一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种可溶性表达人脑利钠肽（HumanBrainNatriureticPeptide，hBNP）重组蛋白的方法，包括如下步骤：1）获得重组基因：获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因His-DsbAmut-BNP，所述重组基因的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列；2）获得重组质粒：将上一步获得的重组基因插入载体质粒，获得含有重组基因的重组质粒；3）获得基因工程菌：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；4）表达外源基因：基因工程菌发酵，表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；5）纯化目的蛋白：裂解菌体，收集融合蛋白，通过蛋白酶酶切去除分子伴侣、层析纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。
【专利说明】一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用。本发明还涉及一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因。
【背景技术】
[0002]随着人口老龄化进程的加快与高血压、冠心病等常见心血管病发病率的上升，心衰的患病率正逐年升高。根据美国的统计资料显示，美国目前有490万心衰患者，并且每年有40-70万新增患者，人群中心衰的患病率约为1.5%-2.0%，65岁以上人群可达6%-10%。在过去8年中，由于心衰导致的死亡人数增加了 6倍。在2000-2001年亚洲心血管病国际合作研究中，中国心血管健康多中心合作研究组研究结果显示，我国成年人心衰的患病率为
0.9%，其中35-74岁成年人中约有400万心衰患者。
[0003]目前充血性心衰治疗主要包括:静脉注射强心药(洋地黄类药、拟肾上腺素类药、磷酸二酯酶抑制剂等)和扩血管药(硝化甘油、硝普钠等)。但产生的副作用表现在:药物耐受性、心动过速及其它心律失常、低血压、以及激活与心力衰竭病理过程有关的神经激素-血管紧张素系统。近年来研究发现，人脑利钠肽作为人体分泌的内源性多肽，可降低心脏前、后负荷，改善慢性心脏病人急性发作时的症状，具有强心和扩张血管作用。对于改善充血性心力衰竭(CHF)病人的血液动力学，如动脉和静脉扩张、增加钠排泄以及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮和交感神经系统有较好的作用，同时人脑利钠肽不强制性地增强心肌的收缩能力，且没有目前扩血管药和利尿药物对血压和心率改变的副作用；作为药物不论从其对不良反应的控制或者疗效等方面考虑均明显优于传统药物。
[0004]人脑利钠妝(HumanBrain Natriuretic Peptide, hBNP)又称B型利钠妝(B-typeNatriuretic Peptide),最初是由日本学者Sudoh在1988年从猪脑分离出来因而得名，实际上它主要来源于心室。BNP是心力衰竭时人体分泌的作为代偿功能的一种内源性多肽，是继心钠肽(Atrial Natriuretic Peptide, ANP)后利钠肽家族的又一成员，利钠肽家族主要包括心钠肽、脑利钠肽、C型利钠肽(C-type Natriuretic Peptide, CNP), D型利钠肽(D-type Natriuretic Peptide, DNP)以及尿钠肽(Urodilati)0 在心脏中，BNP 主要存在于左右心房，其中右心房含量最高，但60%的分泌来自心室。生理状态下，心房、心室合成和分泌少量的BNP，因此正常人循环血液中仅有低浓度的BNP，在病理状态下，如心室壁张力增加时，BNP由心肌组织大量合成与释放。正是由于脑利钠肽的这种病理状态下的变化，可以通过对人体中的BNP浓度来诊断心力衰竭及判断预后。有研究表明，BNP对心力衰竭的诊断价值远远超过临床专家的诊断。目前，BNP已经成为诊断心力衰竭的一项生化指标。
[0005]人脑利钠肽与特异性的利钠肽受体(该受体与鸟苷酸环化酶相藕联)结合，引起细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)的浓度升高和平滑肌细胞的舒张。作为第二信使，cGMP能扩张动脉和静脉，迅速降低全身动脉压、右房压和肺毛细管楔压，从而降低心脏的前、后负荷，并迅速减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状。
[0006] 脑利钠肽是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的天然拮抗剂，它可以拮抗心肌细胞、心纤维原细胞和血管平滑肌细胞内的内皮素、去甲肾上腺素和醛固酮。它可以提高肾小球滤过率，增强钠的排泄，减少肾素和醛固酮的分泌，亦抵制后叶加压素及交感神经的保钠保水、升高血压作用。脑利钠肽参与血压、血容量以及水盐平衡的调节，增加血管通透性，降低体循环血管阻力及血浆容量，从而降低了心脏前、后负荷，并增加心输出量。同时脑利钠肽没有正性肌力作用，不增加心肌的耗氧。
[0007]脑利钠肽的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成脑利钠肽成本高，价格昂贵，产业化困难。现阶段普遍采用的重组BNP制备方法主要采用自身串联融合表达和与其他载体蛋白融合表达两种，大都在胞内积累，易形成包涵体，而从包涵体复性具有生物活性的蛋白，需要经过一系列的变性复性的过程，工艺复杂且收率较低。同时，也有采用添加曲拉通X-100的化学渗透发酵方法，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外。但是加入曲拉通会对会使菌体破裂，曲拉通加入量和提高蛋白收率的矛盾无法解决。为了解决上述问题，本发明用基因重组技术，实现BNP在大肠杆菌中的可溶性高效表达，制备高纯度、高活性的人脑利钠肽。
