一种可吸收复合界面的螺钉及制备方法
【专利摘要】本发明提供一种可吸收复合界面的螺钉，由螺钉帽、螺杆、螺钉头连接件、基因薄层构成，螺杆外缘设有自攻螺纹，基因薄层覆盖在螺纹表面。基因薄层由壳聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆有透明质酸层和脂质体-2000包裹的pEGFP-COMP质粒层形成的活化层。本发明利用壳聚糖、透明质酸、脂质体的静电作用使质粒pEGFP-COMP在界面螺钉表面逐层沉积。本发明具有良好的生物相容性和骨诱导性，能有效调控COMP基因的释放以增强促钙化纤维软骨效应，提高宿主细胞转染率，诱导韧带植入后骨-韧带界面良好愈合，可实现关节内韧带重建手术联合基因治疗。本发明设计合理，操作便捷且成本低廉，具有极强的可行性，适合用于产业化应用。
【专利说明】一种可吸收复合界面的螺钉及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属关节内韧带重建术中界面螺钉的制造，具体涉及一种COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉及其制备方法。
【背景技术】
[0002]关节镜下韧带重建术是目前治疗关节内韧带损伤、恢复关节稳定性及功能有效的外科治疗手段，据美国骨科运动医学学会(AOSSM)统计，全球每年至少60万人进行关节内韧带重建术，占关节手术的21.6%。尽管该技术临床上取得了巨大的疗效，但是骨-韧带界面愈合难题仍然困扰着广大临床工作者，一旦韧带-骨界面愈合不良，很有可能导致整个手术失败。因此如何提高韧带-骨愈合是决定手术远期疗效和预防术后并发症的关键因素。
[0003]目前，临床常用的韧带固定方法是经骨髓道可吸收界面螺钉固定。界面螺钉多由左旋聚乳酸(poly L-1actic acid, PLLA)构成。PLLA具有良好的生物相容性和适宜的降解速度，随着自身材料的吸收，骨组织同步的填充整个隧道，使植入韧带与隧道形成良好的愈合。
[0004]然而，单纯的PLLA没有骨诱导功能，可因隧道内成骨速度与PLLA吸收程度不匹配而使隧道扩大，韧带固定不稳。临床上当前运用复合羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)的可吸收螺钉在诱导成骨方面有一定程度改善，然而，由于人工合成HAP与人体骨骼中HAP存在尺寸差异，导致成骨效果依旧不佳。因此，通过构建近似于人体HAP的20纳米HAP与PLLA制备可吸收界面螺钉可改进其诱导成骨活性。
[0005]同时，相关研究指出，人体正常韧带-骨连接结构中的钙化纤维软骨层是连接韧带和骨组织的主要过渡结构。钙化纤维软骨主要由大量细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)包绕少量肥大软骨细胞构成。非胶原蛋白作为ECM中的主要组成部分，其中软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)具有诱导基质干细胞粘附、软骨分化、参与调控ECM与骨组织见的构建，维持钙化软骨过渡结构的作用。
[0006]壳聚糖、透明质酸均具有良好的生物相容性和可降解性，广泛应用于组织工程领域。脂质体因其良好的脂溶性常作为细胞转染的工具，通过构建pEGFP-COMP重组质粒，并利用脂质体进行包裹可以有效提高重组质粒的转染效率，并方便借助绿色荧光蛋白监控转染效率。借助层层静电自组装技术，利用壳聚糖、透明质酸、脂质体所带电荷的正负性，将pEGFP-COMP组装至可吸收界面螺钉表面，在生理条件下促使基因薄层降解并长时间释放质粒DNA，利用基因治疗手段促进钙化纤维软骨形成以促进骨-韧带愈合。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一是提供一种可吸收复合界面的螺钉，是一种软骨寡聚基质蛋白(COMP)基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉，该界面螺钉具有良好的生物相容性和骨诱导性，最重要的是能够 有效的调控COMP基因的释放以增强促钙化纤维软骨效应，提高宿主细胞转染率，诱导韧带植入后骨-韧带界面良好愈合，为关节内韧带重建手术联合基因治疗提供全新思路。
[0008]本发明所述的一种可吸收复合界面的螺钉，由螺钉帽1、螺杆2、螺钉头3、连接件
4、基因薄层5构成，螺钉帽I与螺杆2通过连接件4固定连接，螺钉头3设置在螺杆2头端，螺钉帽I上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽6，螺杆2外缘设有自攻螺纹7，基因薄层5覆盖在螺杆螺纹表面。
