治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物，所述药物包括伊马替尼和阿的平，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:8—1：12，并提供了阿的平在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。本发明发现阿的平可以降低CML细胞K562、耐药细胞K562-R及32D-Bcr/ablT315I细胞中的Bcr/abl及其磷酸化蛋白水平，降低CML病人白血病细胞中的Bcr/abl蛋白，与伊马替尼的组合能协同以较低剂量引起对CML细胞的杀伤效应，并对慢性粒细胞白血病的耐药细胞同样有效，而对正常人外周血单个核细胞无明显毒副效应。阿的平和伊马替尼均为临床应用成熟的药物，具有服用方便，费用低廉等优点，为临床上治疗CML提供新的更为有效的治疗方案。
【专利说明】治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，更具体地讲，涉及一种治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物。
【背景技术】
[0002]慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于造血干细胞的血液系统恶性肿瘤，在我国的年发病率约为0.36/10万，中位发病年龄为40-50岁。CML表现为患者骨髓内髓系细胞不受限制地大量增殖、聚集，抑制骨髓正常造血，并且恶性粒细胞通过血液向全身扩散，导致患者出现贫血、出血、感染及器官浸润，从而严重危害患者身体健康甚至导致死亡。约有95%的CML患者存在特征性的t(9 ;22)染色体易位，该易位形成Bcr/abl融合基因，编码的Bcr/abl融合蛋白具有持续的酪氨酸蛋白激酶活性，能够活化下游STAT5，AKT, NF B等多条信号通路，促进细胞的增殖和存活，是CML发病的分子基础。基于对Bcr/abl蛋白分子结构及其酪氨酸激酶功能的研究，以它作为靶标寻找治疗CML的特效药物成为相关领域研究的重要热点。90年代,Zimmermann研究组经过筛选发现,小分子化合物伊马替尼(Imatinib, IM,Gleevec, CGP-57148B, STI571)能够通过竞争性抑制Bcr/abl蛋白与ATP结合来特异阻断该融合蛋白的酪氨酸激酶活性，从而抑制CML细胞增殖并促使其凋亡。2001年美国FDA批准其用于临床治疗CML，并逐渐成为CML的一线治疗措施。Imatinib的发现，是CML治疗史上的革命性突破，使得CML的治疗进入了 Imatinib时代。Imatinib及第二代和第三代药物的开发和应用使得慢性粒细胞性白血病患者的生存时间由4-5年延长至10-20年。但是酪氨酸激酶抑制剂的应用尚不能根治CML。 [0003]在Imatinib疗效获得肯定的同时,它的缺陷也逐渐凸现。例如，由于Imatinib并没有真正作用于CML干细胞，导致CML患者必须长时期甚至终身服用该药物，一旦停药后疾病复发或者疾病进展的概率上升；昂贵的药费让患者不堪重负；Imatinib主要针对CML早期患者，对中晚期患者完全缓解率低于30%，且长期使用会出现一系列毒性反应；尤其是部分患者可出现Imatinib耐药且比例逐年上升,大量报道显示这主要与Bcr/abl突变导致其对Imatinib敏感性降低有关；此外，Bcr/abl基因扩增引起该融合蛋白表达增加也是其耐药的重要机制。针对这些问题，一些新的酪氨酸激酶抑制剂如Nilotinib和Dasatinib不断得到开发和应用，但是仍然无法顺利治疗存在T315I突变的CML患者。新发展起来的三代酪氨酸激酶抑制剂Ponatinib，对T315I突变的患者有效，但由于其出现的严重毒副作用而面临撤市，其未来前景还不明朗。上述策略，都着眼于针对变化的酪氨酸激酶活性位点，设计新的分子，从而克服突变带来的耐药。但可以预见，在克服旧的突变位点带来耐药的同时，新的突变位点或突变位点的组合会不断产生，相应的，耐药问题的克服仍任重道远。
[0004]阿得平(Quinacrine，QC)又名疟绦平，麦帕克林，属于吖啶衍生物，是个杂环类三环化合物。由金鸡纳树的树皮中提取，曾被广泛用做染料，抗菌药及抗痕药。Quinacrine最早作为抗疟药物在二战期间被广泛应用，其具有毒副作用小的优点，后逐渐被氯喹(CQ)代替。近年来研究发现QC在肿瘤治疗上有相当强的生物学效应，它具有同时抑制NF- K B通路和激活P53通路，并可以阻断MG-132等蛋白酶体抑制剂引起的细胞体内热休克反应的异常激活，抑制耐药机制中关键蛋白合成等功能。QC抗肿瘤效应机制和效应谱逐渐引起重视。近年来Quinacrine在肿瘤治疗上具有其独特的效用，它与一些肿瘤药物联合可用于治疗肝癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，结直肠癌及P388白血病细胞等。但是Quinacrine是否可以用来治疗CML，目前并不清楚。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是，提供伊马替尼和阿的平联合用药在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0007]本发明所要解决的第三个技术问题是，提供阿的平在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0008]为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物，其特征在于，所述药物包括伊马替尼和阿的平，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为
