一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法。选用人血管内皮细胞作为原料制备细胞膜微囊；将得到的细胞膜微囊浸泡在洋地黄皂苷与药物的混合溶液中，用洋地黄皂苷可提高细胞膜通透性，药物渗透进入细胞膜微囊；使用钙离子封闭细胞膜，得到载药的细胞膜微囊。本发明制备方法简便可控，速度快，生产效率高，可以方便地在细胞膜微囊中装载多种药物并调节其载药量，有良好的应用前景。
【专利说明】一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法。尤其是利用洋地黄皂苷提高细胞膜通透性，并在装载药物后使用钙离子封闭细胞膜的方法。
【背景技术】
[0002]药物在载体中的高效装载和可控释放是实现药物有效利用、降低毒性的重要前提。药物在载体中的装载可实现对药物的保护，提高其稳定性；同时可调控药物的释放速度和释放位置，降低其对健康细胞和组织的毒性。
[0003]通常的药物载体主要是使用人工合成的聚合物或天然来源的蛋白质和多糖作为原料，其结构比较简单。但是往往生物相容性差，较易被人体的免疫系统识别并清除，具有体内循环时间短且不易到达病变部位的缺点，这些缺点限制了其推广与应用。
[0004]仿细胞微囊是由细胞膜将囊内空间与囊外空间隔离开来形成的球状物质。利用细胞松弛素b处理哺乳动物细胞，破坏维持细胞形态的肌动蛋白的组装，然后在机械剪切的作用下制备仿细胞微囊。[0005]仿细胞微囊作为癌细胞靶向性的药物载体有诸多优点:一方面是由于微囊表面实质是一层类细胞膜结构，因此具有极佳的生物相容性，并且有望降低自体免疫系统的清除作用，具有更好的临床应用价值。但是，细胞膜微囊也存在着囊壁通透性差、只能负载特定分子的缺点。洋地黄皂苷是一种表面活性剂，可以提高细胞膜的通透性，使得一些分子量较大的药物分子也可以进入细胞膜微囊内部；同时洋地黄皂苷可以与高浓度的钙离子结合，实现细胞膜的再次封闭。这一方法可大大提高细胞膜微囊的药物装载量同时也拓展了可负载药物分子的种类。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法。
[0007]本发明的在细胞膜微囊中高效装载药物的方法，包括以下步骤:
1)在培养有人血管内皮细胞的培养盘中加入20μL浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞和细胞膜微囊，离心分离得到细胞膜微囊悬液；
2)取200μg步骤I)所得的细胞膜微囊加入到ImL洋地黄皂苷与药物的混合溶液中，洋地黄皂苷与药物的浓度分别为lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育I~24h ;
3)在步骤2)的溶液中加入IOPL0.5mol/mL氯化钙溶液，37°C下孵育2h ;离心收集微囊，洗涤，得到装载药物的细胞膜微囊。
[0008]本发明中，所说的药物可以是盐酸阿霉素、钆喷酸葡胺或葡聚糖。
[0009]本发明的原理:使用洋地黄皂苷提高细胞膜通透性，利用浓度差将药物装入细胞膜微囊，随后使用氯化钙溶液封闭细胞膜。
[0010]本发明的有益效果在于:本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，材料来源于天然细胞，具有优越的生物相容性和传递性能；洋地黄皂苷的引入，可暂时增加细胞膜微囊的通透性，实现多种药物分子的包埋，并调控其包埋量，有望作为多功能药物载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是标记有细胞膜红色荧光探针DiI的细胞膜微囊的荧光照片。
[0012]图2是实施例1所得的细胞膜微囊中的盐酸阿霉素浓度和孵育时间的关系。
[0013]图3是实施例2所得的细胞膜微囊中的钆喷酸葡胺浓度和孵育时间的关系。
[0014]图4是实施例3所得的细胞膜微囊中的葡聚糖浓度和孵育时间的关系。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
[0016]实施例1
I)在培养有人血管内皮细胞的培养盘中加入20 μL细胞松弛素b溶液(浓度为Img/mL)，37°C下孵育30min后用磷酸盐缓冲液洗三次，胰酶消化，离心收集细胞；涡旋处理所得细胞Imin ;离心收集所得上清液即为细胞膜微囊悬液。
[0017]将20(^g上述所得的细胞膜微囊分散在ImL磷酸盐缓冲液中；向其中加入lOPLlmg/mL的细胞膜红色染料Dil，使其混合均匀，孵育15min ;将所得细胞膜微囊离心洗涤数次以去除未标记上的染料；分散在磷酸盐缓冲液中的细胞膜微囊的荧光照片见图1。
[0018]2)取200 μg步骤I)所得的细胞膜微囊加入到洋地黄皂苷与盐酸阿霉素的混合溶液中，使洋地黄皂苷与盐酸阿霉素的浓度分别为lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育l~24h ;加入氯化钙溶液，使钙离子浓度为5mM，37°C下孵育2h ;离心磷酸盐缓冲液洗数次，得到装载盐酸阿霉素的细胞膜微囊。根据紫外光谱图中543nm处的吸光度得到不同孵育时间下该微囊中的药物浓度为2.8、6.5、9.3、20.1,28.9Pg/mL，见图2。
[0019]实施例2
同实施例1，区别在于步骤2)，取200 μδ步骤I)所得的细胞膜微囊加入到洋地黄皂苷和钆喷酸葡胺的混合溶液中，使洋地黄皂苷和钆喷酸葡胺的浓度分别为lOPg/mL和200μ8/mL，在37°C孵育3~24h ;加入氯化钙溶液，使钙离子浓度为5mM，37°C下孵育2h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次，得到装载钆喷酸葡胺的细胞膜微囊。根据电感耦合等离子体质谱得到该微囊中药物浓度为0.8、2、16.2Pg/mL，见图3。
[0020]实施例3
同实施例1，区别在于步骤2)，取200 μδ步骤I)所得的细胞膜微囊加入到洋地黄皂苷和荧光素标记的葡聚糖(分子量4kD)的混合溶液中，使洋地黄皂苷和葡聚糖的浓度分别为lOPg/mL和200mg/mL，在37°C孵育3~24h ;加入氯化钙溶液，使钙离子浓度为5mM，37°C下孵育2h ;离心磷酸盐缓冲液洗三次，得到装载葡聚糖的细胞膜微囊。根据荧光光谱图中488nm激发、525nm发射的峰强度得到该微囊中荧光素修饰的葡聚糖的浓度分别为0.8、0.9、1.lPg/mL，见图 4。
【权利要求】
1.一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法，包括以下步骤: 1)在培养有人血管内皮细胞的培养盘中加入20μL浓度为lmg/mL的细胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸盐缓冲液洗数次，胰酶消化收集细胞和细胞膜微囊，离心分离得到细胞膜微囊悬液； 2)取200μg步骤I)所得的细胞膜微囊加入到1mL洋地黄皂苷与药物的混合溶液中，洋地黄皂苷与药物的浓度分别为lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育I~24h ; 3)在步骤2)的溶液中加入1OPL0.5mol/mL氯化钙溶液，37°C下孵育2h ;离心收集微囊，洗涤，得到装载药物的细胞膜微囊。
2.根据权利要求1所述的在细胞膜微囊中高效装载药物的方法，其特征在于所述的药物是盐酸阿霉素、钆喷酸葡胺或葡聚糖。
【文档编号】A61K47/46GK103920161SQ201410117807
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】毛峥伟, 张元洪 申请人:浙江大学