[0008]分子伴侣是指一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他多肽或蛋白形成特定的构象，完成正确的组装，在生物体内起着稳定新生蛋白、辅助其他蛋白质正确折叠、组装、转运甚至降解的作用。在胁迫条件下，分子伴侣起到稳定蛋白质结果的作用并防止蛋白质凝聚、变性，还具有修复变性蛋白的功能，对蛋白质功能的发挥具有重要意义。
[0009]第一个分子伴侣---核质蛋白(nucleoplasmin)是Laskey等人于1978年在非洲
爪蟾卵的浸出液中发现的，他们通过研究组蛋白与DNA结合形成核小体的过程中，必须依靠一种酸性核蛋白的参与才能完成他们的装配。
[0010]迄今为止发现的大多数分子伴侣都属于热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的范畴，大致可主要分为伴侣素家族(chaperonin, Cpn)、热休克蛋白70家族(HSP70 family)、热休克蛋白90家族(HSP 90 family)以及热休克蛋白100家族等(HSP 100family)。分子伴侣因其可以促进蛋白质形成正确结构、提高蛋白质稳定性而在工业上具有
重要意义。
【发明内容】
[0011]本发明包括以下按顺序排列的段落所述的主题:
1.一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法，包括以下步骤:
O获得重组基因:获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列；
2)获得重组质粒:将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒；
3)获得基因工程菌:将上 一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；
4)表达外源基因:基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；
5)纯化目的蛋白:裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。[0012]2.根据段落I所述的方法，其特征在于所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A(DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KD0合成酶(CKS)、硫氧还蛋白(Trx)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。
[0013]3.根据段落I所述的方法，其特征在于所述纯化标签蛋白选自6XHis(His-Tag)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或FLAG?。
[0014]4.根据段落I所述的方法，其特征在于所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶。
[0015]5.根据段落I所述的方法，其特征在于人脑利钠肽基因序列为经过密码子优化的基因序列。
[0016]6.根据段落I所述的方法，其特征在于重组基因rhBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与质粒进行同源重组的序列。
[0017]7.根据段落I所述的方法，其特征在于所述质粒为含有T7强启动子的原核表达质粒。
[0018]8.根据段落7所述的方法，其特征在于所述质粒为含有卡那霉素抗性的原核表达质粒。
[0019]9.根据段落I所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0020]10.根据段落I所 述的方法，其特征在于所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为亲和层析、酶切融合蛋白、离子交换层析、反相层析和离子交换层析。
[0021]11.根据段落10所述的方法，其特征在于所述五步纯化法具体步骤为:
1)亲和层析:ChelatingSepharose F.F.层析柱初步分离融合蛋白；
2)酶切融合蛋白:用凝血酶或肠激酶酶切步骤I)获得的融合蛋白，获得酶解液；
3)阳离子交换层析:阳离子交换柱纯化步骤2)获得的酶解液，分离得到初步纯化的重组人脑利钠肽；
4)反相层析:Source15 RPC反相层析介质，获得进一步纯化的重组人脑利钠肽；
5)阳离子交换层析:SPSepharose Fast Flow阳离子交换柱纯化步骤4)获得的样品，去除杂质，获得目的蛋白重组人脑利钠肽。
[0022]12.一种可溶性表达人脑利钠肽的重组基因rhBNP，其特征在于，所述重组基因rhBNP的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列。
[0023]13.根据段落12所述的重组基因rhBNP，其特征在于，所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A (DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KD0合成酶(CKS)、硫氧还蛋白(Trx)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。
[0024]14.根据段落12所述的重组基因rhBNP，其特征在于，所述纯化标签蛋白选自6 XHis (His-Tag)、谷胱甘肽 S 转移酶(GST)或 FLAG?。
[0025]15.根据段落12所述的重组基因rhBNP，其特征在于所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶。
[0026]16.根据段落12所述的重组基因rhBNP，其特征在于重组基因hBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与质粒进行同源重组的序列。
[0027]17.段落12-16任一项所述重组基因表达的重组人脑利钠肽蛋白。[0028]18.通过段落1-11任一项所述方法获得的重组人脑利钠肽蛋白。
[0029]19.段落17-18任一项所述重组人脑利钠肽在制备治疗心衰疾病的药物中的应用。