1:8—1:12o
[0009]作为一个优选方案，所述伊马替尼和阿的平的的质量浓度比为1:10。
[0010]为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了伊马替尼和阿的平联合用药在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0011]作为一个优选方案，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:8 — I:12ο
[0012]作为一个优选方案，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:10。
[0013]为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了阿的平在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0014]作为一个优选方案，所述慢性粒细胞白血病为含Bcr/ablT3151突变的慢性粒细胞白血病。
[0015]本发明的优点在于，本发明发现Quinacrine可以降低CML细胞K562、耐药细胞K562-R及32D-Bcr/ablT3151细胞中的Bcr/abl及其磷酸化蛋白的降解，并可以降低CML病人白血病细胞的Bcr/abl蛋白，与Imatinib的组合能协同引起对CML细胞的杀伤效应,并对慢性粒细胞白血病的耐药细胞同样有效，而对正常人外周血单个核细胞无明显毒副效应。Quinacrine和Imatinib均为临床应用成熟的药物,具有服用方便,费用低廉等优点，为临床上治疗CML提供新的更为有效的治疗方案。
【专利附图】
【附图说明】[0016]图1.Quinacrine引起K562细胞内Bcr/abl及其磷酸化蛋白的降解。(A)Quinacrine的化学结构图。(B)用4μΜ Quinacrine分别处理Κ562细胞12、24、36小时，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl、phospho-Bcr/abl及phospho_STAT5、caspase-3 水平。
[0017]图 2.Quinacrine 引起 32D-Bcr/abl、32D_Bcr/ablT3151、K562 耐药细胞株-K562R、CML病人白血病细胞内Bcr/abl和/或磷酸化蛋白的降解。[0018]图3.Quinacrine不是通过mRNA及蛋白酶体途径导致K562细胞内Bcr/abl及其磷酸化形式蛋白的降解。
[0019]图4.Quinacrine引起的自噬标志物P62、LC3水平的升高与其降解Bcr/abl及其磷酸化形式蛋白的效应无关。
[0020]图5.Quinacrine与Imatinib对K562细胞的协同杀伤效应。
[0021]图6.Quinacrine可明显加强Imatinib对CML细胞的杀伤效应。
[0022]图7.Quinacrine和Imatinib合加对CML细胞形态学的效应。
[0023]图8.Quinacrine 和 Imatinib 诱导 CML 细胞的凋亡。
[0024]图9.Quinacrine和Imatinib合加抑制CML细胞的Bcr/abl通路相关蛋白。
[0025]图10.Quinacrine和Imatinib合加抑制CML病人白血病细胞的克隆形成效应,而对正常人外周血单个核细胞无毒副效应。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027]细胞处理
[0028]人慢性粒细胞白血病细胞K562及其耐药株K562R及32D_Bcr/ablT3151细胞均在含有10%热灭活胎牛血清(FBS，Gibco BRL，Gaithersburg, ML)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μ g/ml)的 RPMI1640 培养基(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)中培养，放置于 37°C，含有5%C02的恒温培养箱中。K562R耐药株细胞每隔一天加入I μ M Imatinib并维持较长时间。32D-Vector细胞需要加入10%的W3细胞上清(含IL3)培养。在实验中，细胞均以2 X IO5/ml 接种，并用相应浓度的 Quinacrine, Imatinib 处理。Imatinib 溶于 DMS0, Quinacrine溶于无菌水，其储存浓度分别为IOmM和20mM。细胞活率用台盼蓝排斥测试法检测。形态观察通过将细胞收集并用细胞离心涂片器(Shandon, Runcorn, UK)甩至载玻片，并用瑞氏姬姆萨染料(BAS0 Diagnostic Inc.，Shanghai, China)染色，在光学显微镜(OlympusBX-51, Olympus Optical, Japan)下观察。
