纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法及其制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法及其制剂，制备方法包括：S1、分别制备复合抗原；S2、筛选产蛋禽类进行免疫，并分别拣取免疫蛋；S3、分别制两种复合抗原对应的特异性复合IgY粗提物；S4、制备复合纯IgY；S5、纳米化处理；S6、脂质体化处理。本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY，可特异性地识别致病菌幽门螺杆菌和幽门球菌以及相关酶和黏附素并穿透胃和十二指肠粘膜发生作用，一方面能直接抑制幽门螺杆菌和球菌，另一方面可抑制其相关酶和黏附素，阻断幽门螺杆菌在粘膜表面粘附和定植，达到根治的目的。
【专利说明】纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法及其制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及幽门螺杆菌感染引致的消化性溃疡和慢性胃炎的预防和治疗技术，尤其涉及到一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法及其制剂。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌感染是消化性溃疡和慢性胃炎的主要病因，与胃癌的发生也密切相关。揭示这一本质的两位澳大利亚科学家Barry J.Marshall和J.Robin Warren己被评为2005年度诺贝尔国际医学奖。然而，对于溃疡等病症目前采用抗生素为主的治疗方法，不良反应大，而且幽门螺杆菌对抗生素的耐药率不断增加，导致根除治疗失败率不断上升。据有关数据显示，根治率仅20-40%，而且这也只是指治疗后至少四周内无HP复现的情况。抑制胃酸的方法也可使80%的溃疡得以愈合，但是也同样都是暂时的，半年后复发率为66%，一年内复发率为80%，两年内复发率可高达99.9%。
[0003]科学研究揭示，胃病之所以久治不愈，还有一个重要原因是由于幽门球菌在作怪。每当胃病患者在服胃药期间，幽门螺杆菌就会转变成体积非常小的幽门球菌，隐藏在胃和十二指肠粘膜内，普通胃药对其无能为力。当停止服药一段时间，隐藏的幽门球菌又会再转变成幽门螺杆菌，使炎症复发。因此，必须将藏匿粘膜深层的这种属于幽门螺杆菌死亡状态的球菌也一并杀灭，才有可能减少复发率。最新的研究进一步揭示，在幽门螺杆菌致病机制中幽门螺杆菌尿素酶和和磷脂酶以及幽门螺杆菌黏附素也扮演着重要的角色，幽门螺杆菌尿素酶和磷脂酶以及黏附素是幽门螺杆菌在胃和十二指肠粘膜表面粘附和定植而引发炎症、溃疡甚至胃癌的物质基础，直接参与破坏胃和十二指肠粘膜屏障；如果只杀灭幽门杆菌，不同时抑制幽门螺杆菌尿素酶和磷脂酶以及黏附素，就不可能达到有效治疗和预防的目的。
[0004]面对这种全球医药界一致公认根治率最低的顽疾，如何从病发根源着手，寻找一种能真正彻底根治胃病的新方法、新途径，以取代目前广为采用的抗生素和化学药物，已成为摆在国际医药科学界面前的重要课题，也是全球千百万胃病患者的殷切期盼。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于，提供一种能直接抑制幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素，达到治疗及预防目的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法及其制剂。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法，包括以下步骤:
[0007] S1、分别制备幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，以及幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原；所述幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原的制备包括:
[0008]S1.4、采用基因工程技术将幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2分别重组表达；
[0009]S1.5、将分别重组表达获得的幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白按比例混合均匀，加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原；
[0010]S2、采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的产蛋禽类，分别采用两种所述复合抗原对所选的产蛋禽类进行免疫，并分别拣取两种所述复合抗原免疫的所述产蛋禽类所产的免疫蛋；
[0011]S3、对两种所述免疫蛋进行消毒，分别取蛋黄，对蛋黄进行处理，制得两种所述复合抗原分别对应的抗幽门螺杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物和抗幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2特异性复合IgY粗提物；
[0012]S4、将两种所述特异性复合IgY粗提物分别进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY，并将两种所述特异性复合纯IgY按比例混合均匀，制得抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ；
[0013]S5、将所述抗幽门 螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉进行纳米化处理，以制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ；
[0014]S6、将所述纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY进行脂质体化处理，制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
[0015]优选地，在所述步骤SI中，所述幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原为耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，其制备包括以下步骤:
[0016]S1.1、采用耐药或标准幽门螺杆菌菌株和幽门球菌菌株分别培养获得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌；
[0017]S1.2、将耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌按重量比1-10:10-1的比例混合、超声粉碎处理，得到含全菌和菌体成分的耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌混合物；