[0009]所述基因薄层5由壳聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆有透明质酸层和脂质体-2000包裹的pEGFP-COMP质粒层形成的活化层。壳聚糖基底层为I层，所述活化层中脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒层和透明质酸层总层数为4-24层。
[0010]本发明的目的之二是提供所述的可吸收复合界面的螺钉的制备方法，通过以下步骤:
(1)左旋聚乳酸(PLLA)以0.2g mr1的浓度溶解于I，4-环氧六环溶液中，然后加入20羟基磷灰石(HAP)粉末，上述两者质量比为2:8进行混合； (2)将直径为280-450um的NaCl颗粒加入直径为4mm的螺钉模型中紧密填充，置于70°C饱和水蒸气的环境中1.5h，室温冷却后，将步骤(1)所得的PLLA/20HAP混合物缓慢加入其中，在0.07-0.08Mpa条件下抽真空除去气泡，在_40°C冰箱中预冻3小时后进行冷冻24h,作为样品；
(3)将步骤(2)中制得的样品浸泡在蒸馏水中24h，除去NaCl，再次冷冻干燥制得PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉；
(4)将步骤(3)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于壳聚糖溶液中30分钟后，用opt1-DMEM培养液浸洗2-3次，每次1_2分钟；
(5)将步骤(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于透明质酸溶液中10-15分钟后，用去离子水浸洗2-3次，每次1-2分钟；
(6)将步骤(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的opt1-DMEM培养液中10-15分钟后，用去离子水浸洗2_3次，每次1_2分钟；
(7)依次重复步骤(5)和步骤(6)，直至得到所需的COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉。
[0011]所述的壳聚糖溶液的浓度为5mg/ml ;所述的透明质酸溶液浓度为0.5mg/ml。
[0012]所述的脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的opt1-DMEM培养液中，将200ul脂质体-2000与IOOug质粒混合，培养液的pH值为7.4。
[0013]本发明的有益效果是:
1、本发明具有良好的生物相容性和骨诱导性，最重要的是能够有效的调控COMP基因的释放以增强促钙化纤维软骨效应，提高宿主细胞转染率，诱导韧带植入后骨-韧带界面良好愈合，具有广阔的临床运用前景。
[0014]2、本发明突破了传统手术治疗关节内韧带损伤的模式，运用手术治疗结合基因治疗，将促进钙化纤维软骨形成的COMP基因直接组装在螺钉表面并有效控制其释放到局部组织发挥效应，为关节内韧带损伤的治疗提供全新思路。
[0015]3、本发明所述的制造方法中利用脂质体包裹pEGFP-COMP，充分发挥脂质体的脂溶性及其与细胞膜的亲和力，可有效的增加单一质粒层的细胞转染效率，更好地发挥基因治疗的效力。
[0016]4、本发明所述的制造方法利用壳聚糖、透明质酸、脂质体的静电作用使质粒pEGFP-COMP在界面螺钉表面逐层沉积，不仅操作便捷而且成本低廉，具有极强的可行性，适合用于产业化应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明主视结构示意图。
[0018]图2为本发明横断面基因薄层组装示意图。
[0019]图3为本发明基因薄层表面样貌的扫描电镜照片。
[0020]图4为本发明随组装基因薄层层数增加表面接触角变化趋势。
[0021]图5为本发明随组装基因薄层层数增加260nm紫外吸光度变化趋势。
[0022]图6为不同层数的基因薄层转染间充质干细胞共培养48h荧光显微镜照片。
[0023]图7为不同层数的基因薄层转染间充质干细胞共培养48hGFP荧光强度变化趋势。
【具体实施方式】
[0024]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0025]实施例1
参见图1、图2，本发明所述的一种可吸收复合界面的螺钉，由螺钉帽1、螺杆2、螺钉头
3、连接件4、基因薄层5构成，螺钉帽I与螺杆2通过连接件4固定连接，螺钉头3设置在螺杆2头端，螺钉帽I上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽6，螺杆2外缘设有自攻螺纹7，基因薄层5覆盖在螺杆螺纹表面。