[0029]蛋白印迹分析
[0030]Quinacrine (4 μ Μ,除非特别提出)、Imatinib (0.4 μ Μ,除非特别提出)处理细胞特定的时间后，将Κ562，K562R，32D-Bcr/ablT315I细胞通过离心收集起来并裂解提取蛋白。将蛋白等量上样至6-12%SDS-PAGE胶，进行电泳，并转移印迹至NC膜上(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)。用 5% 脱脂牛奶封闭膜之后，4°C孵育兔源一抗 c_abl (Santa Cruz, CA)、phospho-Bcr (Cell Signaling, Beverly, MA) > STAT5 (SantaCruz,CA)、phospho-STAT5(CelI Signaling, Beverly, MA)、phosphor-Crkl(CelISignaling, Beverly, MA)、Total-Caspase-3 (Cell Signaling, Beverly,MA)、Cleaved-Caspase-3(Cell Signaling, Beverly, MA)或者鼠源一抗 PARP_l(CellSignaling, Beverly, MA)、Crkl (CellSignaling, Beverly, MA)。接着孵育辣根过氧化物酶连接的二抗(Cell Signaling, Beverly, MA)。并采用化学底物发光(Cell Signaling)检测。β-actin抗体(Merck, Darmstadt, Germany)用于检测蛋白的上样量。
[0031]RNA抽提分析
[0032]Quinacrine (4 μ Μ)和Imatinib (0.4 μ Μ)单加或合加处理细胞不同的时间点。将Κ562细胞通过离心收集起来。按照Invitrogen公司TRIzol试剂盒提供的方法提取细胞的总RNA，使用RT-PCR试剂盒(Promega，Madison, WI,USA)反转录成cDNA。实时定量 PCR 在 ABI PRISM7900 实时定量 PCR 仪(Perkin-Elmer, Torrance, CA)中进行，ΙΟμΙ 反应体系如下:2XSYBR Green PCR Master Mixture (Applied Biosystems, FosterCity1CA, USA) 5 μ I, β-actin或者目的基因产物正反向引物各0.05 μ 1，cDNAly I,ddH203.8 μ I。反应程序如下:50°C 2分钟(UNG孵育)，95°C 10分钟(热启动PCR)，重复如下循环40次:95°C 30秒，60°C 60秒，最后在60°C建立溶解曲线。以上所有的反应和检测都在覆盖了透明封口膜的MicroAmp optical96孔反应板上进行。所有PCR反应都采用3个样本，并计算反应实验误差的标准偏差。所有的数据都采用ABIPRISM SDS2.0软件分析。这种仪器配套的软件计算出的阈值threshold cycle (Ct)表示达到一定数值的突光强度(florescence intensity)所需的循环数。应用“ Δ Ct法”，β-actin用以矫正不同反应中所有的RNA的量。
[0033]RNA干扰和病毒包装及转染
[0034]针对P62和ATG5设计特异的RNA干扰的互补核苷酸序列，互补的核苷酸序列由生工生物(上海，中国)合成。合成的核苷酸序列经退火，连接到pSIREN-RetroQVector (Clontech Laboratories, Mountain View, CA)逆转录病毒干扰载体经测序 100%匹配后，进行病毒包装。病毒包装:1) 293T细胞胰酶消化离心后悬于完全培养基；2)取
2.0XlO6细胞接种于IOcm培养皿中并加入IOmL完全培养基；3) 24h后转染准备，293T细胞融合度控制在40%~60%为宜；4)在一个1.5mL的eppendorf管中加入3.75ygPumvc3-gag-pol 质粒，2.5 μ gpCMV-VSV-G 质粒和 3.75 μ gMSCV 逆病毒载体。轻轻混匀。5)取不含抗生素的DMEM470y I于另一灭菌EP管，再加入30 μ I FuGene6并轻轻混匀，室温孵育5分钟。6)将DMEM、FuGene6的混合物加入准备好的质粒中混匀，室温孵育20分钟。7)轻轻滴加DMEM、FuGene6、DNA混合物于待转染的293T细胞中并轻轻旋转混匀。8) 293T细胞培养24h后换入IOmL新鲜培液。9) 48h后收取病毒。
