血清淀粉样蛋白a1的应用的制作方法
【专利摘要】血清淀粉样蛋白A1的应用，试剂盒中含有如SEQIDNO:1~4中所示的siRNA，或含有如SEQIDNO:5所示序列的血清淀粉样蛋白A1多克隆抗体。血清淀粉样蛋白A1作为肺癌转移的靶标，通过siRNA干预细胞SAA1，有效抑制SAA1促进肺癌细胞侵袭。
【专利说明】血清淀粉样蛋白Al的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及血清淀粉样蛋白Al (serum amyloid Al, SAAl)在非小细胞肺癌转移诊断领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，肺癌的致死率高达所有罹患肺癌人群总数的28%。与此同时，全球肺癌的发病率以每年5%的速度在攀升，预计到2020年，肺癌的致死率将到达50%。目前肺癌一般都是在晚期才被发现，对于肺癌的早期检测手段还很匮乏。当下罹患肺癌的病人能生存到5年以上的不足15%。在肺癌的晚期，肿瘤细胞会转移到全身的淋巴结以及远处的其他器官，包括肝脏，肾脏，脑以及骨等等，超过90%的肺癌病人最终死于晚期的肺癌转移。因此，如何预防以及治疗肺癌的转移是临床上防治肺癌的一项重要问题，寻找防治肺癌转移的新靶点具有较高的临床医学价值。
[0003]血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12KD。在急性时限反应中，经IL-1、IL-6和TNFa刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍。与C反应蛋白类似，血清淀粉样蛋白A浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标。SAAl是SAA家族中的一员，然而关于SAAl与非小细胞肺癌转移的相关研究尚未见文献报道。
【发明内容】
[0004]解决的技术问题:本发明提供一种血清淀粉样蛋白Al的应用，其作为肺癌转移的靶标，通过siRNA干预细胞SAA1，有效抑制SAAl促进肺癌细胞侵袭。
[0005]技术方案:血清淀粉样蛋白Al作为靶标在制备治疗肺癌转移试剂盒中的应用。
[0006]所述试剂盒中含有如SEQ ID NO:1~4所示的siRNA。
[0007]所述试剂盒中含有如SEQ ID NO:5所示序列的血清淀粉样蛋白Al多克隆抗体。
[0008]治疗肺癌转移试剂盒，肺癌转移的靶标为血清淀粉样蛋白Al。
[0009]所述的试剂盒含有如SEQ ID NO:1~4所示的siRNA。
[0010]所述的试剂盒，含有如SEQ ID NO:5所示序列的血清淀粉样蛋白Al多克隆抗体。
[0011]有益效果:本发明提供一种血清淀粉样蛋白Al在制备治疗肺癌转移试剂盒中的应用，该试剂盒利用siRNA抑制巨噬细胞SAAl表达，或给予制备的SAAl多克隆抗体，干预细胞SAA1，可有效抑制SAAl促进肺癌细胞侵袭。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1.将3X IO5个路易斯肺癌细胞(LLC)以尾静脉注射的方式注入到野生型和SR-A基因敲除型小鼠的体内，构建小鼠肺癌转移模型，饲养三周后，处死小鼠，提取两组小鼠的肺组织大体标本图。[0013]图2.收取野生型和SR-A基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的肺组织大体标本，统计两组小鼠肺组织上的肿瘤转移灶的数量示意图。
[0014]图3.利用野生型和SR-A基因敲除型两组小鼠构建肺癌转移模型后，统计两组小鼠的生存周期示意图。
[0015]图4.收取野生型和SR-A基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的肺组织，提取肺组织的RNA，通过RT-PCR的方法检测两组小鼠肺组织中SAAl的表达水平示意图。
[0016]图5.收取野生型和SR-A基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的肺组织，提取肺组织的蛋白质，通过Western Blot的方式检测两组小鼠肺组织中SAAl的蛋白表达水平示意图。
[0017] 图6.收取野生型和SR-A基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的血清，通过ELISA试剂盒检测两组小鼠血清中SAAl的表达水平示意图。
[0018]图7.收取野生型和SR-A-/-基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的肺组织标本，经过石蜡包埋后制作成组织切片，通过免疫组织化学的方法检测两组小鼠肺组织中的SAAl的表达情况示意图。
[0019]图8.收取野生型和SR-A基因敲除型两组肺癌造模后小鼠的肺组织标本，经过石蜡包埋后制作成组织切片，通过免疫荧光的方法检测CD68和SAAl的表达情况示意图。其中，红色荧光标记的是CD68，反映巨噬细胞的浸润情况，绿色荧光标记的是SAAl。
[0020]图9.将野生型和SR-A基因敲除型两组小鼠的巨噬细胞与LLC进行共培养24h后，提取两组巨噬细胞的RNA，通过RT-PCR的方式检测巨噬细胞中SAAl的表达水平示意图。