[0018]S1.3、在耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌混合物中加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原。
[0019]优选地，在所述步骤S1.4中，提取幽门螺杆菌染色体基因，分别用PCR方法扩增HpaA、SabA以及BabA2基因，将其分别克隆至表达载体pET22b (+)，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，分别得到幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白；
[0020]在所述步骤S1.5中，分别重组表达获得的幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白按重量比1-10:1-10:1-10:1-10:1-10 的比例进行混合。
[0021]优选地，在所述步骤S2中，所述免疫处理如下:采用两种所述复合抗原分别对所选的产蛋禽类依次进行3次皮下注射，每一次间隔7天，每一次注射剂量为0.5-lml，并自第一次注射后从第20天开始拣取具有高免疫应答能力的免疫蛋。
[0022]优选地，在所述步骤S2中，所述产蛋禽类选用处于产蛋期的无特定病原体携带的健康禽类；
[0023]在所述步骤S3中，分别将所取的蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节PH值至5.5 - 6.0，在4 - 6°C下静置过夜，然后在6000-12000r/min下进行高速离心，取上清液进行超滤浓缩10-20倍并干燥，分别得到两种所述复合抗原对应的特异性复合IgY粗提物。
[0024]优选地，在所述步骤S3中，采用17万-20万截留分子量的超滤膜对所述上清液进行超滤浓缩；采用lmol/1的NaOH溶液或者lmol/1的HCL溶液调节所述蛋黄的稀释液。
[0025]优选地，在所述步骤S3中，在超滤浓缩后还包括细菌、病毒滤除步骤。
[0026]优选地，在所述步骤S4中，将两种所述特异性复合IgY粗提物分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY ;并将两种所述特异性复合纯IgY按重量比1-10:10-1的比例混合均匀，制得抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。
[0027]优选地，在所述步骤S5中，所述纳米化处理如下:将所述抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉放入超微粉碎机中碾磨粉碎成大小在1-lOOnm、粒度> 15000目的超微粒子，即制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ；
[0028]在所述步骤S6 中，所述脂质体化处理如下:将卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，制得卵磷脂和胆固醇乙醚溶液；将纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY加入4mmol/L的磷酸盐缓冲液中配成IgY溶液；再将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY溶液混合，超声处理在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心分离除去未包入的IgY，将其中沉淀物进行水洗，再离心得最终沉淀物，将最终沉淀物冷冻干燥，即制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
[0029]本发明还提供一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY制剂，包括上述的制备方法制得的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
[0030]优选地，该制剂还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
[0031]优选地，该制剂为片剂、喷雾剂、粉剂、口服液剂或胶囊。
[0032]本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY，可特异性地识别致病菌幽门螺杆菌和幽门球菌以及相关酶和黏附素并穿透胃和十二指肠粘膜发生作用，一方面能直接抑制幽门螺杆菌和球菌，另一方面可抑制其相关酶和黏附素，阻断幽门螺杆菌在粘膜表面粘附和定植，达到根治的目的。该复合IgY制成的制剂天然安全，既可用于治疗幽门螺杆菌感染，还可制成保健食品和食品添加剂，用于预防幽门螺杆菌感染。
【具体实施方式】[0033]本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法，包括以下步骤:
[0034]S1、分别制备幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，以及幽门螺杆菌尿素酶亚单位B (UreB)、磷脂酶A2(PLA2)、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原。
[0035]其中，幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原为耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，标准指不耐药。该复合抗原制备包括以下步骤:
[0036]S1.1、采用相应的菌株培养分别获得幽门螺杆菌和幽门球菌。幽门螺杆菌的菌株可为向中国科学院微生物研究所购买耐阿莫西林和克拉霉素或耐其他抗生素的耐药幽门螺杆菌菌株，或为向美国ATCC购买的幽门螺杆菌标准菌株(ATCC43504标准株)；而幽门球菌可为向新加坡国立大学微生物系购买的幽门球菌菌株。其中，幽门螺杆菌菌株为耐药或不耐药(标准)的菌 株。培养方法采用常规的培养方法即可；其中，(I)ATCC培养基260:含脱纤维蛋白羊血的胰化蛋白大豆琼脂(Trypticase soy agar) ； (2)生长环境:微需氧性；
(3)温度:摄氏37度。
[0037]S1.2、将幽门螺杆菌和幽门球菌按重量比1-10:10-1的比例混合、超声粉碎处理，得到含全菌或菌体成分的幽门螺杆菌和幽门球菌混合物。其中比例优选1:1。
[0038]S1.3、在幽门螺杆菌和幽门球菌混合物中加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原。通过采用耐药或标准(不耐药)幽门螺杆菌，从而可制得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原。