[0035]病毒感染靶细胞:1)感染前一天，选取non-TC treated培养皿(6孔:#351146)。2)用10μ g/mL人源fibronectin于培养箱中包被，6孔培养皿每孔加入2mL。3)孔培养皿每孔加入ImL, 24小时后吸尽fibronectin ;4)计数细胞并配成4X IO5每毫升悬液,接种细胞于包被过的培养皿中，0.5ml/孔(2 X 105)。5)加入病毒上清2ml/孔，立即加入polybrene使终浓度为8μg/ml。6)于22°C~32°C离心感染，1500g，90min。7)每孔加入2.5ml完全培养基稀释polybrene,放回培养箱；8)感染 48h后，加入 0.75 μ g/ml puromycin (Sigma-Aldrich)筛选获得阳性稳转细胞系。
[0036]单个核细胞分离
[0037]采集的标本血液由RPMI1640培养液将其等比稀释，混匀。加Ficoll(Ficoll-Paque Plas，GE Healthy)于15ml无菌离心管中，倾斜离心管，将稀释后的血液缓慢加入，保持血液和Ficoll形成清晰的界面，避免混合，Ficoll与血液的体积比为3:4，使用前需置于室温平衡。400g，室温离心30分钟，由于Ficoll的密度为1.077，人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076~1.090之间，经分离后，血浆和血小板位于上层，红细胞因遇Ficoll凝集成串钱状而沉积于管底故与粒细胞均沉积于下层。中层为淋巴细胞分离液，而单个核细胞则因为与分层液密度相当而密集在血浆层和分层液的界面上，呈白色膜状物。吸取分层液液面的细胞，即可从外周血中分离到单个核细胞。小心将单个核细胞吸取，移至另一无菌15ml离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640洗涤两次，1500rpm室温离心10分钟。末次离心后，若所得细胞中混有红细胞，则加Iml红细胞裂解液重悬细胞，充分混匀后室温孵育10分钟，裂解红细胞。再加入适量RPMI1640洗去红细胞裂解液，即得到单个核细胞待用。
[0038]克隆形成试验
[0039]含细胞因子的甲基纤维素培养基购于Stemcell Technologies。按照说明书操作，将IX IO5左右的病人骨髓单个核细胞与培液、甲基纤维素培养基和Quinacrine (4 μ Μ)、Imatinib (0.4 μ Μ)及 Quinacrine (4 μ Μ)和 Imatinib (0.4 μ Μ)两药合用组充分混合后，吸取含有细胞和药物的培养基Iml置于30mm培养皿中，每个处理组各设3复孔。培养皿置于培养箱中培养，10-14天后观察各组集落数，以50个细胞以上为一个集落数进行计数。
[0040]统计分析
[0041]用于统计的数据均来自于每次3个样本共3次试验的结果，Student’ s t_test用于评价两组之间的差异，P〈0.05被认为具有显著性统计学差异。两药合加协同指数由CompuSyn软件计算，CKl被认为具有协同效应。
[0042]实施例1.Quinacrine 可引起 CML 细胞及含 Bcr/abl_T315I 突变的 32D_Bcr/ablT3151细胞内Bcr/abl及其磷酸化蛋白的减少。
[0043]通过一系列的筛选我们发现4 μ M的Quinacrine可引起经典CML类型细胞-K562细胞内Bcr/abl及/或磷酸化蛋白的减少，并且呈现时间依赖的方式(图1.B)。用4μΜQuinacrine分别处理K562细胞12、24、36小时，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测 Bcr/abl、phospho_Bcr/abl 及 phospho-STAT5、caspase_3 水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。
[0044]图2 显示 Quinacrine 引起 32D-Bcr/abl、32D_Bcr/ablT3151、K562 耐药细胞株-K562R、CML病人白血病细胞内Bcr/abl和/或磷酸化蛋白的降解。以同样浓度的Quinacrine 处理 K562 耐药株细胞一K562R (图 2.A),稳定表达 Bcr/abl 的 32D_Bcr/abl细胞及含Bcr/abl-T315I突变的32D_Bcr/ablT3151细胞(图2.B), CML病人骨髓单个核细胞(图2.C),均发现同样的现象。图2中，(A)用4 μ MQuinacrine分别处理32D_Vector、32D-Bcr/abl、32D-Bcr/ablT3151细胞12、24、36小时，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl、phospho-Bcr/abl水平。(B)用4μΜ Quinacrine分别处理K562R细胞12、24、36小时，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl、phospho-Bcr/abl水平。(C)用4μΜ Quinacrine处理CML病人白血病细胞24小时,细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。