[0021]图10.将野生型和SR-A基因敲除型两组小鼠的巨噬细胞与LLC进行共培养24后，收取共培养的细胞上清，通过ELISA试剂盒检测上清中SAAl的表达水平示意图。
[0022]图11.使用不同浓度(10~105pg/mL)的GST以及GST-SAA1蛋白刺激LLC细胞48小时后，检测LLC细胞的侵袭能力示意图。
[0023]图12.利用siRNA干扰的方法将巨噬细胞中的SAAl的表达水平下调。通过Western blot的方法检测干扰后巨噬细胞中SAAl的表达水平示意图。
[0024]图13.对图12中Western blot的结果进行统计分析示意图。
[0025]图14.利用siRNA干扰的方法下调野生型以及SR-A基因敲除型小鼠的巨噬细胞中的SAAl的表达水平后，与LLC细胞共培养24后，检测LLC细胞的侵袭能力图。
[0026]图15.对图14的检测结果进行统计分析示意图。
[0027]图16.SAAl抗体纯度的鉴定，纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色示意图，可见抗体纯化后纯度在95%以上。
[0028]图17.使用SAAl的多克隆抗体处理野生型以及SR-A基因敲除型小鼠的巨噬细胞后，与LLC共培养24，检测LLC细胞的侵袭能力示意图。
[0029]图18.对表1中的结果进行统计分析示意图。
【具体实施方式】
[0030]下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0031]实施例1
[0032]1.Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力[0033](I)将分装好的Matrigel至于4°C过夜，使其充分溶解为液态。
[0034](2)用无血清细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶(按照1:6的质量比例进行稀释)。
[0035](3 )用预冷的无血清的DMEM培养液预先湿润Transwe 11上室，5分钟后移除。
[0036](4)用预冷好的枪头取50 μ L稀释胶加到24-well transwell上室中，保证上室中的稀释胶均匀无气泡。
[0037](5) 37°C孵育 transwell 至少 4_5h,使其凝固。
[0038](6)用胰酶将LLC细胞从细胞培养皿中消化下来，800rpm离心2分钟，用含有1%的FBS的DMEM重悬细胞，计数。
[0039](7)在上室中加入200 μ L，含有2X IO4的LLC的细胞悬液，将上室搁置于提前种好的含有3 X IO6的WT和SR-A敲除型小鼠的腹腔巨噬细胞的24孔板中，37°C共培养24_48h。[0040](8)取出上室，用PBS清洗后，放入到4%的中性甲醛中固定10分钟。清洗后，放入到1%的结晶紫染色液中染色20分钟。
[0041](9)棉签擦去上室上面的非侵袭细胞，将小室烘干。
[0042](10)利用体式显微镜对上室进行拍照。
[0043]2.siRNA 转染
[0044](I)提取野生型和SR-A基因敲除型的腹腔巨噬细胞，细胞种板培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。
[0045](2)细胞培养过夜后，采用脂质体法(LipofectAMINETM2000)进行转染。
[0046](3)转染前PBS液洗涤细胞2次以去除培养基中剩余的血清。
[0047](4)将总计1.5 μ L (40ηΜ)等量的siRNA转染序列与1.5 μ L脂质体LipofectAMINETM2000分别溶于25 μ L无血清的DMEM培养基中，并在5min内将以上两种液体轻轻混匀，室温下静置20min。在24孔板每孔中加入无血清的DMEM培养液200 μ L，再将以上siRNA和脂质体混合物50 μ L滴加至每孔中，轻轻摇匀。将细胞置于标准培养条件下，过夜后更换新鲜正常培养基继续培养。
[0048](5)培养48h后，将转染后的巨噬细胞与LLC共培养，检测LLC的侵袭能力。
[0049](6)转染序列:siRNA转染序列购于上海吉玛制药技术有限公司。
[0050]SAAl I 号 siRNA 序列:5，GAAGGAAGCUAACUGGAAA3，(SEQ ID N0.1)
[0051]5’UUUCCAGUUAGCUUCCUUC3’ (SEQ ID N0.2)
[0052]SAAl 2 号 siRNA 序列:5’AGGCCUUUCAGGAAUUCUU3’ (SEQ ID N0.3)
[0053]5’AAGAAUUCCUGAAAGGCCU3’ (SEQ ID N0.4)
[0054]3.SAAl多克隆抗体的制备
[0055]3.1.表达质粒构建
[0056]设计合成基因SAAl，将基因SAAl克隆进pGEX_4T_l的BamHI和NotI之间，挑取阳性克隆送测，拼接后得到的序列如下所示，下划线区域为目标基因SEQ ID N0.5:
[0057]ATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTAC
CTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTG
ACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAG
TTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGC
CTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCG
GTTTCTTTTCGTTCGTGCATGAAGCGTTTCAGGGTGCGGGTGATATGTGGCGTGCCTATACCGATATGAAGGAAG
CAAATTGGAAGAACAGCGATAAATATTTTCATGCACGTGGCAATTACGACGCAGCACAGCGCGGTCCGGGCGGTG
TGTGGGCAGCTGAAAAGATTTCTGATGGCCGTGAAGCCTTCCAGGAATTTTTCGGCCGCGGTCACGAAGATACCA
TCGCGGACCAAGAAGCCAACCGTCACGGTCGCTCAGGCAAAGATCCGAACTATTATCGCCCGCCGGGTCTGCCGG
ACAAGTATTAAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTC
TGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGOCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGC
GCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGC
[0058]3.2.pGEX-4T-1-SAAl质粒和pGEX_4T_l空质粒分别转化至大肠杆菌ArcticExpressTM(DE3)
[0059](I)将质粒 I μ g(约 5 μ L)加入 100 μ L ArcticExpressTM(DE3)感受态细菌中，置冰上20min ；
[0060](2) 42°C热激90sec，迅速置冰中5min ;加入600 μ L37°C预热的LB培养液；
[0061](3) 37°C, 220rpm振摇Ih,离心后全部涂布于含50 μ g/mL Amp的LB平板，37°C倒
置培养过夜。
[0062]3.3.1PTG 诱导 pGEX_4T-l_SAAl 载体表达蛋白
[0063](I)挑取转化平板上的2个单克隆接种于含50 μ g/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37°C 220rpm振摇过夜；
[0064](2)次日按1:100接种于50 μ g/mL Amp的3OmL LB培养液中，37°C 220rpm振摇至菌体 0D600 为 0.4 (约 2h)；
[0065](3)出ImL培养物，1000Og室温离心2min，弃上清，用IOOyLlX上样缓冲液重悬菌体沉淀；
[0066](4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.8mM, 11°C 220rpm振摇过夜，诱导目的蛋白表达；
[0067](5)将诱导表达的培养菌液低温离心6000g, IOmin,菌体沉淀重悬与20mL lysisbuffer,超声破碎(功率 400W,工作4sec,间歇8sec,共20min)。
[0068](6)超声破碎的细胞裂解液4°C 1000Og离心20min，分别收集沉淀和上清，SDS-PAGE检测表达情况。
[0069]3.4.GST树脂亲和纯化上清
[0070](I)上述离心后诱导上清，上GST琼脂糖凝胶纯化柱，GST琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为5mL ；
[0071](2) PBS(ρΗ7.4)平衡5个柱床体积，流速为lmL/min ；
[0072](3)诱导上清上样,让GST-SAAl融合蛋白挂柱,流速为lmL/min ；
[0073](4) PBS (pH7.4)再洗10个柱床体积，洗脱杂蛋白，流速为lmL/min ；
[0074](5)洗脱液(0.lmmol/L Tris溶液50mL，0.514g还原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脱目的蛋白，流速为lmL/min,收集洗脱峰液体；
[0075](6)纯水洗5个柱床体积,再用20%的乙醇洗5个柱床体积,流速为lmL/min,柱子
置4~8°C保存备用。
[0076](7)收集的洗脱峰液体进行SDS-PAGE，分析纯化结果。
[0077]3.5.包涵体洗脱
[0078](I)沉淀使用包涵体洗涤液(20mM Tris7ImM EDTA，2M 尿素，IM NaCl, I % TritonX-100，ρΗ8.0)洗涤包涵体3次；
[0079](2)溶解缓冲液(20mM Tris, 5mM DTT，8M尿素ρΗ8.0)，将包涵体与缓冲液按照1:50的质量比例混合溶解，4度放置过夜；室温，15000rpm离心15min ；
[0080](3)包涵体溶解液滴加到20mM Tris,pH8.0缓冲液逐步成倍梯度稀释，缓慢搅拌；至尿素浓度达到0.5M时，将蛋白溶液装入透析袋于4°C在20mM PBS，pH7.4中透析过夜，使蛋白复性；
[0081](4) DS-PAGE鉴定蛋白，蛋白纯度在80%以上，可以直接用于免疫。
[0082]3.6.GST蛋白的获得