[0039]幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原的制备包括以下步骤:
[0040]S1.4、采用基因工程技术将幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2分别重组表达。其中，提取幽门螺杆菌(H.pylori)染色体基因，分别用PCR方法扩增HpaA、SabA以及BabA2基因，将其分别克隆至表达载体pET22b (+)，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，分别得到幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白。在培养基中诱导目的重组蛋白表达，SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；再采用N1-NTA亲和层析法提纯幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白。
[0041]S1.5、将分别重组表达获得的幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白按重量比1-10:1-10:1-10:1-10:1-10的比例混合均匀，加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原。其中比例优选1:1:1:1:1。
[0042]S2、采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的产蛋禽类，分别采用两种上述的复合抗原对所选的产蛋禽类进行免疫，并分别拣取两种复合抗原免疫的产蛋禽类所产的免疫蛋。产蛋禽类可选自鸡、鸭、鹅、火鸡及鸵鸟等禽类。
[0043]其中，选用处于产蛋期的无特定病原体携带的健康禽类；分别采用所制得的两种复合抗原进行注射免疫。免疫处理如下:采用幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原以及幽门螺杆菌尿素酶亚单位B (UreB)、磷脂酶A2 (PLA2)、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原分别对所选的产蛋禽类依次进行3次皮下注射，每一次间隔7天，每一次注射剂量为0.5-lml，并自第一次注射后从第20天开始拣取具有高免疫应答能力的免疫蛋。即:将所选的产蛋禽类分成两组，每一组注射一种复合抗原，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量和方法注射第二次，再间隔7天以同样剂量和方法注射第三次，自第一次注射后从第20天拣取产蛋禽类产下的具有高免疫应答能力的免疫蛋。为了区别不同复合抗原免疫的免疫蛋，对所拣取的免疫蛋进行编码标记。
[0044]S3、对两种免疫蛋进行消毒，分别取蛋黄，对蛋黄进行处理，制得两种复合抗原分别对应的抗幽门螺杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物和抗幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2特异性复合IgY粗提物。
[0045]在该步骤S3中，分别将两种复合抗原免疫的免疫蛋进行消毒，可用0.1%新洁尔灭溶液或0.1% KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡消毒，接着用无菌蒸馏水冲洗、晚干。可将免疫蛋直于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄。
[0046]处理蛋黄时，分别将所取的蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节PH值至
5.5 - 6.0，在4 - 6°C下静置过夜，然后在6000-12000r/min下进行高速离心(如20min)，取上清液进行超滤浓缩10-20倍(即原来体积的1/10-1/20)并干燥，分别得到两种复合抗原对应的特异性复合IgY粗提物。其中，可采用lmol/1的NaOH溶液或者lmol/1的HCL溶液来调节经蒸馏水稀释的蛋黄的稀释液；采用17万-20万截留分子量的超滤膜(或具有该超滤膜的超滤机)对上清液 进行超滤浓缩，以获得浓缩液。
[0047]为了确保制得的特异性复合IgY粗提物不含任何细菌或病毒，在超滤浓缩后还包括细菌、病毒滤除步骤。该步骤可采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒；其中，第一道细菌滤除装置是用0.22 μ m膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1 μ m膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。滤除细菌和病毒后再用将浓缩液用冷冻干燥机进行干燥。
[0048]S4、将两种特异性复合IgY粗提物分别进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY,并将两种特异性复合纯IgY按比例混合均匀，制得抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。
[0049]在该步骤S4中，将两种特异性复合IgY粗提物分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY。两种特异性复合纯IgY按重量比1-10:10-1的比例混合均匀，得到抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。为了使得混合均匀，上述的混合步骤均可采用搅拌机实现。两种特异性复合纯IgY优选按重量比1:1的比例混合均匀。
[0050]S5、将抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉进行纳米化处理，以制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。
[0051]该步骤S5中的纳米化处理如下:将抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉放入超微粉碎机中碾磨粉碎成大小在l-100nm、粒度> 15000目的超微粒子，即制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。[0052]S6、将纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY进行脂质体化处理，制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
