重量10倍量的水，微沸加热回流提取5h，提取液经6层纱布滤过，减压浓缩干燥得细辛总提物，将细辛总提物用水加热溶解至1L，加入9倍体积量的无水乙醇至醇体积百分浓度为90%，边加边搅拌，充分沉淀后于4°C冰箱静置过夜，倾倒上清液，沉淀减压抽滤，等量90%体积百分比乙醇洗涤2次，常规干燥，即得细辛总多糖提取物，得率为15wt%。分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮法紫外分光光度法测定细辛总多糖含量为68wt%和60wt%。
[0045]实施例2
[0046]小鼠经口灌胃给予细辛总多糖提取物的急性毒性试验
[0047]I实验动物
[0048]SPF级NIH小鼠，雌雄各半，体重18_22g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK (粤)2008-0002 O
[0049]2实验方法
[0050]参照《药理学实验方法学》、《中药药理实验方法学》，采用正规Bliss法考察细辛总多糖提取物经口灌胃给予小鼠的急性毒性。首先用最大浓度、最大给药剂量、最大灌胃体积进行试验。试验前禁食不禁水12h试验时按10.0g/kg细辛总多糖提取物灌胃(相当于生药量24.4g/kg，相当于临床用量的12倍)。实验室温度25±2°C，一次给药，观察14天，仔细观察每只动物并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。给予受试物前、后各一周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均进行尸检，尸检异常的器官应作 组织病理学检查。
[0051]3实验结果
[0052]试验结果表明:以10.0g/kg的剂量经口灌胃给予小鼠，给药后14天内，未见动物死亡，各动物精神及行为活动状况良好，皮肤被毛清洁，大小便、体重及摄食量的增长均正常，亦未见其他毒性反应症状。观察结束后大体解剖未见脏器明显异常。细辛总多糖的LD5tl> 10.0g/kg。
[0053]以上结果说明，细辛总多糖的安全性高，无严重急性中毒的危险性。
[0054]实施例3
[0055]细辛总多糖提取物对柠檬酸所致豚鼠咳嗽的急性镇咳作用
[0056]I实验材料
[0057]实验动物:普通级Hartley豚鼠，雌雄各半，体重250_350g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号=SCXK (粤)2008-0002。
[0058]试剂与仪器:一水合柠檬酸(广州化学试剂厂，批号:20121001-2),用时配制成
0.8M的生理盐水溶液；动物无创Buxco肺功能检测系统(美国Buxco公司);Aeroneb Pro雾化器(Aerogen (爱尔兰)有限公司)；灌胃针(广东省医学实验动物中心)。
[0059]2实验方法
[0060]采用柠檬酸诱导豚鼠急性咳嗽模型进行药效评价。取128只Hartley豚鼠，将其逐一置于动物无创Buxco肺功能检测系统6L体描仪内，偏流仪空气流速2.5L/min,使用Aeroneb Pro雾化器通入雾化的0.8M的柠檬酸超纯水溶液气溶胶lmin，雾化的粒子平均直径2.5μπι，观察5min，监测6min内的咳嗽次数，咳嗽的声音由室内放置的麦克风记录和放大，声波经B1system XA软件进行分析,再经电脑软件处理声音数据记录咳嗽次数，同时由经过训练的观察者补充观察。挑选咳嗽次数大于10次的豚鼠为合格动物进行试验。
[0061]取筛选合格的64只Hartley豚鼠，雌雄各半，随机分成8组，空白组给予lmL/kg的生理盐水，溶剂组给予等体积的相应溶剂(质量百分比浓度0.5%的CMC-Na水溶液)，阳性药组给予等体积的30mg/kg磷酸可待因，给药组给予等体积的细辛总多糖提取物(实施例1样品 200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg)、细辛总提物(1600mg/kg)、细辛总挥发油(200mg/kg,常规水蒸汽蒸懼制备所得)，每天I次，连续给药3天。末次给药后2h在动物无创Buxco肺功能检测系统进行柠檬酸雾化激发试验(雾化条件同前)，雾化激发lmin，诱导豚鼠产生急性咳嗽，观察5min，计算6min内的咳嗽次数(N)、咳嗽潜伏期，并用公式“镇咳率=(Ns自对照-N给药组)/N空自对照X 100%计算各给药组的镇咳率。
[0062]数据用Z 土S表示，采用IBM SPSS Statisticsl9.0统计软件对各组参数进行单因素方差分析。进行组间比较，P〈0.05为有显著性差异。
[0063]3实验结果
[0064](I)细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响
[0065]各组动物经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽次数及咳嗽抑制率见表1及图1。由表1及图1可知，与空白组相比，细辛总多糖提取物中、高剂量组均可以显著降低豚鼠的咳嗽次数(P〈0.05)，镇咳率分别达到28.5%和32.3%。细辛总提取物在1600mg/kg剂量时镇咳率为28.8%，而细辛总多糖提取物高剂量组在800mg/kg剂量时镇咳率达到相当水平，显示细辛总多糖提取物的镇咳活性较总提取物为高，进而说明细辛总多糖是细辛镇咳的主要活性组分之一，细辛总多糖提取物与细辛总提取物之间无显著性差异。细辛总挥发油对于豚鼠的急性镇咳活性均比细辛总提取物及细辛总多糖好(镇咳率53.8%)，但三者之间均无显著性差异。
[0066]以上结果表明，细辛总多糖提取物具有良好的急性镇咳作用，并具量效关系，且用药相对安全。
[0067]表1细辛总多糖提取物对急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次数的影响0- ±S，?= 8 '
[0068]
【权利要求】
1.一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，其特征在于:该细辛总多糖提取物中多糖含量在 60wt%-80wt%。
2.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物，其特征在于:组成所述多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物的提取方法，其特征在于按照以下操作步骤:将细辛的根与/或根茎用极性溶剂热回流提取，减压浓缩干燥得到细辛总提物；将细辛总提物溶于水中，采用体积百分数为40%-100%的乙醇进行沉淀，减压过滤，用乙醇洗涤，减压干燥即得细辛总多糖提取物。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于:所述极性溶剂为水；所述极性溶剂的重量为细辛的根与/或根茎重量的5-20倍。
5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于:所述沉淀是采用体积百分数为60%-90%的乙醇进行沉淀；所述用乙醇洗涤的次数为两次。
6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于:所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为60%-100%的乙醇进行洗涤。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于:所述细辛为北细辛；所述用乙醇洗涤是采用体积百分数为80%-100%的乙醇进行洗涤。
8.根据权利要求1所述的一种具有镇咳活性的细辛总多糖提取物在制备治疗咳嗽药物中的用途，其特征 在于:所述细辛总多糖提取物单独或与其他药物组合制备治疗咳嗽药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述细辛总多糖提取物与可用药物载体制成各种剂型。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
【文档编号】A61K31/715GK104027345SQ201410115066
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】赖克方, 刘晓东, 钟伯年, 钟山, 聂怡初 申请人:广州医科大学附属第一医院, 广州呼吸疾病研究所