[0026]实施例2C0MP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉制造并表征检测
(1)PLLA以0.2g ml-1的浓度溶解于1，4-环氧六环溶液中，然后加入20HAP粉末，上述两者质量比为2:8进行混合；
(2)将直径为280-450um的NaCl颗粒加入直径为4mm的螺钉模型中紧密填充，置于70°C饱和水蒸气的环境中1.5h，室温冷却后，将步骤(1)所得的PLLA/20HAP混合物缓慢加入其中，在0.07-0.08Mpa条件下抽真空除去气泡。在_40°C冰箱中预冻3小时后进行冷冻24h ；
(3)将步骤(2)中制得的样品浸泡在蒸馏水中24h，除去NaCl，再次冷冻干燥制得PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉；
(4)将步骤(3)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于5mg/ml壳聚糖溶液中30分钟后，用opt1-DMEM培养液浸洗2次，每次I分钟；
(5)将步骤(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于0.5mg/ml透明质酸溶液中10分钟后，用去离子水浸洗2次，每次I分钟；
(6)将步骤(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的pH为7.4的opt1-DMEM培养液中10分钟后，用去离子水浸洗2次，每次1-2分钟；
(7)依次重复步骤(5)和步骤(6)，直至得到所需的COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉。
[0027]所述的脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的opt1-DMEM培养液中，将200ul脂质体-2000与IOOug质粒混合，培养液的pH值为7.4。
[0028]通过场发射扫描电子显微镜检测本发明基因薄层表面样貌。通过静滴接触角测量仪检测基因薄层组装过程中依次组装各层的表面接触角。通过紫外分光光度计检测基因薄层组装过程中依次组装一组透明质酸+pEGFP-COMP质粒层的260nm紫外吸光度。
[0029]本实例中，透明质酸层和pEGFP-COMP质粒层总层数不低于4层可维持界面螺钉表面较稳定的基因薄层结构，通过增加基因薄层层数以达到调控界面螺钉转载基因量的目的。总层数以4-24层最佳，从而实现特定时间内质粒DNA保证一定浓度持续释放，同时避免过多层数所导致质粒DNA短时间释放难以控制或过量。
[0030]本实例中，界面螺钉在壳聚糖溶液中可浸泡30分钟，但并不代表本发明将其局限于30分钟，浸泡的目的在于使壳聚糖层能够借助其所带的正电荷充分吸附界面螺钉表面，浸泡时间长壳聚糖聚阳离子层的充分形成，为随后的基因薄层组装打下聚阳离子薄层基础。因此浸泡时间以壳聚糖层充分形成为宜。
[0031]本实例中，界面螺钉在透明质酸及opt1-DMEM培养液中可浸泡10_15分钟，但并不代表本发明将其局限于10-15分钟，浸泡的目的在于使透明质酸层及脂质体包裹质粒层能够借助层层静电自组装的原理依次间隔附于界面螺钉表面，浸泡时间长更利于聚阴离子或聚阳离子层的充分形成，使其在界面螺钉覆盖更完整，单层更加平整。因此浸泡时间以各层达到最佳覆盖效果为宜。
[0032]本实例中，界面螺钉在各溶液中浸泡结束后，均需要用去离子水进行浸泡洗涤，各个过程中去离子水浸洗次数为2-3次，每次1-2分钟为宜。原因在于浸洗的主要目的是去除在同一层中可能形成的双层或多层聚阴、阳离子，以免导致随后的组装结构失去稳定，同时浸洗时间过长易导致已组装的多层结构发生解离。
[0033]参见图3，结果显示，随组装基因薄层层数增加表面粗糙程度逐渐增加，说明组装过程中界面螺钉表面活性物质持续增加。
[0034]参见图4，结果显示，随组装基因薄层层数增加表面接触角呈波动性变化。说明组装过程中界面螺钉表面呈两种物质交替性组装。
[0035]参见图5，结果显示，随组装基因薄层质粒层数增加260nm紫外吸光度增加。说明随组装层数的增加，基因数量逐渐增加。
[0036]实施例3不同层数的基因薄层对间充质干细胞转染的效率探究。
[0037]采用例I的制造方法，分别制造0、4、8和12层的COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉。采用密度梯度离心法和差时贴壁法培养SD大鼠间充质干细胞，将间充质干细胞接种到六孔板与不同层数的界面螺钉共培养，细胞接种密度为40000cells/cm2。用DMEM培养基加10%胎牛血清进行培养。48h后用荧光显微镜观察不同层数的各组中GFP荧光以检测细胞转染情况，通过IPP6.0软件计算各组中GFP荧光强度。