[0045]实施例2.Quinacrine所引起的K562等细胞中Bcr/abl及其磷酸化蛋白降解效应的可能机制
[0046] 由于有文献报道过Quinacrine具有DNA及RNA结合的能力，我们猜测Quinacrine是否影响了 Bcr/abl蛋白的mRNA水平,通过收集Quinacrine处理K562后的RNA做反转及Real-time PCR等实验,我们发现Quinacrine并不能降低Bcr/abl的mRNA水平(图3.A)。图3显示Quinacrine不是通过mRNA及蛋白酶体途径导致K562细胞内Bcr/abl及其磷酸化形式蛋白的降解。(A)用4μ M的Quinacrine分别处理Κ562细胞12、24、36小时，细胞被收集后，利用Trizol法提取细胞内的总RNA，反转成cDNA后，用Real-time PCR检测Bcr/abl的mRNA水平。(B)用4μ M的Quinacrine分别处理Κ562细胞6、12小时，伴或不伴3小时的I μ M蛋白酶体抑制剂MG132处理，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl、phospho-Bcr/abl、及ubiquitin水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。由此我们推测Quinacrine可能是通过蛋白水平引起Bcr/abl的降解,于是我们使用3h的蛋白酶体抑制剂MG132-1 μ M与6h、12h的Quinacrine-4 μ M合加，发现MG132并不能抑制Quinacrine所引起的Bcr/abl的降解(图3.B),就此可基本排除Quinacrine通过蛋白酶体途径降解Bcr/abl的可能性。
[0047]排除上述种种可能机制后，我们想到了自噬途径，首先我们检测了自噬相关标志物P62和LC3蛋白及mRNA水平的变化，惊喜的是Quinacrine-4 μ M以时间依赖的方式同时升高两者的mRNA及蛋白水平(图4.A)。为了进一步研究这些现象是否与Quinacrine所引起的Bcr/abl降解效应有关，我们在K562细胞中敲除了 P62及自噬关键基因ATG5，之后与K562-NC细胞同时用4 μ M的Quinacrine处理，收集上述不同时间点蛋白后观察Bcr/abI及其磷酸化蛋白水平变化，发现这些控制自噬的关键基因敲除后并不能逆转Quinacrine所引起的Bcr/abl降解现象(图4.B)。
[0048]图4显示Quinacrine引起的自卩遼标志物P62、LC3水平的升高与其降解Bcr/abl及其磷酸化形式蛋白的效应无关。(A)用4μ M的Quinacrine分别处理Κ562细胞12、24、36小时，细胞被收集，一部分裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Ρ62、LC3的水平；一部分做RNA抽提及反转处理，最后利用Real-time PCR检测P62及LC3的mRNA水平。(B)利用shRNA技术敲除K562细胞中的P62和ATG5，用4 μ M的Quinacrine分别处理K562-NC、K562-shRNA-P62及K562_shRNA_ATG5细胞各12、24、36小时，细胞被收集裂解后，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl、phospho-Bcr/abl、P62、ATG5的水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。
[0049]由于Quinacrine单独处理K562的杀伤效应并不明显，之后我们尝试将Quinacrine与经典CML治疗药物Imatinib合用，以求在较低浓度的情况下获得较好的协同疗效，同时在一定程度上逆转某些病人的耐药情况。
[0050]实施例3.Quinacrine与Imatinib合用可协同引起CML细胞杀伤效应
[0051]我们用(2,2.5、3、2.5、4、4.5、5 μ Μ)的 Quinacrine 和(0.2,0.25,0.3,0.35,0.4、
0.45,0.5 μ Μ)的Imatinib分别单加及合加处理Κ562细胞，通过细胞台盼兰计数计算细胞杀伤效应，利用CompuSyn软件计算两药在Quinacrine Jmatinib=IO:1的定比情况下的协同指数，发现二者具有良好的协同效应(图5)。该数据至少重复了三次的独立试验，每次三个样本。
[0052]我们用4yM-Quinacrine、0.4μΜ Imatinib 处理 Κ562、K562R 及 32D_Bcr/abl、32D-Vector细胞，通过细胞台盼兰计数计算活率、处理细胞甩片瑞氏染色观察等实验，发现两者合用可明显引起K562、K562R及32D-Bcr/abl细胞的死亡，而对正常的32D_Vector细胞(图6、7)及正常人外周血细胞无明显效应(图9.A)。
