用于体内组织再生和重建的可注射多孔微载体材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了用于体内组织再生和重建的可注射多孔微载体材料及其制备方法。一种聚多肽可注射多孔微载体材料的制备方法，其特征在于在无致孔剂或添加致孔剂的条件下，通过乳液法制备聚多肽的多孔可注射微载体。其中聚多肽浓度为0.1-1.0wt%，孔径为20-60μm，孔隙率为80-90%。本发明首次提出以合成聚多肽类材料构建多孔可注射微载体。聚多肽可注射微载体用于组织工程领域，能为细胞黏附和增殖提供更好的环境，能实现体内组织再生和重建。
【专利说明】用于体内组织再生和重建的可注射多孔微载体材料及其制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可注射多孔微载体材料及其制备方法，特别是一种用于体内组织 再生和重建的可注射多孔微载体材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 微载体培养技术首先由Van Wezel于1967年提出，是目前国际上公认进行大规模 细胞培养最具发展前途的细胞培养技术。近年来，微载体在组织工程领域也倍受关注。微载 体作为可注射型支架用于组织工程具有一系列优势，包括维持细胞分化表型，免除外科手 术过程，缩小手术创伤和减轻病人痛苦等。制备微载体的材料有天然材料和合成材料。天 然材料有海藻酸钠、琼脂糖、明胶、透明质酸、壳聚糖及胶原等。Chen等用乳液法制备了生 物相容性壳聚糖微载体作为生物材料用于组织工程细胞载体，但是天然材料具有来源批次 不稳定、提取、纯化过程可能受到污染、传播疾病、机械性能差、理化性能不可控等缺点，限 制了其在组织工程中的应用。常用合成材料有聚乳酸及其共聚物、聚己内酯等。Newman等 制备出表面修饰LN同时装载RA的聚乳酸微载体，研究了胚胎癌细胞P19在微载体表面生 长，但此类材料降解产物通常为酸性，容易导致体内局部温度混乱并引发炎症反应。
[0003] 鉴于上述问题，本发明采用结构上类似人体蛋白质，组成上类似细胞外基质的聚 多肽材料作为制备微载体的新型生物材料。聚多肽材料是氨基酸通过肽链连接而成的聚合 物，其在体内能被蛋白分解酶降解成单体氨基酸，降解产物是人体必需物质，安全无毒，且 能被机体吸收。聚多肽材料由于具有良好的生物活性、生物相容性、生物可降解性、高亲水 性、低抗原性或免疫原性等特点，已成为一类具有广阔应用前景的新型生物医用材料。目前 关于这类微载体及其在组织工程领域应用的研究未见报道，本发明尝试制备含聚多肽的多 孔可注射微载体，并用于体内组织再生，实验结果表明，含聚多肽微载体能显著提高细胞黏 附、增殖能力，并能促进体内组织再生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种用于体内组织再生和重建的可注射多孔微载体 材料。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供该微载体材料的制备方法。
[0006] 本发明提出的聚多肽可注射多孔微载体材料的制备方法，是在无致孔剂或添 加致孔剂的条件下，通过乳液法制备聚多肽的多孔可注射微载体。其中聚多肽浓度为 0· 1-1. Owt%，孔径为 20-60 μ m，孔隙率为 80-90%。
[0007] 本发明中聚多肽为人工合成聚氨基酸酯类物质。
[0008] 本发明中提出的聚多肽可注射多孔微载体材料的制备方法，具体步骤如下： 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为0.1-1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌 至PVA完全溶解后，自然冷却至室温，4°预冷； 2. 将聚多肽溶于二氯甲烷中配制浓度为0.1-1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚多肽完全 溶解，得无色透明溶液； 3. 将步骤1所得100 mL预冷PVA溶液置于冰水浴中，搅拌下将步骤2所得20 mL聚多 肽聚合物溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥发，过滤，去离子水洗 涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0009] 本发明通过上述的制备方法得到用于体内组织再生和重建的可注射微载体，该微 载体材料包括聚氨基酸甲酯、聚氨基酸乙酯和聚氨基酸苄酯材料；所述聚多肽材料通过冷 乳液法制备多孔复合微载体；所述多孔复合微载体可作为细胞微载体用于体内组织再生和 重建。
[0010] 本发明的主要优点在于：首次提出以合成聚多肽类材料构建多孔可注射微载体。 微载体具有多孔结构，能负载大量细胞，具有良好的细胞相容性和组织相容性。将聚多肽可 注射微载体用于组织工程领域，能为细胞黏附和增殖提供更好的环境，能实现体内组织再 生和重建。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为聚多肽可注射多孔微载体的扫描电子显微镜照片。如图所示微载体具 有良好球形结构和疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在20-60 μ m和 80-90%。
[0012] 图2为聚多肽可注射多孔微载体上生长的荧光共聚焦图。绿色荧光点表明软骨细 胞在微载体上生产情况。左图为细胞生长1 d的荧光共聚焦图，细胞最先黏附在微载体表 面；右图为细胞生长7 d的荧光共聚焦图，如图所示细胞充满微载体表面和内部。随着接种 培养时间延长，绿色荧光点数目增多，表明软骨细胞随着培养时间延长而增殖。
[0013] 图3为聚多肽可注射多孔微载体用于软骨再生的数码相片。由图可知，经裸鼠皮 下注射并体内培养8周后，形成了具有半透明白色、光滑表面及弹性类软骨组织，组织表面 没有发现大块带血管组织及不正常组织。
【具体实施方式】
[0014] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于体内组织再生和重 建的可注射多孔微载体材料及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的 限制。
[0015] 实施例1 : 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0016] 2.将聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制浓度为1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚氨 基酸甲酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中，搅 拌下将20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥发， 过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0017] 实施例2: 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0018] 2.将聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0.5 wt%的溶液，室温下搅拌至聚 氨基酸甲酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中， 搅拌下将20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥 发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0019] 实施例3: 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0020] 2.将聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0.1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚 氨基酸甲酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中， 搅拌下将20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥 发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0021] 实施例4: 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0022] 2.将聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制浓度为1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚氨 基酸乙酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得100mL预冷PVA溶液置于冰水浴中，搅 拌下将20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥发， 过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0023] 实施例5 : 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0024] 2.将聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0.5 wt%的溶液，室温下搅拌至聚 氨基酸乙酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得100mL预冷PVA溶液置于冰水浴中， 搅拌下将20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥 发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0025] 实施例6 : 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0026] 2.将聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0.1 wt%的溶液，室温下搅拌至 聚氨基酸乙酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得100 mL预冷PVA溶液置于冰水浴 中，搅拌下将20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全 挥发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0027] 实施例7 : 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0028] 2.将聚氨基酸苄酯溶于二氯甲烷中配制浓度为1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚氨 基酸苄酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中，搅 拌下将20mL聚氨基酸苄酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥发， 过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0029] 实施例8 : 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0030] 2.将聚氨基酸苄酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0.5 wt%的溶液，室温下搅拌至聚 氨基酸苄酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中， 搅拌下将20mL聚氨基酸苄酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥 发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0031] 实施例9: 1.将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为1 wt%的溶液，90-95 °C下搅拌至PVA 完全溶解后，自然冷却至室温，4°C预冷。
[0032] 2.将聚氨基酸苄酯溶于二氯甲烷中配制浓度为0. 1 wt%的溶液，室温下搅拌至聚 氨基酸苄酯完全溶解，得无色透明溶液；将步骤1所得l〇〇mL预冷PVA溶液置于冰水浴中， 搅拌下将20mL聚氨基酸苄酯溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥 发，过滤，去离子水洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
[0033] 实施例10 :100 mL培养皿中，5 X 106个软骨细胞与1 mL微球密度进行混合，并加 入含10 mL DMEM的20% FBS。然后，在培养箱中以75 rpm转速振摇培养皿6 h，再加入20 mL培养基转移至37 °C、5% C02、100%饱和湿度培养箱内长期培养，以后隔日更换培养液。
[0034] 实施例11:将多孔微载体与软骨细胞悬液混合，并注射到7 d龄裸鼠皮下。每只 裸鼠背部两边用23号针头注射2次，每次分别含有2 X106个细胞（0.5 mL)与1 mg微载 体的细胞微载体复合物，共注射18只小鼠，八周后，将裸鼠皮下新生成的软骨组织分别用 甲苯胺蓝染色，免疫组织化学染色用于生化分析。
[0035] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种聚多肽可注射多孔微载体材料的制备方法，其特征在于在无致孔剂或添 加致孔剂的条件下，通过乳液法制备聚多肽的多孔可注射微载体；其中聚多肽浓度为 0· 1-1. Owt%，孔径为 20-60 μ m，孔隙率为 80-90%。
2. 根据权利要求1述的聚多肽可注射多孔微载体材料，其特征在于所述的聚多肽为 人工合成聚氨基酸酯类物质，如聚谷氨酸甲酯、乙酯、苄酯等；聚赖氨酸甲酯、乙酯、苄酯等； 聚精氨酸甲酯、乙酯、苄酯等及其它类聚氨基酸酯类。
3. 根据根据权利要求1述的聚多肽聚合物制备多孔微载体的制备方法，其特征在于具 体步骤如下： (1) .将聚乙烯醇（PVA)溶于去离子水配制成浓度为0.1-1. 0 wt%的溶液，90-95 °C下 搅拌至PVA完全溶解后，自然冷却至室温，4 °C预冷； (2) .将聚多肽溶于二氯甲烷中配制浓度为0.1-1. 0 wt%的溶液，室温下搅拌至聚多肽 完全溶解，得无色透明溶液； (3) .将步骤1所得100 mL预冷PVA溶液置于冰水浴中，搅拌下将步骤2所得20mL聚 多肽聚合物溶液快速加入到PVA溶液中，机械搅拌下至二氯甲烷完全挥发，过滤，去离子水 洗涤除去PVA后，即得到多孔微载体。
【文档编号】A61L27/44GK104147645SQ201410210634
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】尹静波, 方建军, 张坤玺, 邹佩云, 崔磊 申请人:上海大学