[0053]该步骤S6中的脂质体化处理如下:将卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，制得卵磷脂和胆固醇乙醚溶液；将纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY加入4mmol/L的磷酸盐缓冲液中配成IgY溶液；再将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY溶液混合，超声处理在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心分离除去未包入的IgY，将其中沉淀物进行水洗(二次)，再离心得最终沉淀物，将最终沉淀物冷冻干燥，即制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。超速离心优选35000r/min、30min。
[0054]可以理解地，上述方法中，通过采用耐药或标准(不耐药)幽门螺杆菌，最终可制得抗耐药或不耐药幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
[0055]本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY制剂，包括上述的制备方法制得的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。该制剂还可包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种；胶囊辅料包括软胶囊和硬胶囊辅料。该制剂可为片剂、喷雾剂、粉剂或口服液剂等剂型，根据不同剂型所需添加不同辅料；片剂包括口含片、咀嚼片、泡腾片、口服片等。
[0056]制剂为口服液剂时，其中包括上述的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY外，还包括溶剂、助溶剂以及蒸馏水等辅料。制剂为纳米微囊剂时，其中包括上述的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY外，还包括油、表面活性剂以及蒸馏水等辅料。制剂为片剂包括口含片、泡腾片时，其中包括上述的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY外，还包括油、钛白粉、以及微粉硅 胶等赋形剂、填充料等辅料。
[0057]本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY，具有以下效果:1.有效抑灭抗生素无效的耐药幽门螺杆菌和幽门球菌；2.特异性专一抑制幽门螺杆菌尿素酶、磷脂酶以及黏附素，清除幽门螺杆菌粘附和定植的物质基础，阻止其对胃粘膜屏障的破坏，发挥免疫保护作用；3.纳米脂质体的所述复合IgY，不但能保护IgY，减轻胃部酸性环境对IgY破坏，而且具有很强的靶向性、延效性和表皮渗透性，可更有效地渗透深入胃和十二指肠粘膜层产生作用，克服了抗生素和化学药难于渗透粘膜的缺陷，显著提升了治疗指数，增加了根治率；4.能促进白细胞增加对幽门螺杆菌的吞噬作用，提高白细胞的吞噬功能，从而显著提高人体对幽门螺杆菌感染的免疫力；5.该复合IgY及其制剂属天然物质，无臭无味，且无毒副作用，无耐药性，长期服用可全面提升抵抗疾病的能力。
[0058]本发明的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY，除了可作为一种生物新药用于治疗人幽门螺杆菌感染引致的消化性溃疡和慢性胃炎外，还可以制成保健食品或添加到牛奶、饮料、冰淇淋、口香糖、糖果等食用品中，使得人们在享受美食的同时达到预防人幽门螺杆菌感染的效果，这是目前世界各国普遍采用的抗生素和化学药治疗方法所做不到的。
[0059]以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。
[0060]一、试验结果
[0061](一 )、抗幽门螺杆菌和球菌以及相关酶和黏附素复合IgY中的IgY含量检测:应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，对按以上方法所制取的抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY粗品进行检测，结果含IgY45~52%。将这种IgY粗品经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯:抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY纯品中IgY含量为99.99%。
[0062](二)、检测抗耐药幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY对耐药幽门螺杆菌、幽门球菌以及尿素酶、磷脂酶A2、黏附素等七种抗原的抗体结合效价:
[0063]分别采用耐药幽门螺杆菌和幽门球菌以及幽门螺杆菌尿素酶亚单位B(UreB)、磷脂酶A2、黏附素HpaA、SabA以及BabA2基因重组表达蛋白作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗耐药幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的抗体效价，结果如下表1所示。
[0064]表1、抗体效价表
[0065]
【权利要求】
1.一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: S1、分别制备幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，以及幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶弋、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原；所述幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原的制备包括: S1.4、采用基因工程技术将幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2分别重组表达； 51、5、将分别重组表达获得的幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白按比例混合均匀，加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2基因重组表达蛋白复合抗原； 52、采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的产蛋禽类，分别采用两种所述复合抗原对所选的产蛋禽类进行免疫，并分别拣取两种所述复合抗原免疫的所述产蛋禽类所产的免疫蛋; 53、对两种所述免疫蛋进行消毒，分别取蛋黄，对蛋黄进行处理，制得两种所述复合抗原分别对应的抗幽门螺杆菌和幽门球菌特异性复合IgY粗提物和抗幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2特异性复合IgY粗提物； 