[0030]为解决融合蛋白表达易形成包涵体进而导致复性过程复杂且成本高，以及通过复性过程获得的蛋白活性较差等问题，本发明提供了一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法，该方法包括如下步骤:
O获得重组基因:获得表达人脑利钠肽蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利纳妝基因序列；
2)获得重组质粒:将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒；
3)获得基因工程菌:将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；
4)表达外源基因:基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；
5)纯化目的蛋白:裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。
[0031]在一种较佳的实施方式中，所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A(DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KDO合成酶(CKS)、硫氧还蛋白(Trx)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。
[0032]在一种较佳的实施方式中，所述纯化标签蛋白选自6XHis (His-Tag)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或 FLAG?，优选为 6 X Hi s (His-Tag)。
[0033]在一种较佳的实施方式中，所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶，优选为凝血酶。
[0034]在一种较佳的实施方式中，所述人脑利钠肽基因序列为根据表达宿主在密码子使用上的偏好进行过密码子优化的基因序列。
[0035]在较佳的实施方式中，重组基因rhBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与载体进行同源重组的序列。
[0036]在一种较佳的实施方式中，所述质粒为含有T7强启动子的原核表达质粒,优选为PET系列质粒。更佳的，所述质粒为含有卡那霉素抗性的原核表达质粒。优选的，所述质粒为 pET28a。
[0037]在一种较佳的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0038]在一种较佳的实施方式中，所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为亲和层析、酶切融合蛋白、离子交换层析、反相层析和离子交换层析。更佳的，所述五步纯化法具体步骤为:
1)亲和层析:用ChelatingSepharose F.F.层析柱初步分离融合蛋白；
2)酶切融合蛋白:用凝血酶或肠激酶酶切步骤I)获得的融合蛋白，获得酶解液；
3)阳离子交换层析:用SPSepharose Fast Flow阳离子层析柱纯化步骤2)获得的酶解液，分离得到初步纯化的重组人脑利钠肽；
4)反相层析:用Source15 RPC反相柱，获得进一步纯化的重组人脑利钠肽；
5)阳离子交换层析:用SPSepharose Fast Flow阳离子层析柱纯化步骤4)获得的样品，去除杂质，获得目的蛋白重组人脑利钠肽。
[0039]进一步的，本发明提供了一种可溶性表达人脑利钠肽的重组基因rhBNP，所述重组基因的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列。
[0040]在一种较佳的实施方式中，所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A(DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KDO合成酶(CKS)、硫氧还蛋白(Trx)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。
[0041]在一种较佳的实施方式中，所述纯化标签蛋白选自6XHis (His-Tag)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或FLAG?。
[0042]在一种较佳的实施方式中，所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶。
[0043]在一种较佳的实施方式中，所述人脑利钠肽基因序列为根据表达宿主在密码子使用上的偏好进行过密码子优化的基因序列。
[0044]在一种较佳的实施方式中，重组基因rhBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与质粒进行同源重组的序列。
[0045]进一步的，本发明提供了上述重组基因rhBNP表达的重组人脑利钠肽蛋白或通过上述方法获得的重组人脑利钠肽蛋白。
[0046]更进一步的，本发明提供了上述重组人脑利钠肽蛋白在制备治疗心衰疾病的药物中的应用。
[0047]本发明的有益效果:本发明提供的重组基因rhBNP，其表达的重组蛋白不形成包涵体，而主要表达于大肠杆菌周质空间中。这样破菌后可以直接从破菌上清液中得到目标蛋白，避免了从包涵体复性得到具有生物活性的蛋白的过程。本发明提供的重组蛋白表达纯化方法，操作简捷易重复，可高效的获得符合药品审批标准的高纯度、高活性的重组人脑利钠肽蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1 pET_28a质粒物理图谱
图2 pET-28a-DsbAmut-BNP质粒测序结果
图3 His-DsbAmut-BNP融合蛋白在工程菌万.Coli BL21 (DE3)内表达的SDS-PAGE电泳
分析