[0083]诱导表达pGEX-4T-l质粒，重复上述实验步骤，从上清中亲和纯化获得GST标签蛋白。在核酸蛋白分析仪上，按照A280紫外分光光度法，采用BSA蛋白浓度标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
[0084]3.7.动物免疫
[0085]利用蛋白免疫4只新西兰白兔(2-2.5KG)，皮下免疫^Oyg/次，2-3周免疫一次，免疫3-4次。采血检测，分别通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白GST-SAAl的效价，待效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。
[0086]3.8.抗体纯化
[0087]将蛋白GST-SAAl与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后将蛋白GST与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，用将上步所得洗脱液缓慢上样，收集流出液，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行相关纯度，浓度和效价测定。
[0088]实验结果
[0089]1.为了探索SR-A在肺癌的转移中的作用，我们将路易士肺癌细胞(LLC)通过尾静脉注射的方式注入到野生型(WT)以及SR-A基因敲除型(SR-A+)两组C57/B6小鼠尾静脉，构建小鼠的肺癌转移模型。结果发现，与WT组小鼠相比，SR-A+小鼠肺部的肿瘤转移灶的数量明显增多，转移灶的直径也明显增大(图1，2)。同时，SR-A+小鼠的生存周期明显短于WT组小鼠(图3)。结果表明，SR-A在肺癌转移的过程中发挥显著保护作用。
[0090] 2.为进一步探究其中保护机制，我们通过基因芯片检测了 WT和SR-A+两组肺癌转移模型小鼠肺组织中的差异性表达基因。对检测结果进行统计后发现，与WT组相比，SR-A+小鼠肺组织中血清淀粉样蛋白Al (serum amyloid Al, SAA1)的基因表达水平明显升高。进一步采用RT-PCR以及Western blot对基因芯片检测结果进行验证，确认了在两组小鼠的肺组织中SAAl在mRNA以及蛋白表达水平上均有显著增高(图4，5，6)。此外，免疫组化及间接免疫荧光结果还表明SAAl主要表达于癌旁间质中的巨噬细胞(图7，8)。在细胞实验中，将LLC分别与WT以及SR-A+小鼠腹腔巨噬细胞进行共培养24h后，收集共培养上清并提取巨噬细胞mRNA。RT-PCR检测巨噬细胞SAAl的表达情况，结果显示在加入LLC进行共培养后，巨噬细胞中SAAl的表达量明显上升，且SR-A+小鼠巨噬细胞中SAAl的表达水平明显高于WT小鼠(图9)。同时，ELISA在蛋白水平的检测也得到类似结果(图10)。以上实验结果说明，在肿瘤细胞的刺激下，巨噬细胞中的SAAl的表达以及分泌的水平上调，且SR-A+巨噬细胞中的SAAl水平显著高于WT巨噬细胞。
[0091]3.为了证实SAAl在肺癌细胞侵袭转移过程中发挥重要作用，我们进行了如下实验。在细胞共培养体系下室中分别加入不同浓度的GST或GST-SAAl蛋白，上室中种植相同数量的LLC，共培养40h后检测细胞的侵袭能力。结果表明，与GST蛋白对照组相比，加入GST-SAAl蛋白后，LLC细胞的侵袭能力明显增强(图11)。在此基础上，将WT小鼠的腹腔巨噬细胞与LLC共培养，在培养上清中加入GST或GST-SAAl，同样发现加入GST-SAAl蛋白后LLC细胞的侵袭能力明显增强。为了进一步证实巨噬细胞SAAl对于肿瘤侵袭能力的影响，我们采用siRNA干扰将两条SAAl的siRNA干扰序列分别转入到巨噬细胞中，使得巨噬细胞中SAAl表达下调(图12，13)，与LLC细胞进行共培养24h后检测肿瘤细胞的侵袭能力。结果发现，在巨噬细胞SAAl的表达水平下调后，肿瘤细胞的侵袭能力明显降低(图14，15)。此外，我们体外合成了 GST-SAAl的纯化蛋白，利用该蛋白免疫兔子后得到免疫血清，经过纯化后制备了 SAAl的多克隆抗体。接着我们通过ELISA实验检测了抗体的效价(如下表1所示):
[0092]抗体Elisa结果
【权利要求】
1.血清淀粉样蛋白Al作为靶标在制备治疗肺癌转移试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述试剂盒中含有如SEQID Ν0:1-4所示的 siRNA。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述试剂盒中含有如SEQID NO:5所示序列的血清淀粉样蛋白Al多克隆抗体。
4.治疗肺癌转移试剂盒，其特征在于肺癌转移的靶标为血清淀粉样蛋白Al。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于含有如SEQID NO: 1-4所示的siRNA。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于含有如SEQID NO:5所示序列的血清淀粉样蛋白Al多克 隆抗体。
【文档编号】A61K48/00GK103908679SQ201410167087
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】陈琪, 贲晶晶, 张艳, 陈丽莉, 朱旭冬, 李飞, 柏惠, 李晓宇, 张瀚文, 杨青 申请人:南京医科大学