[0053]图6显示Quinacrine可明显加强Imatinib对CML细胞的杀伤效应。(A)用4 μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理Κ562细胞24、48小时,活率均通过台盼兰排斥试验检测。(B)用3.5 μ M的Quinacrine和3 μ M的Imatinib分别单加及合加处理K562R细胞24、48小时，活率均通过台盼兰排斥试验检测。(C)用4μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理32D_Vector及32D_Bcr/abl细胞24小时，活率均通过台盼兰排斥试验检测。所有的值都是均值并带有标准差。该数据至少重复了三次的独立试验,每次三个样本。
[0054]图7显示Quinacrine和Imatinib合加对CML细胞形态学的效应。(A)用4 μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理Κ562细胞48小时,细胞被收集并甩至载玻片，用瑞氏姬姆萨染料染色，并用100X/1.3物镜的Olympus BX60观察。文中显示T代表性的图像。(B)用3.5 μ M的Quinacrine和3 μ M的Imatinib分别单加及合加处理K562R细胞48小时，细胞被收集并甩至载玻片，用瑞氏姬姆萨染料染色，并用100 X/1.3物镜的Olympus BX60观察。文中显示了代表性的图像。(C)用4 μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理32D_Vector和32D_Bcr/abl细胞24小时，细胞被收集并甩至载玻片，用瑞氏姬姆萨染料染色，并用100X/1.3物镜的Olympus BX60观察。文中显示了代表性的图像。所有结果进行了至少重复三次的独立试验，每次三个样本。
[0055]实施例4.Quinacrine与Imatinib协同引起的CML细胞杀伤效应是通过凋亡途径实现的
[0056]我们通过瑞氏染色对两药合加引起的细胞形态的变化进行分析，推测两药可能是通过诱导凋亡引起的细胞杀伤效应，于是利用Western blot技术检测凋亡标志物PARP-1及Caspase-3等蛋 白的变化，发现两药合加处理时出现了明显的剪切条带，提示细胞凋亡的发生，而单加及对照组不出现或出现并不明显的剪切条带。
[0057]图8 显不 Quinacrine 和 Imatinib 诱导 CML 细胞的凋亡。(A)用 4 μ M 的 Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理Κ562细胞48小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测凋亡相关蛋白PARP-1、Caspase-3等水平(B)用3.5 μ M的Quinacrine和3 μ M的Imatinib分别单加及合加处理K562R细胞48小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测凋亡相关蛋白PARP-1、Caspase-3等水平。(C)用4 μ M 的 Quinacrine 和 0.4 μ M 的 Imatinib 分别单加及合加处理 32D_Vector 和 32D~Bcr/abl细胞24小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测凋亡相关蛋白Caspase-3的水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。
[0058]实施例5.Quinacrine与Imatinib合加引起CML细胞内Bcr/abl通路相关蛋白的降解及活性降低
[0059]我们同时检测Quinacrine 与 Imatinib 单加及合加处理 K562、K562R、32D_Vector及 32D_Bcr/abl 细胞后，细胞内 Bcr/abl 通路相关蛋白:Bcr/abl、phospho_Bcr/abl、STAT5、phospho-STAT5及其下游抗凋亡蛋白Bcl-xl的变化，发现两药合加引起了上述蛋白的明显降低，进一步验证了上述两药合加对CML细胞的明显效应。
[0060]图9显示Quinacrine和Imatinib合加抑制CML细胞的Bcr/abl通路相关蛋白。(A)用4 μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理Κ562细胞48小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl通路相关蛋白如Bcr/abl、phospho-Bcr/abl、STAT5、phospho-STAT5、Bcl_xl 等水平(B)用 3.5 μ M 的 Quinacrine和3 μ M的Imatinib分别单加及合加处理K562R细胞48小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl通路相关蛋白如Bcr/abl、phospho-Bcr/abl、STAT5、phospho_STAT5、Bcl-xl 等水平。(C)用 4 μ M 的 Quinacrine 和 0.4 μ M 的 Imatinib 分另lj单加及合加处理32D-VeCtor和32D-Bcr/abl细胞24小时，细胞被收集并裂解，等量的细胞裂解液用蛋白印迹检测Bcr/abl通路相关蛋白如Bcr/abl、phospho-Bcr/abl、STAT5、phospho-STAT5、Bcl-xl等水平。所有结果进行了至少重复三次的独立试验。
