一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽及其应用。该多肽氨基酸序列选自SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列或者SEQ?ID?No.1所示序列的截短序列。本发明多肽通过抑制病毒与靶细胞特异性受体的结合来抑制鹅坦布苏病毒的感染，而对宿主本身不产生影响和副作用，使得该多肽抑制具有很高的特异性和更好的应用前景。
【专利说明】一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽及其应用。
【背景技术】
[0002]鹅坦布苏病毒属于黄病毒科、黄病毒属，该病毒引起坦布苏病毒病，又称产蛋下降综合症、传染性卵巢炎，是以产蛋率、采食量显著下降，出现脑炎样神经症状为特征的新型传染病。国内已有多位学者报道该病毒对鸭、鹅、鸡等家禽均有致病力(黄欣梅，李银，赵冬敏等.新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定.江苏农业学报，2011，27 (2):354-360 ;苏敬良.鸭的新型黄病毒BYD引起的产蛋下降综合征.兽医导刊，2011，4:27-29 ;陈仕龙，陈少莺，王劭等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定.福建农业学报，2011,26(2):170-174;李玉峰，马秀丽，于可响等.一种从鸭新分离的黄病毒研究初报，畜牧兽医学报，2011,42(6):885-891)。该病的发病率可高达100 %，死亡率在5 %~10%之间(滕巧泱，颜丕熙，张旭等.一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡.中国动物传染病学报，2010，18(6):1-4.万春和，施少华，程龙飞，等.一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定.福建农业学报，2010，25 (6):663-666)。自2010年4月在我国暴发并迅速传播到国内主要家禽养殖地区，给我国鸭鹅养殖业造成严重经济损失。
[0003]作为一种新发疫病，鹅坦布苏病毒病发病急，传播迅速，目前尚无有效的疫苗可用，药物治疗效果也不理想，临床上较难控制。虽然已有鸭坦布苏灭活疫苗和弱毒疫苗的相关文献报道，但是 仍处于实验室研究阶段，未进行临床应用。此外，抗鸭坦布苏病毒卵黄抗体以及抗病毒药物的治疗效果并不理想。
[0004]鹅坦布苏病毒属于黄病毒家族成员，该属病毒主要包括几种重要的人类病原体，包括登革病毒、西尼罗病毒和乙型脑炎病毒等。目前为止，该属病毒没有感染的特异性疗法，难以通过疫苗接种进行控制。
[0005]黄病毒是带有囊膜的单股正链RNA病毒，其囊膜蛋白E属于II类融合蛋白，介导病毒与受体的结合以及病毒膜融合过程。囊膜病毒感染靶细胞采用相似的入胞机制，即病毒E蛋白与宿主细胞受体结合后，启动E蛋白构象变化，折叠形成三聚体结构，拉近病毒囊膜与细胞膜距离，引发两膜融合，随后病毒基因组释放到宿主细胞内感染宿主。
[0006]鹅坦布苏病毒病属于新发传染病，相关研究尚属空白，目前鹅坦布苏病毒感染细胞机制尚未明确，也没有能特异性地抑制病毒感染的多肽抑制剂。因此，鉴定鹅坦布苏病毒感染的多肽抑制剂将有助于了解鹅坦布苏病毒的入胞机制，并对坦布苏病毒病的防控以及抗病毒药物的设计具有重大意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽抑制剂。[0008]本发明的目的可通过以下技术方案实现:
[0009]一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽，其氨基酸序列选自SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或者SEQ ID N0.1所示序列的截短序列，所述的SEQ ID N0.1所示序列的截短序列至少包括SEQ ID N0.2所示序列；优选如SEQ ID N0.2所示序列。
[0010]编码本发明所述的多肽的基因。
[0011]本发明所述的基因核苷酸序列优选如SEQ ID N0.3所示。
[0012]含有本发明所述基因的重组表达载体。
[0013]本发明所述的多肽、基因或重组表达载体在制备抗鹅坦布苏病毒药物中的应用。
[0014]一种抗鹅坦布苏病毒的药物组合物，包含本发明所述的多肽。
[0015]制备本发明所述多肽的方法，通过人工直接合成或通过体外表达获得。例如通过含有在适当的转 录启动子控制下的编码所需肽的重组核酸分子的微生物表达肽，以及从所属微生物收集所需肽。
[0016]有益效果:
[0017]为了实现上述目的，本发明以鹅坦布苏病毒囊膜蛋白E为设计基础，用合成多肽竞争结合鹅坦布苏病毒特异性受体，干扰鹅坦布苏病毒与靶细胞特异性受体的结合，从而抑制鹅坦布苏病毒感染靶细胞。结果表明，SEQ ID N0.1所示的多肽具有干扰鹅坦布苏病毒与靶细胞特异性受体结合的作用，并呈现抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的作用。本领域技术人员可以根据上述方法设计出基于SEQ ID N0.1的截短物或类似物，用以干扰鹅坦布苏病毒与靶细胞特异性受体的结合。