[0038]参见图6、7，结果显示，随界面螺钉基因薄层层数增加，GFP荧光强度增加。说明界面螺钉上的基因薄层有效释放基因，并随基因数量增加转染效率逐渐提高。
[0039]实施例4不同层数的基因薄层对间充质干细胞成纤维软骨影响 采用例I的制造方法，分别制造0、4、8和12层的COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉。采用密度梯度离心法和差时贴壁法培养SD大鼠间充质干细胞，将间充质干细胞接种到六孔板与不同层数的界面螺钉共培养，细胞接种密度为20000cells/cm2。用DMEM培养基加10%胎牛血清进行培养，每隔2天换液一次。5d后以0.25%胰酶消化，收集细胞，用TRIzol裂解细胞，提RNA后行RT-PCR，检测不同层数的各组中II型胶原纤维的表达量。[0040]无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域的技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而并非以任何方式限制本发明的应用范围。所以本发明的主要范围将由附属的权利要求及其等同体来确定。
【权利要求】
1.一种可吸收复合界面的螺钉，其特征在于，由螺钉帽(I)、螺杆(2)、螺钉头(3)、连接件(4)、基因薄层(5 )构成，螺钉帽(I)与螺杆(2 )通过连接件(4)固定连接，螺钉头(3 )设置在螺杆(2)头端，螺钉帽(I)上端设有与安装螺钉扭力扳手相对应的凹槽(6)，螺杆(2)外缘设有自攻螺纹(7 )，基因薄层(5 )覆盖在螺杆螺纹表面。
2.根据权利要求1所述的一种可吸收复合界面的螺钉，其特征在于，基因薄层(5)由壳聚糖的基底层及由内向外依次间隔覆有透明质酸层和脂质体-2000包裹的pEGFP-COMP质粒层形成的活化层，壳聚糖基底层为I层，所述活化层中脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒层和透明质酸层总层数为4-24层。
3.根据权利要求1所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法，其特征在于，通过以下步骤: (1)左旋聚乳酸以0.2g mr1的浓度溶解于1，4_环氧六环溶液中，然后加入20HAP粉末，上述两者质量比为2:8进行混合； (2)将直径为280-450um的NaCl颗粒加入直径为4mm的螺钉模型中紧密填充，置于70°C饱和水蒸气的环境中1.5h，室温冷却后，将步骤(1)所得的PLLA/20HAP混合物缓慢加入其中，在0.07-0.08Mpa条件下抽真空除去气泡，在_40°C冰箱中预冻3小时后进行冷冻24h,作为样品； (3)将步骤(2)中制得的样品浸泡在蒸馏水中24h，除去NaCl，再次冷冻干燥制得PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉； (4)将步骤(3)中 制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于壳聚糖溶液中30分钟后，用opt1-DMEM培养液浸洗2-3次，每次1_2分钟； (5)将步骤(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于透明质酸溶液中10-15分钟后，用去离子水浸洗2-3次，每次1-2分钟； (6)将步骤(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收复合界面螺钉浸于脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的opt1-DMEM培养液中10-15分钟后，用去离子水浸洗2_3次，每次1_2分钟； (7)依次重复步骤(5)和步骤(6)，直至得到所需的COMP基因薄层组装的可吸收复合界面螺钉。
4.根据权利要求3所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法，其特征在于，壳聚糖溶液的浓度为5mg/ml,透明质酸溶液浓度为0.5mg/ml。
5.根据权利要求3所述的一种可吸收复合界面的螺钉的制备方法，其特征在于，脂质体包裹的pEGFP-COMP质粒的opt1-DMEM培养液中，将200ul脂质体-2000与IOOug质粒混合，培养液的pH值为7.4。
【文档编号】A61L31/08GK103893836SQ201410128124
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】严世贵, 吴浩波, 师钟丽, 刘安 申请人:浙江大学