[0061]实施例6.Quinacrine与Imatinib合加对CML病人骨髓单个核细胞的克隆形成影响
[0062]我们获得了一例CML病人的骨髓单个核细胞，通过克隆形成实验来检测Quinacrine与Imatinib对病人慢粒细胞的影响。发现两药合加对CML病人同样有效,为两药合加方案的临床可行性奠定了基础(图10.B)。
[0063]图10显示Quinacrine和Imatinib合加抑制CML病人白血病细胞的克隆形成效应，而对正常人外周血单个核细胞无毒副效应。收集正常人外周血五例及CML病人骨髓血标本一例，利用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。(A)用4 μ M的Quinacrine和
0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理正常人外周血单个核细胞72小时，活率均通过台盼兰排斥试验检测。 (B)用4μ M的Quinacrine和0.4 μ M的Imatinib分别单加及合加处理分离好的CML病人骨髓单个核细胞，以克隆形成凝胶试验处理10天，克隆数由镜下观察并计数。所有试验均每次重复三个样本。
[0064]综上，临床对Imatinib耐药的CML病例逐渐增多，几乎所有的CML急变期和15%~20%经Imatinib治疗后复发的患者对Imatinib发生耐药。增加Imatinib的剂量或者更换第二代信号转导抑制剂如尼洛替尼(Nilotinib)和达沙替尼(Dasatinib)等对大多数突变型CML有效，但对具有Bcr/ablT3151突变的CML仍无效。鉴于当前临床上存在的耐药问题，本发明涉及的Quinacrine与Imatinib的联合用药物,不仅能够在较低浓度(仅需少量Imatinib)特异性协同杀伤K562等CML细胞，同时对K562耐药细胞K562R同样有效。另ShQuinacrine可诱导含Bcr/ablT3151突变的32D细胞中Bcr/abl及其磷酸化蛋白的降解，为针对含Bcr/ablT3151突变的CML治疗提供了方案。Quinacrine易制备，两药合用可明显降低治疗费用，同时降低药物的副作用，具有良好的临床推广价值。
[0065]CML发病的分子基础是Bcr/abl融合基因，表达Bcr/abl融合蛋白，Quinacrine可降低Bcr/abl及其磷酸化蛋白的含量，而Imatinib主要通过选择性抑制Bcr/abl的PTK活性起作用，两药作用的靶点不同。本发明治疗慢性粒细胞性白血病的组合药物通过Quinacrine和Imatinib两药联合用，可协同抑制CML细胞生长、增殖、促进CML细胞凋亡、促进Bcr/abl融合蛋白降解和抑制酪氨酸激酶(PTK)活性等。根据实验结果，在0.3-0.5 μ MImatinib和3_5 μ MQuinacrine合用组范围内两药对CML细胞杀伤效应明显，Imatinib与Quinacrine的质量浓度比在1:8-1:12 (优选1:10)的比例下对K562细胞具有协同杀伤效应，其中4μΜ Quinacrine和0.4μ M Imatinib合用组对Κ562细胞效果最好。另外，4 μ MQuinacrine可单独引起Κ562等CML细胞中Bcr/abl和其磷酸化蛋白的减少,且两药组合对正常人外周血单个核细胞无明显毒副作用，并可大幅降低患者的治疗费用，并对于减少CML病人对Imatinib的耐药具有实际的应用价值。
[0066] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.治疗慢性粒细胞白血病的联合用药物，其特征在于，所述药物包括伊马替尼和阿的平，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:8 — 1:12。
2.根据权利要求1所述的联合用药物，其特征在于，所述伊马替尼和阿的平的的重量比为1:10。
3.伊马替尼和阿的平联合用药在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:8—1:12。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述伊马替尼和阿的平的质量浓度比为1:10。
6.阿的平在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述慢性粒细胞白血病为含Bcr/abP151突变的慢性粒细胞白血病。
【文档编号】A61K31/473GK103948598SQ201410151375
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】吴英理, 涂瑶瑶, 徐含章, 雷虎, 宋利利, 韦炜 申请人:上海交通大学医学院