图4亲和层析分离纯化His-DsbAmut-BNP融合蛋白SDS-PAGE电泳分析 图5HiS-DSbAmut-BNP融合蛋白凝血酶酶切前后SDS-PAGE电泳分析 图6 His-DsbAmut-BNP融合蛋白凝血酶酶切后HPLC液相检测谱图 图7融合蛋白酶切后阳离子交换纯化Buffer E洗脱液相检测谱图 图8重组人脑利钠肽反相纯化液相谱图 图9质谱法检测重组 人脑利钠肽分子量谱图 图10高效液相色谱法检测重组人脑利钠肽纯度谱图 图11重组人脑利钠肽活性检测谱图 图12重组人脑利钠肽氨基酸序列分析谱图。【具体实施方式】
[0049]本发明利用基因工程的方法，获得表达重组人脑利钠肽蛋白的重组基因rhBNP，将该重组基因序列克隆至表达载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组人脑利钠肽蛋白。
[0050]具体来讲，重组基因rhBNP序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列。重组基因两端还可包含限制性酶切位点或用于与载体进行同源重组的序列。通过分子克隆的方法将重组基因rhBNP插入到原核表达载体中，转化大肠杆菌宿主细胞，表达含有纯化标签蛋白、分子伴侣蛋白、蛋白酶识别位点和人脑利钠肽蛋白的融合蛋白。最后通过亲和层析、阳离子交换、反相层析等步骤分离纯化融合蛋白，获得重组人脑利钠肽蛋白。
[0051]获得重组基因的方法包括人工基因合成方法或PCR扩增方法等。
[0052]下面将通过具体实施例来进一步详细说明。然而应当理解，具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。本申请中所用到的仪器、设备、试剂、方法等如未特别指明，均为本领域常用的仪器、设备、试剂及方法。
[0053]实施例一 BNP密码子优化
分别人工合成 DsbAniut-WtBNP (SEQ ID Noll)与 DsbA_-optBNP (SEQ ID No3)基因序列(Invitrogen合成),并在基因片段中分别引入His-Tag组氨酸标签序列及凝血酶酶切位点序列，在人工合成的基因片段5’端引入Afc0 I内切酶位点，3’端Hiind III内切酶位点。将合成片段和pET28a ( + )载体分别经Afco \与Hind III双酶切，T4 DNA连接酶连接基因片段和载体片段，常规转化DH5ci感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选得到阳性克隆，提取质粒后进行基因测序，留取正确的克隆和质粒。
[0054]WtBNP 基因序列为(SEQ ID No I):
5’-AGC CCC AAG ATG GTG CM GGG TCT GGC TGC TTT GGG AGG MG ATG GAC CGG ATCAGC TCC TCC AGT GGC CTG GGC TGC AAA GTG CTG AGG CGG CAT TAA TAA AAG CTT-3’optBNP 基因序列为(SEQ ID No 2):
5’-TCT CCG AM ATG GTT CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATCTCT TCT TCT TCT GGT CTG GGT TGC AAA GTT CTG CGT CGT CAC TAA TAA AAG CTT-3，
将质粒转化至大肠杆菌BL21中，培养至OD6tltl为0.8时加入终浓度为0.5 mM的IPTG诱导目的蛋白表达。诱导培养4 h后，1000Orpm离心收获菌体，通过12% SDS-PAGE电泳进行蛋白表达量分析，结果如表1所示。
【权利要求】
1.一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法，包括以下步骤: 1)获得重组基因:获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列； 2)获得重组质粒:将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒； 3)获得基因工程菌:将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌； 4)表达外源基因:基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白； 5)纯化目的蛋白:裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A(DsbA)、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体(DsbAmut)、CMP-KDO合成酶(CKS)、硫氧还蛋白(Trx)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纯化标签蛋白选自6XHis(His-Tag)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或FLAG?。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人脑利钠肽基因序列为经过密码子优化的基因序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于重组基因rhBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与质粒进行同源重组的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒为含有T7强启动子的原核表达质粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述质粒为含有卡那霉素抗性的原核表达质粒。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为亲和层析、酶切融合蛋白、离子交换层析、反相层析和离子交换层析。
【文档编号】A61P9/04GK103923937SQ201410139968
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】邹卫, 张世光, 周晓雷, 宋浩雷, 延志芬 申请人:石家庄沃泰生物科技有限公司