[0018]本发明提供的多肽，通过抑制病毒与靶细胞特异性受体的结合来抑制鹅坦布苏病毒的感染，而对宿主本身不产生影响和副作用，使得该多肽具有很高的特异性和更好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示黄病毒囊膜蛋白E结构示意图
[0020]图2显示多肽设计原理，显示多肽模拟的E蛋白的位置示意图。
[0021]图3是合成的多肽对抑制鹅坦布苏病毒的感染具有剂量依赖效应。终浓度为50 μ g/ml的多肽可有效抑制鹅坦布苏病毒的感染，抑制效率为60%。但是对照牛血清白蛋白组没有此抑制效果。
[0022]图4显示本发明多肽可结合于靶细胞膜表面，干扰鹅黄病毒与靶细胞特异性受体结合，从而抑制鹅黄病毒感染靶细胞，且这种结合具有剂量依赖效应。但是对照牛血清白蛋白组未检测到蛋白与靶细胞的结合。
【具体实施方式】
[0023]实施例1多肽的获得
[0024]根据鹅坦布苏病毒囊膜蛋白E第198位至第280位氨基酸序列，设计多肽，采用人工合成的方法获得，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]实施例2多肽抑制鹅坦布苏病毒感染细胞
[0026]1、按正常细胞培养方法培养BHK - 21细胞至80%饱和水平。[0027]2、将实施例1合成的多肽抑制剂(终浓度分别为5、10、50 μ g/ml)与鹅坦布苏病毒(浓度为200TCID5Q)4°C孵育I小时；对照组采用BSA (终浓度分别为5、10、50 μ g/ml)鹅坦布苏病毒(浓度为200TCID5(I)4°C孵育I小时。
[0028]3、将步骤2中孵育混合物分别接种BHK -21细胞2小时，去掉培养液，用PBS洗涤3次，加入正常细胞培养液，细胞培养72小时，荧光定量RT - PCR检测病毒核酸含量。
[0029]实验结果见图3:对照组(牛血清白蛋白终浓度分别为5、10、50 μ g/ml)病毒核酸相对含量分别为97%、95.9%,96.2%，试验组(实施例1合成的多肽终浓度分别为5、10、50 μ g/ml)病毒核酸相对含量分别为80.6 %、45.1 %、36.6 %，通过与对照组对比分析，加入实施例1合成的多肽的BHK - 21细胞中鹅坦布苏病毒含量下降60%，说明使用本发明多肽能抑制鹅坦布苏病毒感染，使细胞得到很好的保护。
[0030]实施例3多肽抑制剂的体外表达 [0031]人工合成SEQ ID N0.1所示多肽编码基因，在5’端加上EcoR I酶切位点(GAATTC)，3’端加上Sal I酶切位点(GTCGAC)。将合成的基因克隆到蛋白表达载体pET28(a)多克隆位点EcoR I和Sal I位点之间。该多肽的基因序列如SEQ ID N0.3所示，重组的多肽带有6 XHis标签。转化BL21 (DE3)，常规方法培养并诱导表达，通过蛋白表达纯化系统(N1- NTA Superflow Cartridges)按说明书方法纯化得到重组多肽抑制剂。SDS - PAGE电泳检测与预期相一致。采用实施例2的方法进行鹅坦布苏病毒在BHK - 21细胞中的复制的抑制试验，重组多肽的终浓度分别为5、10、50μ g/ml，相应的病毒核酸相对含量分别为76.8%、43.7%、37.2%，结果表明其与直接合成的多肽结果一致。
[0032]实施例4多肽抑制剂抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的机制分析
[0033]为确定观察到的抑制效应是否与多肽竞争性占用病毒受体有关，将多肽与BHK-21细胞4°C孵育lh，PBS洗涤后，用-20°C预冷的丙酮:乙醇溶液(2: 3)室温固定，以多肽免疫小鼠制备的阳性血清为一抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行免疫荧光检测。对照组为牛血清白蛋白与细胞孵育。
[0034]实验结果:本发明多肽可与BHK-21细胞结合，竞争性阻止病毒吸附细胞从而抑制病毒感染(图4)。
【权利要求】
1.一种用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽，其特征在于其氨基酸序列选自SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列或者SEQ ID N0.1所示序列的截短序列，所述的SEQ ID N0.1所示序列的截短序列至少包括SEQ ID N0.2所示序列。
2.根据权利要求1所述的用于抑制鹅坦布苏病毒感染细胞的多肽，其特征在于所述的SEQ ID N0.1所示序列的截短序列如SEQ ID N0.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的多肽的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。
6.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组表达载体在制备抗鹅坦布苏病毒的药物中的应用。
7.一种抗鹅坦布苏病毒的药物组合物，其特征在于包含权利要求1或2所述的多肽。
8.制备权利要求1或2所述多肽的方法，其特征在于通过人工直接合成或通过体外表达获得。
【文档编号】A61P31/14GK103980352SQ201410208557
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】赵冬敏, 李银, 刘宇卓, 黄欣梅, 韩凯凯, 杨婧 申请人:江苏省农业科学院