54、将两种所述特异性复合IgY粗提物分别进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY,并将两种所述特 异性复合纯IgY按比例混合均匀，制得抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ; 55、将所述抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉进行纳米化处理，以制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ； 56、将所述纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY进行脂质体化处理，制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤SI中，所述幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原为耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原，其制备包括以下步骤: S1.1、采用耐药或标准幽门螺杆菌菌株和幽门球菌菌株分别培养获得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌； S1.2、将耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌按重量比1-10:10-1的比例混合、超声粉碎处理，得到含全菌和菌体成分的耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌混合物； S1.3、在耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌混合物中加入福氏佐剂，高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药或标准幽门螺杆菌和幽门球菌复合抗原。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1.4中，提取幽门螺杆菌染色体基因，分别用PCR方法扩增HpaA、SabA以及BabA2基因，将其分别克隆至表达载体pET22b ( + )，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，分别得到幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白； 在所述步骤S1.5中，分别重组表达获得的幽门螺杆菌尿素酶亚单位B、磷脂酶A2、黏附素HpaA、黏附素SabA以及黏附素BabA2的重组蛋白按重量比1-10:1-10:1-10:1-10:1-10的比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述免疫处理如下:采用两种所述复合抗原分别对所选的产蛋禽类依次进行3次皮下注射，每一次间隔7天，每一次注射剂量为0.5-lml，并自第一次注射后从第20天开始拣取具有高免疫应答能力的免疫蛋。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述产蛋禽类选用处于产蛋期的无特定病原体携带的健康禽类； 在所述步骤S3中，分别将所取的蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节PH值至5.5 - 6.0，在4 - 6°C下静置过夜，然后在6000-12000r/min下进行高速离心，取上清液进行超滤浓缩10-20倍并干燥，分别得到两种所述复合抗原对应的特异性复合IgY粗提物。
6.根据权利要 求5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，采用17万-20万截留分子量的超滤膜对所述上清液进行超滤浓缩；采用lmol/1的NaOH溶液或者lmol/1的HCL溶液调节所述蛋黄的稀释液。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，在超滤浓缩后还包括细菌、病毒滤除步骤。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S4中，将两种所述特异性复合IgY粗提物分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，分别得到对应的特异性复合纯IgY;并将两种所述特异性复合纯IgY按重量比1-10:10-1的比例混合均匀，制得抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所述纳米化处理如下:将所述抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY干粉放入超微粉碎机中碾磨粉碎成大小在Ι-lOOnm、粒度> 15000目的超微粒子，即制得纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY ； 在所述步骤S6中，所述脂质体化处理如下:将卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，制成卵磷脂和胆固醇乙醚溶液；将纳米化抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合纯IgY加入4mmol/L的磷酸盐缓冲液中配成IgY溶液；再将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY溶液混合，超声处理在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心分离除去未包入的IgY，将其中沉淀物进行水洗，再离心得最终沉淀物，将最终沉淀物冷冻干燥，即制得纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
10.一种纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY制剂，其特征在于，包括权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY。
11.根据权利要求10所述的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY制剂，其特征在于，还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
12.根据权利要求10或11所述的纳米脂质体抗幽门螺杆菌和幽门球菌以及其相关酶和黏附素复合IgY制剂，其特征在于，该制剂为片剂、喷雾剂、粉剂、口服液剂或胶囊。
【文档编号】A61K39/40GK103961704SQ201410173068
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】包晟, 王长安, 曹天福, 吴娜, 包海威 申请人:深圳雅臣生物科技有限公司